Summary
זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.
Abstract
כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הידרוג תרבות רכיב תאים מרובה עבור תרבית תאי ריאות במבחנה. החל רקמת ריאה בריאה כמקשה אחת מן חזירי, חולדה או עכבר, הרקמה perfused ו שקוע דטרגנטים כימיים הבאים כדי להסיר את פסולת הסלולר. השוואת היסטולוגית של הרקמה לפני ואחרי עיבוד מאשרת הסרה מעל 95% של מכתים galactosidase דנ"א אלפא גדילים כפול מרמזת רוב פסולת הסלולר מוסר. לאחר decellularization, הרקמה lyophilized ואז cryomilled לאבקה. אבקת מטריקס מתעכלת במשך 48 שעות בתמיסת עיכול פפסין חומצי ולאחר מכן לנטרל כדי ליצור את פתרון pregel. Gelation של פתרון pregel יכול להיגרם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש מייד הנטרול הבא או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. ציפוי יכול להיווצר באמצעות הפתרון pregel על צלחת שאינם מטופלים עבור גמצורף ell. תאים יכולים להיות תלוי pregel לפני הרכבה עצמית כדי להשיג תרבות 3D, מצופה על פני השטח של ג'ל נוצר שממנו התאים יכולים להעביר דרך הפיגום, או מצופים על הציפויים. שינויים אל המתווה שהוצג יכול להשפיע טמפרטורה gelation, כוח, או בגדלים מקטעי חלבון. מעבר היווצרות הידרוג'ל, נוקשות הידרוג'ל ניתן להעלות באמצעות genipin.
Protocol
| פִּתָרוֹן | סינון סטרילי | כיווני |
| DiH 2 O | כן | DiH 2 O; סטרילי מסונן |
| פתרון 0.1% Triton X-100 | כן | מתחת למכסה המנוע קטר להוסיף 100 μl טריטון-X 100 פתרון ל -100 מ"ל DiH 2 O ו להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי. |
| 2% פתרון Deoxycholate | כן | מתחת למכסה המנוע קטר להוסיף פתרון נתרן Deoxycholate 2 g לכל 100 מ"ל DiH 2 O ו להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי |
| 1 M NaCl | כן | הוסף 58.44 גרם NaCl 1 ליטר של DiH 2 O; להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי |
| פתרון DNase | כן | להוסיף 12,000יחידות DNase עד 1 L DiH 2 O; הוסף 0.156 גרם MgSO 4 (נטול מים), ו 0.222 גרם CaCl 2; להתסיס עד שהיא נמסה; סינון סטרילי |
| PBS | כן | שלב 27.2 גרם Na 2 4 HPO · 7H 2 O (dibasic heptahydrate), 80 גרם NaCl, ו -2 גרם KCl עם 10 L DiH 2 O; להתסיס עד שהיא נמסה; כדי להתאים את pH 7.4; סינון סטרילי |
טבלה 1: הפתרונות הנדרשים עבור רקמות Decellularization. הפוך את הפתרונות הנ"ל לתהליך decellularization. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. כ 2.5 L יהיה צורך ריאות חזיריות אחד.
1. גיבוש הידרוג'ל
- בשר חזירים ריאות Decellularization (עיבוד אזכור 9,10)
- השג, ריאה חזירית נורמלית כמקשה אחת, מביית מטבחיים, עם לב vasculature ללא פגע.
- השתמש במספרי רקמות או אזמל כדי לנתח משם בלב, חיתוך כלי דם קרוב ככל האפשר אל הלב, כלי דם נותרים ישמשו בצעדים מאוחר יותר עבור זלוף.
- בזהירות לנתח את הרקמה החיבורית סביב קנה הנשימה, הסמפונות, כלי הדם באמצעות אזמל או מספריים.
הערה: בדוק הריאה הטובה ביותר להשתמש למשך שארית של ההליך על ידי בחירת ריאות ללא חתכים גדולים או דקירות דרך הצדר וכמויות גדולות של תמט הריאות או חסימה בכלי הדם שעלולות לעכב את האפקטיביות של תהליך decellularization. - לחתוך את הריאות לא הטובות עוזב הסמפונות כפי מאוד קשור אליו קנה הנשימה ככל האפשר (לב, רקמת חיבור ואת האונות של הריאה הוסרה עלול להיות מסולק). לא צריך להיות ריאה אחת נותרים מצורפות קנה נשימת כלי הדם.
הערה: שמור חלקים עבור היסטולוגיה אם תרצה בכך. 9 - סגור הסמפונות מנותקים עם מהדק או תפר pbackflow העודף יימנע.
- הכן את הפתרונות decellularization ושומרים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך (טבלה 1).
- באמצעות משאבת יד cannulated כדי להתאים את עורק הריאה, perfuse רקמת הריאה 3 פעמים עם מים די דרך הן עורק קנה נשימה ריאתי. Perfuse כלי הדם ראשון בכל פעם. בגין עם כ 1 ליטר לתוך כלי הדם ו -1.5 L לתוך קנה הנשימה עבור כל זלוף, אבל כמו פסולת הסלולר מוסר יותר נוזלי ניתן perfused דרך המערכת.
- Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון טריטון X-100.
- לצלול רקמת הריאה ב Triton X-100 הפתרון למשך 24 שעות ב 4 ° C..
- Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף.
- Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון deoxycholate.
- להטביע את קטעי רקמה ב deoxycholate למשך 24 שעות ב 4 ° C..
- Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף.
- Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון NaCl.
- לצלול רקמות בתמיסה מסוננת NaCl עבור שעה 1 ב 4 ° C..
- Perfuse כלי הדם ואת קנה הנשימה 3 פעמים עם DI מים כדי לשטוף.
- Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה עם פתרון DNase.
- לצלול רקמות בתמיסה DNase מסונן עבור שעה 1 ב 4 ° C..
- Perfuse הן כלי הדם ואת קנה הנשימה 5 פעמים עם PBS.
- משם לנתח רקמות סחוס מורגשות, קנה נשימה וכל tubules 2 מ"מ או גדול בקוטר (נמצא בעיקר סביב hilum מנות המדיאלי של הריאות) מעריכת דרך נשימה, עוזבת אזורי נשימה בלבד (בפריפריה בעיקר).
- לנתח רקמה לתוך 1 סעיפי אינץ או קטנים יותר. כיווניות של הרקמה לא משנה בשלב זה.
- יוצקים את רקמות נוזלי במקום עודף 50 מ"ל צינורות חרוטי. להקפיא את הרקמה ב -80 ° C.
הערה: שמור חלקים עבור היסטולוגיה כדי להבטיח הסרה של תאים debri הסלולרהים, אם תרצה בכך. אנו משתמשים H & E, α-galactosidase, PicoGreen, hydroxyproline, ninhydrin, כחול, SDS-PAGE alcian, ו ספקטרומטריית מסה לאפיין. 9
- עיבוד ריאות
- הסר מכסים משפופרות קפוא המכיל רקמת הריאה decellularized.
- מניחים נייר הסינון על פתיחת צינור ומאובטח עם גומייה.
הערה: Tube ותכנים עדיין צריך להיות קפוא אחרת למקם -80 ° C עד קפוא. - Lyophilize הרקמה עד שכל הנוזלים העודפים נעלם, בעזרת מייבש להקפיא לפי ההוראות של היצרן. חנות ב -80 ° C עד מוכן הטחנה.
- לפני התחילה להוסיף חנקן נוזלי כדי טחנה במקפיא כדי לקרר בידוד רכיבים פנימיים תנאי עבודה.
- סר בר טחנת מגנטים מצינור טחנה ולהוסיף רקמות כדי לכסות תחתון.
- חלף בר טחן ולהוסיף רקמות ארוזות בצורה רופפת. בר הטחנה עדיין צריך לנוע בחופשיות.
- סגור את צינור הטחנה ו- PLAce ב טחנה במקפיא.
- מלאו חנקן נוזלי כדי לקו מילוי מקסימום.
- מקפיא טחנת כל רקמות לאבקה בסדר (כ 5 דק ', שיעור impaction של ~ 600 דקות -1), בתוך גליל פוליקרבונט עם impactor נירוסטה וכן אטמי סוף נירוסטה באמצעות טחנת במקפיא לפי ההוראות של היצרן. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשימוש.
- מיקרו-נקבובי היווצרות קריש (8 מ"ג / מ"ל) (מותאם מ אזכור 9,11)
- הוסף 1% (w / v) של אבקת decellularized ו -0.1% (w / v) של פפסין 0.01 M HCl, תחת תסיסה מתמדת (אמור להיות מסוגל לראות זרימה ברמה העליונה של נוזל), בטמפרטורת החדר, עבור 48 שעות.
הערה: האבקה טעונה באופן סטטי, כך הוספת HCl לאחר האבקה מעניקה את ההזדמנות לשטוף את העודף מקירות הצינור. - לאחר העיכול של 48 שעות, במקום פתרון ריאגנטים על קרח למשך 5 דקות.
- באמצעות% 10 בקירור (v / v) 0.1 M NaOH, גידולד 11.11% (v / v) 10x PBS (להביא את הפתרון כולו 1x ריכוז), להביא את הפתרון חלבון מתעכל ל- pH הפיזיולוגי של 7.4.
הערה: הפתרון כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. בצע קינטיקה gelation באמצעות rheometry 9 אם תרצה בכך.
- הוסף 1% (w / v) של אבקת decellularized ו -0.1% (w / v) של פפסין 0.01 M HCl, תחת תסיסה מתמדת (אמור להיות מסוגל לראות זרימה ברמה העליונה של נוזל), בטמפרטורת החדר, עבור 48 שעות.
2. Cross-linking הידרוג כדי לשפר את חוזק מכני
- פתרונות של 1%, 0.1%, ו 0.01% w / פתרון crosslinking נ genipin הוכנו על ידי המסת את הסכום הדרוש של אבקת genipin ב 10% DMSO.
- הפתרון וורטקס כל 15 דקות במשך שעה 1.
- הוסף פתרון genipin לכסות הידרוג ECM (100 μL לכל גם צלחת 96-היטב) כי הורכבו בעבר חלק 1.3.4.
- השאירו כל הידרוג'ל ECM כדי crosslink למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- שוטף את הידרוג ECM 3 פעמים עם PBS עד פתרון הכביסה כבר לא כחול. הידרוג crosslinked לאחר מכן ניתן יהיה מוכן אפיון נוסף ו- CEלימודי התרבות השני של השנה.
3. תרבית תאים עם Microporous ג'ל
- ציפוי דו מימדי
- השימוש בפתרון מ 1.3.3, להוסיף 20 μl של פתרון pregel היטב בכל צלחת תרבות 96-היטב שאינם מטופלים רקמות.
- לילה במקרר ב 4 ° C כדי לאפשר חלבון ספיחה לצלחת.
- לשאוב pregel הפתרון ולשטוף עם PBS.
- מעבר תאים 9.
- להוסיף 10,000 תאים / 2 ס"מ לבארות.
- גדל תקשורת 100 μl לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס.
- שלוש תרבית תאים ממדית 9
- באמצעות פתרון מ 1.3.3, resuspend התאים pelleted לריכוז של 1,000,000 תאים / מ"ל של תמיסת pregel.
- במהירות לוותר 16 μl של השעיה pregel תאים לבאר כל צלחת 96-היטב, כדי ליצור ~ 500 מיקרומטר הידרוג'ל עבה עבור תרבית תאים 3D.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30דקות עבור הג'ל על מנת ליצור.
- הוספת 100 μl של התקשורת לראש הידרוג נוצר לדגור על 37 מעלות צלזיוס.
- שלוש תרבית תאי ממדים על ג'לים קשיחות משתנה
- באמצעות פתרון מ 1.3.3, פיפטה 100 μl של פתרון pregel לבאר כל צלחת 96-היטב.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עבור הג'ל על מנת ליצור.
הערה: Cross-linking צעדים מחלק 2 ניתן להשתמש כאן. - מעבר תאים 9.
- להוסיף 10,000 תאים / 2 ס"מ לבארות.
- גדל תקשורת 100 μl לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות שיטה זו, הפקנו הידרוג מן החזיר רגיל, חולדה, וריאות עכבר (איור 1). ריאות מעובד לספק מוערכת של 5 מ"ג, 40 מ"ג, ו -10 גרם של אבקת ECM בהתאמה. סקירה כללית של התהליך מוצג באיור 2. חזותי מפתח בתהליך כולל: מראה לבן של הריאות אחרי שטיפת deoxycholate; לאחר היווצרות pregel, הפתרון צריך להיות אטום הפתרון אמור להופיע הומוגנית במשך חודשים אם מאוחסן ב 4 ° C.. כללנו שולחן תקלות בסיסי שיעזרו לזהות מקורות השגיאה לאורך כל התהליך (טבלה 2). לאחר gelling, הידרוג ניתן להשתמש מיד או מאוחסן לשימוש עתידי. בדיקות ראולוגיות מאשרות כי למעלה מ 90% של gelling מתרחשים בדקות הראשונות לאחר שהגיע 37 ° C (איור 3). הידרוג נוצר יציב במשך תקופות ארוכות PBS, אבל מצורף תא proliferation עשוי להשתנות (איור 4).
בעוד פרוטוקול זה נכתב עבור ריאות חזיריות, מגבלות מקום להגביל אותנו להשתמש רק ריאה אחת כאשר decellularizing ריאות חזיר. השתמשנו באותו הליך עם שינוי מזערי decellularize בשתי הריאות עבור מינים אחרים. לחולדות ועכברים, הריאות יכולות להיות שלמות שמאל והלב מצורף, אבל רקמת החיבור עדיין יש להסיר עם אזמל או מספריים. אנחנו שומרים בלב שלם המצורפת לחולדות ועכברים perfuse הפתרונות דרך החדר הימני במקום עורק הריאה. זלוף של קנה הנשימה הוא עדיין אותו; עם זאת, את הצינורית ניתן לצורך איחוי בתוך קנה הנשימה כדי להקל על הגישה עבור מינים קטנים יותר.
הוספנו סוגי תאים מרובים, אדם בתאי גזע mesenchymal, 9 תאי גזע עכבר mesenchymal, שורות תאים אנושיות אפיתל (A549s), אנדו כלי דם העיקרי אדםתאים thelial (HpuVECs), ותאי אפיתל וריד אדם הטבור (HUVECs) בתוך ועל פני השטח של הידרוג ECM ריאות. לא נתקלנו בבעיות בנוגע לאופי xenogenic של הג'לים נוצר. העבודה הקודמת שלנו הוכיחה הפחתה משמעותית-galactosidase α ב הידרוג החזירי. 9 הפתרון מראש ג'ל עשוי לשמש גם כציפוי על 4 מעלות צלזיוס כדי לשפר מצורף התא. הפתרון pregel משפר מצורף HpuVEC ושגשוגם כאשר הוסיף ריאות ECM מצופה צלחות בתרבית רקמה. בארות מצופות להפגין שיפור משמעותי מצורפות הסלולר לעומת בארות שאינם מטופלים (איור 5).
הוספת genipin מגביר crosslinking הידרוג'ל. crosslinking המוגברת זו עשויה לספק קשיחות רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית, תוך שהיא מפחיתה שפלה של ECM. הקיטון שפל, אם כי קטין במבחנה, עלול להתרחש בשל מליטה גדלה ביןחלבונים ולכן התנגדות יותר שיפוץ ECM על ידי תאים. השתמשנו מטאטא תדירות על rheometer למדוד את התכונות המכאניות של הידרוג'ל crosslinked. קשיחות הידרוג'ל נמצאה בקורלציה ישירות genipin ריכוז עם החציון ולהיות ריכוז הרלוונטי ביותר 0.01% (איור 6, רקמות ילידים לא מוצגות). ב assay MTT שימש לכמת תא התפשטות והישרדות על הידרוג'ל crosslinked. התפשטות תאים גבוהה על הידרוג'ל crosslinked (איור 7). זו תומכת התפשטות תאים מוגברת על קשיחות מוגברת מאחרים. 12 משתנה genipin crosslinking בזמן או בטמפרטורה עלול לגרום מעלות crosslinking שונות.
איור 1: תמונות של ריאות אנחנו האם decellularized. תמונות מ- (A) עכבר ריאות לאחר decellularization ולב מוסר, (ב) חולדה לאחר טריטון X-100 שטוף משם, (C) חזיר, לפני שטיפה ראשונית; הם להניב ~ 5 מ"ג, 40 מ"ג, ו -10 גרם של ריאות ECM, בהתאמה. (ד) עכבר ריאות ולב שלם, לאחר decellularization, עם צינורית עדיין לצורך איחוי במקום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: סקירה כללית של שיטות. זוהי סקירה של השיטה לייצר הידרוג מהריאות. החל en decellularization ריאות חזיר הגוש מתרחש עוזב רקמות לבנות או שקופות אטום היחיד מורכבת של חלבוני ECM. אז לאחר הסרת כל מים נותרים, והגדלת שטח הפנים כדי לייעל את עיכול חומצת הרקמה solubilized. ניטרול של acid והגדיל המלח לרמות פיסיולוגיות יוצרת פתרון pregel המוכן gelation. לאחר הפתרון יוצר הידרוג'ל על 37 מעלות צלזיוס, אפיון מתרחש עם במיקרוסקופ אלקטרוני ג'ל rheometer וסריקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נציג ראולוגיות נתונים עבור gelation תחת ramping טמפרטורה. לאחר לטאטא משרעת ראשונית לקבוע טווח viscoelastic ליניארי, רמפת טמפרטורה שמשה כדי לקבוע קינטיקה gelation. הנתונים מוצגים כממוצע +/- סטיית התקן. n = 4.
איור 4: יציבות לטווח ארוך. הודעה מיידיתגיל של הידרוג'ל ECM ריאות חזיר מאוחסן PBS במשך 6 חודשים בטמפרטורת החדר.
איור 5: Metabolic Assay של HpuVECs. נתוני התפשטות MTT מתאי אנדותל העיקריים כלי דם אנושיים (HpuVECs) גדלו על צלחות תרבית רקמה שאינן מטופלים. פתרון Pregel מ 1.3.3 התווסף צלחות, בקירור למשך הלילה ושטף כדי ליצור צלחות ריאות מראש ג'ל מצופות ECM. HpuVECs הראה פעילות MTT גבוהה על צלחות מצופות ECM בהשוואה ללא-מצופה. * P <0.05 לעומת שליטה. הנתונים הם ממוצע ± סטיית תקן n = 3 לכל קבוצה.
איור 6: ראולוגיות נתונים עבור Crosslinking משופרת. נתוני Rheometry עבור crosslinking genipin. העליות הנוקשות עם ריכוזי מוגבר GENIלהצמיד רמה ב -1% genipin. הנתונים מנורמלים מצביע על עלייה של פי crosslinking עם genipin.
איור 7; התפשטות תאים על ג'לים Genipin Crosslinked. נתוני MTT מנורמלים עבור A549s על הידרוג crosslinked genipin. התפשטות תאים מוגברת לראות עם קשיחות מוגברת. p <0.05 לעומת שליטה. הנתונים הם ממוצע ± סטיית תקן. n = 3 לכל קבוצה.
| בְּעָיָה | נושא | רזולוציה |
| צבע אדום / ורוד נשמר לאחר decellularization | decellularization יעיל | התחל מחדש עם ריאות חדשות |
| סר תחום decellularization השלם </ Td> | ||
| חסימה של כלי דם | התחל מחדש עם ריאות חדשות | |
| סר תחומים decellularization השלם | ||
| פסולת הסלולר משמעותית שמר | decellularization יעיל | התחל מחדש עם ריאות חדשות |
| סר תחומים decellularization השלם | ||
| חסימה של כלי דם | התחל מחדש עם ריאות חדשות | |
| סר תחומים decellularization השלם | ||
| תמט ריאות | התחל מחדש עם ריאות חדשות | |
| סר תחומים decellularization השלם | ||
| הרס של ממברנות שנמצאו בדגימות היסטולוגית | שמירת לחץ-Over של כלי במהלך זלוף | להפחית לחץ זלוףדטרגנטים |
| חלקיקים גדולים נשארו לאחר טחינה | חומר lyophilized מדי בצינור | מנמיכים חומר שחיקה גליל |
| לא הסתובבתי במשך זמן מספיק | להגדיל את זמן הטחינה | |
| פתרון Pregel לא gelling | pH פתרון גבוה מדי | הפוך 7.4 pH |
| בגין פתרון pregel עם אבקה טריה | ||
| pH פתרון נמוך מדי | הפוך 7.4 pH | |
| בגין פתרון pregel עם אבקה טריה | ||
| ECM מעל מתעכל | בגין פתרון pregel עם אבקה טריה | |
| תאים אינם שורדים | חיידקים הציגו לאחר עיכול HCl | להתחיל מחדש עם אבקה טריה ולהשתמש בפתרונות סינון סטרילי |
| pH off | בגין פתרון pregel שוב | |
| הפוך 7.4 pH | ||
| תאי פרץ | תקן תוכן מלח בתמיסה pregel |
טבלה 2: פתרון בעיות כדי לזהות מקורות של שגיאה פוטנציאלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד ההיבטים של ביולוגיה הנפרדים הוא הארגון-העצמי של מולקולות לתוך מבנים היררכיים לבצע משימה ספציפית. 13 במעבדה, הרכבה עצמית תלויה בגורמים רבים כגון ריכוז מלח, pH, ומשך העיכול. כפי שניתן לראות, נוצר הידרוג'ל מתארגנת מעצמה כאשר חלבונים solubilized לחזור לטמפרטורה פיזיולוגית. הידרוג נוצר מסוגל לקדם מצורף הסלולר ושגשוגם במבחנה.
תגובה תאית לאותות biophysical מ ECM לא ניתן לחקור באמצעות פולימרים. בתגובת רקמות הסלולר ספציפית אותות ביו-לא ניתן נחקרת על ידי שימוש ברקמות אחרות. חוקרים וקלינאים התחדשות מאמינים באמצעות פיגומים decellularized משפר התחדשות רקמות וריפוי פצעים. הסובל ממחלת ריאות כרונית צריכים שיפורים טיפוליים להגדיל זמינות איברים להקטין חיסוני. איברי אינטראקציות ספציפיות, התא-ECM חייבות להיותמחקר לביולוגיה איבר נוסף.
ECM שימוש כמו פיגום תא לתאי ריאה הראה תוצאות עקביות. 14,15 שימוש פרוסות ריאה ממודלים חולים מעודד התחדשות מחלה 16 תאי גזע או אב, נמצאים ריאות דיסטלי, 17,18 ודורש נישות מיוחדות כדי למנוע היווצרות של teratomas. באמצעות ECM רקמות ספציפי כרכב משלוח, תופעות התחדשות של תאי אב עשויות להיות מוגברות. הידרוג ECM יוצר סביבה החלימה יותר להעריך תגובות הסלולר מטריצה חוץ-תאי.
גוף גדול של מחקר קיים הסתכלות נוקשות בכל הקשור איתות הסלולר. השיטה שלנו של crosslinking genipin לאפשר נוקשות התא איתות וכן אינטראקציות מרכיב התא ECM. בעוד נוקשות הידרוג'ל ניתן להשפיע על ידי ECM סכום ואת היחס של חלבונים, השימוש genipin מאפשר שינויים נוקשים הידרוג'ל מעט עצמאיים של תוכן ECM. התאמת genריכוז epin עשוי לאפשר כוונון מדויק של תכונות מכאניות לרוב דומה ריאות טבעיות רקמות 6. מנתונים genipin שהושגו באמצעות הידרוג מן הריאות היקפיות במחקר הנוכחי, עלייה של 15 פי (מ -5 Pa 75 Pa) צוינה. בהתבסס על נתוני rheological של רקמת ריאת עכברוש נורמלית ביופסיה אשר decellularized באמצעות אותן השיטות, אנחנו יכולים להשיג קשיחות רקמת ריאה היקפית משוערת (מידע לא מוצג) על ידי הוספת 1% genipin כדי הידרוג ריאות היקפי או הוספת 0.01% הידרוג ריאות כולו (משוער ). באמצעות ECM הריאות ההיקפי מורכב parenchyma ריאות עשויות ג'ל משמעותי רך לעומת תוצאות הידרוג'ל ECM הריאות כולו שפורסמו בעבר שלנו 7. לכן בנוסף genipin, בחירת אזורים ספציפיים של רקמת הריאה כדי decellularize יכול להשפיע על נוקשות באופן דרמטי.
ישנן הזדמנויות לשפר שיטה זו, אשר עשויה לכלול צעדים נוספים נפוצים perfusiעל decellularization של רקמת הריאה כולה. שיטה זו נעשתה שימוש על רקמת ריאה נורמלית עשוי לדרוש שינוי עבור decellularization של ריאות חולות. אנחנו עדיין לא בחנו את התהליך הזה במדינות מחלה ספציפיות. אנו משיגים הריאות שלנו שנשלחו על קרח בן לילה מבית מטבחיים. שיטה זו יכולה להגביל את היעילות של התהליך שלנו בשל תמט ריאות או חסימה של כלי דם; עם זאת, אנו כמעט ולא צריכים להסיר תחומי ריאות שלא היה decellularized ביסודיות. כאשר קבלת רקמת הריאה טרי, היינו ממליצים לבצע את כל הפתרונות הנדרשים לפני שקיבל את הריאות כדי למנוע הפסקות שום עיבוד רקמות. מחקר קודם מצא כי באמצעות חומצה peracetic כצעד עיקור סופי מטריקס ייצור גורם פנוטיפ מקרופאג M1 רגנרציה שחדר תאים חיסוניים, 19 פוטנציאל לשיפור ההשפעות proregenerative של רקמות decellularized. מחקרים אחרים הושקעו באמצעות ודטרגנטים אחרים כדי להשלים את התהליך, אבל אלה appear להיות העדפות ספציפיות מעבדה עם בסופו של דבר אותה ההשפעה על decellularization. הליך decellularization וצעדי עיכול עשויים להיות מותאמים בהתאם ליישום הספציפי של החוקר. לדוגמה, לשנות את שיטות ג'ל העיכול זמן או נטרולם עשוי לשנות את הרכב החלבון, תכונות מכניות, או קינטיקה gelation.
חלופות לשיטה דנה כאן יכולות להשתנות רמת המורכבות בהתאם לתוצאות ניסוי רצויות. לדוגמה, אם המטרה היתה לשמור על קרום במרתף ללא פגע ככל האפשר, משאבה זלוף עם בקרת לחץ מוגבלת עלולה להפחית נזק המכשול. בנוסף, אם הייתה אחד התקנה במעבדה זמינה לשמור בשתי ריאות תילן מינים גדולים, תהליך decellularization עשוי לשפר את היעילות. לעומת זאת, יד שחיקה טכניקה עם ובמכתש ניתן להחיל את הרקמה lyophilized עבור מעבדות אשר אין cryomill. היינו מצפים grindin ידg לייצר שברים גדולים, הגבלת השטח הזמין עבור עיכול החומצה ולכן פעמי העיכול ייתכן שתהיינה צורך לשנות במקרה זה.
חלופות אינן מוגבלות צעדי decellularization ההיווצרות של הידרוג'ל. Gluteraldehyde נוצל בעבר בתור crosslinker עבור הידרוג'ל, מתן חלופה אפשרית אחת להגדלת החוזק המכאני של הידרוג ביולוגי המשמש במערכות מודל. מערכות מודל אחרות כוללות ריאות decellularized שלמים כמערכת תרבות במבחנת 3D, או יותר נפוצה מסתכלות פרוסות ריאה כמודל 3D ב פיגום במבחנה. 20 כבר הזכרנו את המגבלות שמגיעות מעבודה עם פיגומי פולימר וכן פיגומי רכיב בודדים, אך אלה נשארים כפי חלופות אפשריות הנוהל שהוצג כאן. בנוסף, ישנן שיטות חלופיות לקביעת יעילות decellularization (כגון בידוד DNA), gelation (ניתן להשתמש מבחני עכירות), וכן מצורף תאהתפשטות nd (כגון שימוש CCK8). מצאנו כי השיטות שתוארו כאן הן יותר מאשר מספיק כדי לאפיין הידרוג לשימוש כמו פיגומי 3D המודל.
הידרוג ECM ריאות נתאר כאן לספק פלטפורמה יעילה ללימוד אינטראקציות תא-ECM. פתרון pregel בעלת פוטנציאל כמו ציפוי עבור ספקי סמי פולימר, בסיוע משלוח בתאי גזע mesenchymal, או כפלטפורמת משלוח סמים על ידי עצמו. הפרוטוקול המובא בזאת מספק את הצעדים הבסיסיים ליצירת הידרוג'ל צדדי נגזר ECM ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות חוות סמית'פילד על תרומת רקמת הריאה החזירית ללא פגע. אנו רוצים גם להודות לד"ר הו יאנג, ד"ר כריסטינה טאנג והמחלקה לכירורגיה פלסטית VCU עבור ומאפשר לנו להשתמש בציוד שלהם. דגימות הידרוג'ל ורקמות הוכנו עבור SEM במחלקה לאנטומיה VCU מתקן מיקרוסקופית לנוירוביולוגיה נתמך, בין השאר, על ידי מימון NIH-NINDS מרכז Core גרנט 5 P30 NS047463 ו, בין השאר, על ידי טופס מימון גרנט תמיכה במרכז לחקר הסרטן NIH-NCI CA016059 P30. הדמיה SEM של דגימות במתקן אפיון Core ננוטכנולוגיה VCU (NCC). עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע, CMMI 1,351,162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
- Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
- Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
- Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
- Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
- Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
- Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
- Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
- Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
