Summary
Модель уха безволосой SKH1-Hr ч мыши позволяет прижизненную флуоресцентную микроскопию микроциркуляции и фототоксической индукции тромба без предварительного хирургического препарата в исследуемом микрососудистом русле. Таким образом, ухо безволосой мыши является отличным в естественных условиях модели для изучения сложных взаимодействий в процессе образования тромба, микрососудистой эволюции тромба, и тромболизис.
Abstract
Тромботический осложнения сосудистых заболеваний являются одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в промышленно развитых странах. Из - за сложные взаимодействия между клеточными и не-клеточными компонентами крови во время образования тромба, надежные исследования физиологии и патофизиологии тромбоза могут быть выполнены только в естественных условиях. Таким образом, эта статья представляет собой модель уха в безволосых мышей и фокусируется на анализе в естественных условиях микроциркуляции, образования тромбов и развития тромбов. С помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии и внутривенного (IV) применения соответствующих флуоресцентных красителей, повторяющийся анализ микроциркуляции в предсердии легко может быть выполнен без необходимости хирургической подготовки. Кроме того, эта модель может быть адаптирована для исследований в естественных условиях различных проблем, включая заживление ран, реперфузионного повреждения, или ангиогенеза. Таким образом, ухо безволосых мышей является идеальной моделью для в ЛьвовО исследовании микроциркуляции кожи в физиологических или патофизиологических условиях и для оценки его реакции на различное системное или местное лечение.
Introduction
Целью данной статьи является описание методики прижизненной микроскопии, приложенной к ушной раковине безволосой мыши для прямого наблюдения и анализа микроциркуляции, образования тромбов и эволюции тромба. При скорости падения 1 в 1000, венозный тромбоз по-прежнему является частой причиной заболеваемости. Несмотря на то, диагностика, профилактика, стратегии и методы лечения были разработаны в последние годы, одна треть венозного тромбоза проявляется как эмболии легочной артерии 1. Артериальный тромбоз играет важную роль в сердечно-сосудистых заболеваниях, которые являются наиболее частой причиной смерти в промышленно развитых странах. Артериальный тромбоз на основе разрыва атеросклеротических бляшек участвуют в инфарктах, мезентериальных инфарктах и апоплексии. Каждая операция предоставляет субэндотелиальную структуру для компонентов крови, изменяет динамику кровотока и удерживающая пациента. В эндопротезе хирургии нижних конечностей, органы тransplantation и тромбоз лоскута хирургии являются частыми причинами осложнений. тромбоз микрососудов, в частности, часто приводит к необратимым повреждениям, из-за отсутствия клинических симптомов. Точно так же, микрососудистых тромбозов играет решающую правило в нескольких заболеваний, в том числе тромботической тромбоцитопенической пурпуры, сепсис, диссеминированного внутрисосудистого свертывания, антифосфолипидного синдрома и хронической венозной недостаточности, среди других.
Несколько новых препаратов для лечения и профилактики тромбоза были разработаны в последние годы, но антиагреганты и антикоагулянты до сих пор имеют побочные эффекты, отсутствие антагонистов, и имеют длительные эффекты продолжительности. Эти недостатки приводят к проблемам в неотложной медицинской помощи. Таким образом, необходимы дополнительные исследования, чтобы раскрыть сложные процессы , которые происходят во время тромбоза, что вряд ли может быть смоделировано в лабораторных условиях .
Голая SKH1-Hr час мыши была обнаружена в 1926 году в зоопарке в Лондоне.Из-за генный дефект на хромосоме 14, животное теряет шерсть после постнатального дня 10. Это делает хорошо кровоснабжение предсердия доступного для прижизненной микроскопии сосудов. Средняя толщина уха составляет 300 мкм. Она состоит из двух слоев дермы, которые отделены друг от друга хряща. На выпуклой спинной стороне хряща, 3 сосудистых пучков ввести мочку. Апикальные сосудистые дуги и базальные шунты соединяют три пачки. Венул имеют диаметры в диапазоне от 200 мкм (базальной) и 10 мкм (апикальный). Мелкоячеистые капилляры окружают пустые фолликулы волосы 2. Анатомия голой SKH1-Hr часа мышей делает предсердие мощной и экономически эффективной модель для исследования тромбоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты в естественных условиях (7221.3-1-006 / 15) были проведены в соответствии с немецким законодательством о защите животных и Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных животных ресурсов, Национальный исследовательский совет).
1. Общие Keeping животных
- Выполните эксперименты с самцам мышей ч SKH1-Hr в возрасте от 4 до 6 недель. Использование животных с весом от 20 до 25 г.
- Хранить животное в патогена объекта и в стандартных условиях от 24 до 26 ° C и примерно 60% относительной влажности, с устойчивым доступом к воде и пищи неограниченных объявлений.
- Продолжайте до пяти самцов животных в одной клетке. Обеспечить подстилку и обогащение материала во корпусе животных для их благополучия.
2. предварительная договоренность о животных
- Взвесь мышь и загрузить соответствующее лекарственное средство (например, каннабиноиды, 5 мг / кг веса тела (м.т.)) в шприц инсулина. Администрирование препарат за 30 мин до индукции тромба.
- Удерживая шею мыши между большим пальцем и указательным пальцем и хвостовой частью мыши с мизинцем, растянуть животное и вводят лекарственное средство внутрибрюшинно (IP) в левый нижний квадрант живота. Положите животное обратно в клетку в течение 15 мин.
- Подготовка анестезии кетамином (90 мг / кг м.т.) и ксилазина (25 мг / кг веса тела). 15 мин до индукции тромба, анестезию мыши. Поместите мышь в клетке, слегка потянуть за хвост и впрыснуть анестетиков внутрибрюшинно инсулиновый шприц.
- Положите мышь обратно в клетку до начала анестезии. Для проверки достаточной анестезии, зажать хвост с пинцетом.
- Нагрузка 0,05 мл размороженной флуоресцеина изотиоцианат-меченого декстрана (FITC-декстрана, 5%, 150 кДа) в инсулиновый шприц. При заполнении шприца, убедитесь, что пузырьки воздуха не остаются, потому что даже небольшой intravenouslу (IV) -administered пузырьки воздуха могут привести к летальному исходу для животного.
- Поместите наркозом мыши на нагревательной пластине в положении лицом вниз. Регулировка нагрева пластины до 37 ° C.
- Поместите глазную мазь на роговице мыши. Дезинфекция кожи и использовать стерильные инструменты.
- Вышивание две шовных материалов из полипропилена 7/0 в краниальный и каудальный край правого уха. Поместите стежки как можно ближе к краю , и как проксимально к основанию , насколько возможно (фиг.).
- Сдвиг мыши дорсальной позиции. Закрепить все ноги на платформу acrylglass с помощью скотча. Крюк шовного материала под передними зубами и поместите голову в сгибание, придерживаясь шовного материала к acrylglass с клейкими полосками.
- Транслоцироваться животное на платформе под стереоскопическим операции. Используйте 16X увеличение.
3. Подготовка левой яремной вены и инжекции FITC-декстрана
Примечание: Для микрофонаroscopy правого уха, подготовить левую яремную вену.
- Используя скальпель, создать 5-мм разрез в коже на левой стороне шеи в кранио-каудальном направлении. Проанализируйте подкожную ткань с microforceps и microscissors. Либо перевязать сосуды пересечения с полиэфирной 8/0 швами или с электрокоагуляции.
- Освободить вены от его адвентиции с помощью microforceps и microscissors, не касаясь судна.
- Используйте подготовленный инсулиновый шприц для инъекции флуоресцентного красителя. Осторожно возьмите стенку сосуда с microforceps, без прокалывания вены. Проникнуть Надуваемые стенки сосуда с шприц и вводят FITC-декстран внутривенно.
- Остановить кровотечение после снятия шприца с помощью ватного тампона. Избегайте крови и окрасить загрязнение уха.
4. Позиционирование правого уха прижизненной флуоресцентной микроскопии
- Передача животное на нагревательной плите до acrylglass сonstruction с прорезью для нагревательной плиты и 0,5 см высоты плоскости для позиционирования уха.
- Закрепить животных лицевой стороной вниз на нагревательной пластине с помощью скотча. Поместите относительно сильный и выпуклого хряща у основания уха рядом с 0,5 см высоты плоскости для уха (рис 1B) , так что апикальная часть уха может быть расположена на плоской плоскости.
- Добавьте одну каплю при комнатной температуре 0,9% NaCl в acrylglass плоскости для того, чтобы расположить ухо. Поместите правое ухо, с заранее подготовленные швы на вогнутой вентральной стороне, обращенной вниз, на каплю 0,9% NaCl. Используя ватные тампоны, впитывать капли NaCl и пусть капиллярные силы прикрепить плоскость уха к acrylglass.
- Лента швы на acrylglass, чтобы зафиксировать положение уха.
- Добавьте одну каплю 0,9% NaCl при комнатной температуре к выпуклой спинной стороне уха. Осторожно положить одну покровные (0,5 см диаметра) на ухе, не сжимая базальные сосуды, входящих тысе ухо. Используя ватные тампоны, удалить как можно больше NaCl, как это возможно из-под покровным, чтобы минимизировать расстояние между покровным и целевым ухом сосудами.
5. витальных флуоресцентной микроскопией и тромбов Индукционная правого уха
- Регулировка прижизненной флуоресцентного микроскопа для FITC-декстран визуализации (450 - 490 нм; FT: 510; LP: 520). Используйте переменную 100 Вт ртутной лампы в качестве источника света. Подключение высокого разрешения, черно-белая ПЗС-камеры на DVD-рекордер.
- Передача животных на acrylglass, содержащей нагревательную пластину с фиксированным похищены ухом к столу прижизненного флуоресцентного микроскопа.
- Используя 20X увеличение (20X / 0.95 числовой апертуры) и интенсивность света 20%, поиск венозного сосуда 50 - 60 мкм в диаметре и с антероградным кровотоком 400 - 600 мкм / с.
- Добавьте одну капли воды комнатной температуры на покровный для воды погружения 63x magnificatioп цель (63X / 0.95 числовой апертуры). Используйте шприц с канюлей диаметром 1 мм и поместите каплю на цели микроскопа. Добавить достаточно воды, чтобы связаться с покровным и целью с каплей воды.
- Сразу же после нанесения капли воды, начать запись судна в течение 20 с 20% -ной интенсивности света для измерения в автономном режиме потока диаметра и крови.
- Начало тромба индукции через 5 мин после инъекции FITC-декстрана. С этой целью повысить интенсивность света до 100%.
- Во время индукции тромба, закрыть отверстие микроскопа в течение 2 с в течение 30-х лет, чтобы проверить поток крови. В случае возникновения кровотока, откройте диафрагму снова. В случае остановленного потока крови, наблюдать за судном в течение 30 сек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Судно классифицируется как окклюзировано если поток замирает в течение 30 секунд или более, или если кровь течет ретроградно. Если прямоходящий поток крови начинается снова, полностью открыть диафрагму и Contin ие индукции тромба до окклюзии сосуда происходит, как описано выше. Во время ранней индукции тромба, гарантировать, что время, когда отверстие было закрыто, чтобы проверить поток крови как можно короче, чтобы поддерживать почти непрерывный эпи-освещение. Позже, во время роста тромба, судно перфузии с меньшим флуоресцентным красителем, так что можно наблюдать непрерывно. - Выбор и закупорить 5 судов в ухо. Ограничение времени индукции тромба под микроскопом приблизительно 1 ч после инъекции FITC-декстрана.
6. Последующая деятельность
- Выполните закрытие раны шеи с помощью чрескожного полипропилена 6/0 швов.
- Во время восстановления после анестезии, положить мышь обратно в клетку и согревать животное с помощью инфракрасного света.
- Передача записанных данных с DVD-рекордера программного обеспечения, позволяющего измерение диаметра сосудов и скорости кровотока.
- Пусть животное восстановить и устранить все вводили FITC-декстрана в течение 48 часов.
- Перезапустите шаги, описанные выше, на этот раз готовит правую яремную вену и левое ухо.
8. Ткань Asservation
- После того, как прижизненная флуоресцентной микроскопия левого уха, пробы 0,5 мл крови из вены ретробульбарного сплетения глаза с использованием стеклянного капилляра. Осторожно проникнуть во внутренний угол глазной с завинчивания движениями, пока венозную кровь не течет через капилляр. Собрать зонд в пробирку крови этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
- После забора крови, принести в жертву животное путем инъекции 500 мг / кг веса тела кетамина в хвостовую вену.
- Граф клеток крови с помощью гематологического анализатора для количественной оценки лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина, и гематокрита.
- Центрифуга оставшейся крови ЭДТА при 2500 XG и комнатной температуре в течение 10 мв. Пипетке и заморозить плазму крови для дальнейших исследований.
- Используя ножницы, разрезать предсердия и зафиксировать их в 4% -ном формалине для гистологического исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффекты каннабиноидов лечения на тромбообразование
После инъекции 0,05 мл FITC-декстрана, фототоксические индукции тромба приводит к повреждению эндотелия и образованию пристеночного тромба (фиг.2 и 3). В настоящем исследовании, тромб индукции после внутрибрюшинной инъекции каннабиноидов (5 мг / кг веса тела) или транспортного средства приводит к тромботической окклюзии сосуда во всех венул (рисунок 4). В обработанных носителем животных, время образования тромба было 430 с (25 - й процентиль: 330 с; 75 - й процентиль: 637 с). Ни каннабидиола (КБР), ни администрация WIN55,212-2 (WIN) показали соответствующее влияние на время окклюзии сосуда. Тем не менее, эндогенный каннабиноидов анандамид значительно сократить время , необходимое для образования тромбов и тромботической окклюзии сосуда до 270 с (25 - й процентиль: 240s; 75 - й процентиль: 360 S, P <0,05 по сравнению с транспортного средства).
Для того, чтобы проверить , является ли участие в образовании тромба путем анандамидом гидролиз анандамидом и последующее циклооксигеназы-зависимого превращение его продукта, арахидоновая кислота,, неспецифическое ингибитор циклооксигеназы индометацин в сочетании с анандамидом в другой серии экспериментов (рисунок 5). Опять же, после инъекции 0,1 мл FITC-декстраны, анандамид (10 мг / кг массы тела) снижал тромб раз пласта, так как по сравнению с носителем (P <0,05 по сравнению с транспортным средством). В то время как в одиночку индометацин лечение не оказывает никакого влияния на венулярного раз прикуса, циклооксигеназы ингибирование в анандамидом обработанных животных значительно увеличивал образование тромба до 300 с (25 - й процентиль: 240 с; 75 - й процентиль: 420 сек), по сравнению с медианой 160 с (25 - й процентиль: 100 с; 75 - й процентиль: 200 сек) после анандамида Тре atment только (P <0,05 по сравнению с анандамидом). Раз судно окклюзии после обработки транспортного средства и индометацин / анандамида совместного введения существенно не отличались 2.
Рисунок 1. Получение яремной вены (А) и размещение уха для Прижизненной микроскопии (B). (А) с помощью операции стереомикроскопа, правая яремной вены получают. Швы для размещения левого уха сшиты перед инъекцией FITC-декстрана. Раны от предварительного рассечения левой яремной вены закрываются с чрескожными швами (B). Левое ухо фиксируется с полипропиленовыми 7/0 швами. Покровный осторожно помещают без сжатия базальных сосудов уха. Нагревательная пластина поддерживает температуру тела животного в течение всего эксперимента.ом / файлы / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Прижизненные микроскопии и Тромб индукции. Же венула показано ранее (А) и после (В) тромба при индукции 10Х, 20Х и 63x увеличении (слева направо). Плазмы крови окрашивали 0,05 мл флуоресцеина изотиоцианат-меченого декстрана (FITC-декстрана, 5%). Тромб, отмеченные *. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. венулярного тромба индукции. Же венул показан Beforе (А), после того, как 100 S (B), и после 300 с (С) эпи-освещение с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии. Активные формы кислорода генерируются синего света эпи-освещения (450 - 490 нм) с FITC-декстран и ухудшают эндотелий. Таким образом, тромбоциты активируются и прилипать к открытым субэндотелиальным структурам, что приводит к образованию первичного теменного тромба (B) и, соответственно, в полной тромботический окклюзии сосуда (C). Эта цифра была изменена с Грамбов 3. Тромб, отмеченные *. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Блок - схема Отображение экспериментального протокола. </ Сильный> каннабиноидов лечение внутрибрюшинной инъекции соответствующего каннабиноидов (5/10 мг / кг веса тела) проводили за 30 мин до IVM и индукции образования тромба в правом ухе в день 0. IVM был ограничен до 1 ч. 47 ч позже, на 2 день, тот же протокол был применен к левому уху мыши перед тем отбора проб крови. Эта цифра была изменена с Грамбов 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. венулярного тромба Формирование после однократного каннабиноидов обработки и циклооксигеназы ингибирования. Окклюзия времена венули у мышей, проходящей свет / краситель индукции тромба. (A) Животных обрабатывали с ДМСО , содержащего носитель (VEH) или с анандамидом каннабиноидов (АЕА), WIN55,212-2 (WIN), или каннабидиола (CBD) (5 мг / кг веса тела; п = 5). 0,05 мл 5% FITC-декстран вводили внутривенно до индукции тромба. В другом месте, 0,1 мл 5% FITC-декстрана (В) анандамид (10 мг / кг веса тела), смешивали с индометацином (Indo) (5 мг / кг веса тела) , чтобы оценить влияние циклооксигеназы-зависимых продуктов на формирование тромба путем анандамид (п = 5). Крускала-Уоллиса однофакторного дисперсионного анализа на рангах последовал анализ Данна постфактум (A и B). Значения приведены в качестве медианы и МКР (5 - я, 25 - я, 75 - я и 95 - я процентилей). * P <0,05 по сравнению с транспортным средством, # P <0,05 по сравнению с анандамидом, § Р <0,05 в сравнении с индометацином. Эта цифра была изменена с Грамбов 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных шагов для успешной индукции тромба в мочке уха мышей ч SKH1-Hr. Для устранения неполадок, соответствующие этапы протокола, указаны в скобках.
условия Экзаменационные идеальны у молодых животных в возрасте 4 - 6 недель и с низким ороговения эпидермиса. В более старых животных, качество визуализации сосудов хуже и менее сопоставимы за счет более высокой расстояния между поверхностью кожи и целевых сосудов (этап 1.1).
Для того, чтобы не допустить экстравазации FITC-декстрана в области экспертизы, фиксирующие швы должны быть размещены в минимально возможной степени. В непосредственной близости от стежков, флуоресцентный краситель может узловой и уменьшить контраст между внесосудистым пространства и сосудами. Это экстравазация красителя прогрессирует медленно. Если швы сшиты, как упоминалось выше, 15 мин до инъекции FITC-декстрана, хорошейэкзаменационные условия прижизненной микроскопии обеспечивается (этап 2.8).
FITC-декстрана медленно выводится почками. Сочетание флуоресцентного красителя с высокой молекулярной декстраной (150 кДа) задерживает транссудацию и экскрецию. В настоящем исследовании, время для микроскопии и тромба индукции был ограничен до 1 ч, чтобы предотвратить влияние экскреции и низких плазменных концентраций флуоресцентных красителей на время формирования тромба.
При заполнении шприцев, пузырьки воздуха не должны оставаться для инъекции, потому что даже небольшие внутривенно вводили пузырьки воздуха в шприце могут быть смертельными для животного (этап 2.5). При извлечении шприца из яремной вены после инъекции, регулярное кровотечение происходит (этап 2.6). Загрязнение впоследствии исследуемого уха с кровью или FITC-декстрана делает прижизненной микроскопии, по существу, трудно или даже невозможно. Таким образом, рекомендуется подготовка контралатерального уха и яремной вены.
Покровный должны быть тщательно применяться, без какого-либо дополнительного давления (этап 4.5). В противном случае, поток крови в целом уха замедляется из-за сжатие базальных сосудов, что может привести к снижению времени окклюзии во время индукции тромба. Точное размещениепокровное можно проверить с помощью стереомикроскопа. Венул должны быть заполнены непрерывно, особенно по краям покровного. Покровный должны быть использовано для обеспечения контакта капли воды с целью прижизненного флуоресцентного микроскопа. Погружения должны быть получены в течение всей индукции тромба в целях обеспечения эпи-освещения судна с интенсивностью 100% света. Лучший способ достичь стабильного размещения капли воды является использование покровное. Положив падение на увлажненной полупрозрачный пластиковой пленке или непосредственно на кожу вызывает утечку воды и непостоянного погружение.
Значение и ограничение мочки уха в часе Безволосого SKH1-Hr Mouse
SKH1-Hr ч безволосой мыши позволяет прямой функциональной визуализации сосудов в мочке уха с использованием прижизненной микроскопии 2, 4,
Все альтернативные модели прижизненной визуализации микроциркуляции, такие как щеки хомяка 11, спинная кожная складка камера мыши 12, 13, или кремастер мышца крысы 9, 10 требуют хирургической подготовки. Сосуды уха безволосой мыши доступны без какого - либо риска повреждения тканей хирургическим путем, так что нет никакого влияния на параметры измерения воспаления, вазоконстрикции и активации гемостаза в мочку от безволосой мыши 14. Даже если не хирургическая подготовка не требуется, разрешение изображения и ясность сопоставимы с другими моделями (например, спинной складка камеры и кремастер подготовки). Для того, чтобы достичь высокого качества изображения, протокол должен следовать тщательно и молодых мышей с меньшим ороговение тон дермы должны быть использованы.
Из-за их поверхностную локализацию, сосуды уха легко могут быть изучены с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии. Они позволяют терморегуляции у животного путем их регулирования диаметра сосуда. Поэтому, как комната и температура тела должны быть стандартизированы для получения воспроизводимых результатов. Вся мочка сосуды представляют собой периферические сосуды в кожной ткани. По сравнению с центральными сосудами, периферические сосуды характеризуются различными гистологическими структурами и экспрессией рецепторов. Таким образом, другие модели (например, препарат мезентериальных венул и артериол) , может быть более разумным для рассмотрения конкретных вопросов , касающихся центральных судов.
Другое ограничение описанной модели есть ограничение связанно с использованием безволосого мышея HR SKH1-ч, которые не так часто , как другие штаммы мыши. Таким образом, разведение трансгенных безволосые мышей может быть трудIOUs и дорого. Химические и механическое удаление волос могут вызвать местное воспаление и не удаляют корни волос, которые могут повлиять на качество визуализации. Как хорошее качество визуализации и низкое расстояние между поверхностью и целевым сосудом имеет решающее значение для надежной индукции тромба; другие модели (например, спинной складка камера) мыши может быть более подходящим для исследований , которые требуют определенных штаммов мышей с мехом. С другой стороны, модель мочка дает возможность моделирования различных патологических состояний. Например, микроциркуляция в критической перфузии ткани может быть рассмотрена после перевязки двух из трех нейрососудистых пучков 15. Анализ микроциркуляции во время заживления ран является еще одним примером подходящим для использования в ухе безволосой мышиной модели 16.
Для некоторых экспериментальных вопросов, важно изучить то же животное в разные моменты времени, чтобы Асссс временная последовательность обработки. В недавно опубликованном экспериментальном исследовании, тромб индукция в левом ухе не было изменено путем предварительной обработки правого уха 3. Таким образом, еще одним преимуществом данной модели является возможность тромбов индукции в каждом ухе той же мыши в двух различных точках времени. Что касается защиты животных, экспериментальная процедура является минимально инвазивной для животных, и мышь не должна восстанавливаться после операции или нести спинную кожную складку камеру между экспериментами. В каждом животном, по крайней мере, пяти соответствующие сосудов в ухо может быть поглощаются фототоксической индукцией тромба, так что объем данных могут быть собраны с небольшим числом животных.
Значение и ограничение прижизненной микроскопии и тромб индукции
Прижизненная флуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать микроциркуляции в режиме реального времени 5. После внутривенного введения, FITC-Dextraп окрашивает плазму крови. Это позволяет наблюдать рост тромба от начала индукции до полной окклюзии сосуда. Белые и красные клетки крови могут быть идентифицированы как пробелы в контрастном веществе. Для дальнейших исследований (например, гранулоцитарно-эндотелий взаимодействий), белые клетки крови могут быть окрашены с родамина 6G-.
Анализ записи и в автономном режиме эксперимента позволяет измерять в естественных условиях красных кровяных клеток, скорости артериол, коронарных сосудов, плотности капилляров и диаметра микрососудов. Эти параметры играют существенную роль в образовании тромбов, закрылок перфузии и заживлении ран. Наблюдение с помощью прижизненной микроскопии может непосредственно и непрерывно количественно эти динамические параметры перфузии и их изменения во время эксперимента 5. Другие методы, такие как ксенон вымыванию, уровни кислорода ткани, лазерные доплеровские, или диффузия красителя, также минимально инвазивные, но они ограничены тон косвенное измерение кровотока. Это может повлиять на достоверность результатов эксперимента. Таким образом, предпочтительными являются прямые методы.
Реакция флуоресцентного красителя и свет определенной длины волны приводит к высвобождению активных форм кислорода, которые локально повреждают эндотелий 17. Время экспозиции из текучих частиц крови является 1,000x меньше по сравнению с эндотелием. Таким образом, тромбогенный эффект первичная вследствие фототоксического повреждения эндотелия , а не из - за прямую фототоксическую активацию тромбоцитов 18. Тромбоциты активируются при контакте с открытой субэндотелиальной матрицей и образуют тромб 19 (фиг.3). Этот механизм тромбообразования играет выдающуюся роль во многих ситуациях, таких как нестабильная стенокардия и сосудистого анастомоза.
Свет / краситель индукция тромба менее агрессивна, чем альтernative метода создания эндотелиальных поражений через баллонный катетер 20, 21 электрического тока, лазер 22, или воспаление 19. Тромб индукция с легким / красителем также действует строго локально в пучке света объектива. Таким образом, соседние сосуды непосредственно не пострадали и могут быть использованы для последующей индукции тромба. Свет / краситель индукции тромба может быть выполнена в обоих венул и артериол. В настоящем исследовании, венул были исключительно потому , что лечение эпи-освещение артериол может вызвать спазм сосудов, что может повлиять на прикус раз 19.
Наркоз проводили с использованием комбинации ксилазина и кетамина, который установлен в ветеринарии и экспериментальной медицины. Препараты вводили внутрибрюшинно. С вышеуказанной дозировке, достаточные анестезии с допуском хирургии в течение 30 мин и сна в течение 1,5 - 2 ч была достигнута,
Ухо безволосой SKH1-Hr часа мышей хорошо известно в заживлении ран и исследовании закрылка. Несколько исследований использовали модель успешно для индукции тромба и тромболизис 3, 23, 24, 25, 26. Если протокол выполняется должным образом, прижизненная микроскопия в мочке уха от безволосой SKH1-Hr ч мыши является надежным, простым и эффективным инструментом для исследования формирования микроциркуляции и тромбов. Это просто для имитации различных патологических состояний, в то время как модель предлагает отличную экспериментальную установку для оценки критических параметров микроциркуляции в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы не имеют никаких подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
