Summary
Het oor model van de kale SKH1-Hr uur muis maakt intravitale fluorescentiemicroscopie microcirculatie en fototoxische trombus inductie zonder voorafgaande chirurgische preparaten in de onderzochte microvasculaire bed. Daarom is het oor van de haarloze muis is een uitstekend in vivo model voor de complexe interacties te bestuderen tijdens microvasculaire trombusvorming, trombus evolutie, en trombolyse.
Abstract
Trombotische complicaties van vasculaire ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de geïndustrialiseerde landen. Vanwege de complexe interacties tussen cellulaire en niet-cellulaire bloedcomponenten bij thrombusvorming, kan betrouwbare studies van de fysiologie en pathofysiologie van trombose alleen worden uitgevoerd in vivo. Daarom worden in dit artikel een oor model in haarloze muizen en richt zich op de in vivo analyse van de microcirculatie, trombusvorming en trombus evolutie. Via intravitale fluorescentiemicroscopie en intraveneuze (iv) toepassing van de respectieve fluorescerende kleurstoffen, kan een herhaalde analyse van de microcirculatie in de oorschelp gemakkelijk worden uitgevoerd, zonder de noodzaak van chirurgische voorbereiding. Bovendien kan dit model worden aangepast voor in vivo studies van verschillende zaken, zoals wondgenezing, reperfusieletsel, of angiogenese. Kortom, het oor van haarloze muizen is een ideaal model voor de in vivo onderzoek microcirculatie in fysiologische of pathofysiologische aandoeningen en de evaluatie van de reactie op andere systemische of topische behandelingen.
Introduction
Het doel van dit artikel is de techniek van intravitale microscopie toegepast op de oorschelp van de haarloze muis voor de directe observatie en analyse van microcirculatie, trombusvorming en trombus evolutie beschrijven. Met een incidentie van 1 op 1000, veneuze trombose nog steeds een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit. Hoewel diagnostiek, preventiestrategieën en therapieën zijn in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, een derde van de veneuze trombose manifesteert zich als een longembolie 1. Arteriële trombose speelt een cruciale rol in hart- en vaatziekten, die de meest voorkomende doodsoorzaak in geïndustrialiseerde landen zijn. Arteriële trombose op basis van de breuk van atherosclerotische plaques is betrokken bij hartaanvallen, mesenteriale infarcten, en beroerte. Elke operatie bloot subendotheliale structuren bloedcomponenten, verandert de dynamiek van de bloedstroom, en immobiliseert de patiënt. In endoprosthetische operatie aan de onderste ledematen, orgel transplantation en flap chirurgie trombose zijn frequente oorzaken van complicaties. Microvasculaire trombose in het bijzonder veroorzaakt vaak onherstelbare schade, als gevolg van het gebrek aan klinische symptomen. Ook microvasculaire trombose speelt een cruciale regel in verschillende ziekten, waaronder trombotische trombocytopenische purpura, sepsis, diffuse intravasale stolling, antifosfolipidensyndroom en veneuze insufficiëntie, onder anderen.
Verschillende nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling en preventie van trombose werden ontwikkeld in de afgelopen jaren, maar antiplatelet drugs en antistollingsmiddelen hebben nog steeds bijwerkingen, gebrek antagonisten, en zijn voorzien van lange duur effecten. Deze tekortkomingen leiden tot problemen in dringende medische zorg. Aldus is meer onderzoek nodig om de complexe processen die optreden tijdens trombose, die nauwelijks kan worden gesimuleerd in vitro bloot te leggen.
De haarloze SKH1-Hr hr muis werd ontdekt 1926 in een dierentuin in Londen.Vanwege een gendefect op chromosoom 14, het dier verliest zijn vacht na postnatale dag 10. Dit geeft een goed gevasculariseerde auricula toegankelijk intravitale microscopie van de vaten. De gemiddelde dikte van het oor is 300 urn. Het bestaat uit twee lagen van de dermis, die worden gescheiden door kraakbeen. Aan de convexe dorsale zijde van het kraakbeen, 3 vaatbundels voert de oorlel. Apicale vasculaire bogen en basale shunts sluit de drie bundels. De venules hebben diameters tussen 200 urn (basaal) en 10 urn (apicale). Fijnmazig haarvaten rond de lege haarzakjes 2. De anatomie van de haarloze SKH1-Hr hr muis maakt de oorschelp een krachtige en kosteneffectieve model voor trombose onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo-experimenten (7221.3-1-006 / 15) werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake de bescherming van dieren en de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council).
1. Algemene houden van de dieren
- Voer de experimenten met mannelijke SKH1-Hr uur muizen van 4 tot 6 weken. Dieren worden gebruikt met een gewicht tussen 20 en 25 g.
- Bewaar de dieren in een pathogeenvrije faciliteit en onder gestandaardiseerde omstandigheden van 24 tot 26 ° C en 60% relatieve vochtigheid, met constante toegang tot water en voedsel ad libitum.
- Blijf op de vijf mannelijke dieren in een kooi. Zorg voor beddengoed en verrijking materiaal tijdens de behuizing van de dieren voor hun welzijn.
2. prearrangement of the Animals
- Weeg een muis en laadt de respectievelijke geneesmiddel (bijvoorbeeld de cannabinoïde, 5 mg / kg lichaamsgewicht (BW)) in een insulinespuit. Toedienen van het geneesmiddel 30 minuten voorafgaand aan inductie trombus.
- Door het vasthouden van de nek van de muis tussen duim en wijsvinger en de staart van de muis met de pink, strekken het dier en injecteer het geneesmiddel intraperitoneaal (ip) in de linker kwadrant van de buik. Zet het dier weer in de kooi gedurende 15 min.
- Bereiden anesthesie met ketamine (90 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (25 mg / kg lichaamsgewicht). 15 minuten vóór inductie trombus, verdoven de muis. Zet de muis in de kooi, trek de staart licht, en injecteer de verdoving ip een insulinespuit.
- Zet de muis terug in de kooi tot het begin van de anesthesie. Om voldoende verdoving controleren, knijp de staart met een tang.
- Load 0,05 ml ontdooid fluoresceïne-isothiocyanaat gemerkt dextran (FITC-dextran, 5%, 150 kDa) in een insulinespuit. Het vullen van de injectiespuit zorgen dat er geen luchtbellen achterblijven, omdat zelfs kleine intravenously (iv) -administered luchtbellen dodelijk voor het dier.
- Plaats de verdoofde muis op een verwarmingsplaat in de beneden positie. Pas de verwarmingsplaat op 37 ° C.
- Zet oogzalf op het hoornvlies van de muis. Ontsmet de huid en het gebruik van steriele instrumenten.
- Steek twee hechtingen van polypropeen 7/0 in de craniale en caudale rand van het rechter oor. Leg de steken zo dicht mogelijk bij de rand en dat proximaal aan de basis mogelijk (Figuur 1B).
- Schuif de muis om dorsale positie. Fix alle poten naar acrylglass platform met behulp van plakband. Haak een hechting onder de voortanden en plaats de kop in dorsiflexie door steken de hechtdraad de acrylglass plakstrips.
- Transloceren het dier op het platform in het kader van de operatie stereomicroscoop. Gebruik 16X vergroting.
3. Bereiding van de linker halsader en injectie van FITC-Dextran
Opmerking: voor microscopy van het rechter oor, de voorbereiding van de linker halsader.
- Met behulp van een scalpel, voer een 5-mm incisie in de huid aan de linkerzijde van de nek in een cranio-caudaal. Ontleden het subcutane weefsel met een microforceps en microscissors. Ofwel ligaat kruising schepen met polyester 8/0 hechtingen of met electrocoagulatie.
- Bevrijd de ader van de adventitia met behulp microforceps en microscissors zonder het aanraken van het schip.
- Met de bereide insuline spuit voor het injecteren van de fluorescerende kleurstof. pak voorzichtig de vaatwand met de microforceps, zonder perforeren de ader. Doordringen in de uitgezette vaatwand met de injectiespuit en injecteer FITC-dextran iv.
- Het bloeden te stoppen nadat de injectiespuit via wattenstaafjes onttrekken. Vermijd bloed en vervuiling van het oor verven.
4. Plaatsing van het rechter oor voor intravitale fluorescentiemicroscopie
- Breng het dier op de verwarmingsplaat een acrylglass construction met een sleuf voor de verwarmingsplaat en een 0,5 cm hoog vlak voor het positioneren van het oor.
- Bevestig het dier naar beneden op de verwarmingsplaat behulp plakstrips. Plaats de relatief sterke en convexe kraakbeen bij de basis van het oor naast het 0,5 cm hoog vlak voor het oor (figuur 1B) zodat het apicale deel van het oor plat worden geplaatst op het vliegtuig.
- Één druppel kamertemperatuur 0,9% NaCl om het acrylglass vlak om het oor te plaatsen. Leg het rechter oor, de afgesproken hechtingen aan zijn concave ventrale zijde naar beneden op de daling van 0,9% NaCl. Gebruik wattenstaafjes, absorberen de druppel NaCl en laat capillaire krachten bevestig het oor vliegtuig naar het acrylglass.
- Tape de hechtingen aan de acrylglass de positie van het oor vast.
- Één druppel 0,9% NaCl kamertemperatuur aan de convexe dorsale zijde van het oor. Zorgvuldig zet een dekglaasje (0,5 cm diameter) op het oor zonder samendrukken van de basale schepen die the oor. Gebruik wattenstaafjes, verwijder zoveel mogelijk NaCl onder het dekglaasje om de afstand tussen het dekglaasje en het oor doelvaten minimaliseren.
5. intravitale fluorescentiemicroscopie en Trombus Inductie van het rechteroor
- Stel de intravitale fluorescentiemicroscoop voor FITC-dextran visualisatie (450-490 nm; FT: 510; LP: 520). Met een variabele-100 W kwiklamp als lichtbron. Sluit een hoge resolutie, zwart-wit CCD-camera op een DVD recorder.
- Breng het dier op de acrylglass met de verwarmingsplaat met de vaste ontvoerde oor naar het bureau van de intravitale fluorescentiemicroscoop.
- Gebruik 20X vergroting (20X / 0.95 numerieke apertuur) en 20% lichtintensiteit zoeken naar een veneus vat 50 - 60 urn in diameter en met een voorwaartse bloedstroom van 400-600 um / s.
- Voeg een druppel water op kamertemperatuur om het dekglaasje voor onderdompeling in water van de 63x magnification doelstelling (63X / 0.95 numerieke apertuur). Met een spuit met een 1-mm canule en plaats de druppel op het objectief van de microscoop. Voeg net genoeg water om contact op met de dekglaasje en de doelstelling om met het water te laten vallen.
- Onmiddellijk na het aanbrengen van de waterdruppel, de gegevens van de vat gedurende 20 seconden met 20% lichtintensiteit voor offline meten van de diameter en de bloedstroom.
- Beginnen trombus inductie 5 minuten na de injectie van FITC-dextran. Voor dit doel verhogen de lichtintensiteit tot 100%.
- Bij thrombusvorming inductie, sluit de opening van de microscoop 2 sec binnen 30 s om de bloedstroom te controleren. Bij persisterende bloedstroom, opent de opening weer. Bij gestopt bloedstroom, acht het vat gedurende 30 s.
LET OP: Het schip is geclassificeerd als afgesloten wanneer de stroom stil staat gedurende 30 seconden of meer, of indien het bloed stroomt retrograad. Indien de orthograde bloedstroming opnieuw gestart, het diafragma en Contin volledig openen ue de trombus inductie tot vatafsluiting zoals boven bedoeld. Tijdens de vroege trombus inductie waarborgen dat de tijd dat de opening werd gesloten om de bloedstroom te controleren zo kort mogelijk teneinde nagenoeg continue epi-belichting handhaven. Later, tijdens trombus groei, het vat geperfuseerd met minder fluorescerende kleurstof, zodat het kan continu worden waargenomen. - Selecteer en af te sluiten 5 vaten per oor. Tijdslimiet van trombus inductie onder de microscoop op ongeveer 1 uur na de injectie van FITC-dextran.
6. Follow-up Activiteiten
- Voer een wond sluiting van de nek met behulp van transcutane polypropyleen 6/0 hechtingen.
- Tijdens het herstel van de anesthesie, zet de muis terug in de kooi en verwarm het dier met infrarood licht.
- Breng de geregistreerde gegevens van de DVD-recorder op software waarmee de meting van de diameter van de vaten en de snelheid van de bloedstroom.
- Liet het dier herstellen en elimineren alle geïnjecteerde FITC-dextran gedurende 48 uur.
- Voer de hierboven beschreven stappen, dit keer de voorbereiding van de rechter halsader en het linker oor.
8. Weefsel Asservation
- Na intravitale fluorescentiemicroscopie van het linkeroor, monster 0,5 ml bloed uit de ader retrobulbaire plexus van het oog met een glazen capillair. dringen voorzichtig de binnenste palpebrale hoek schroeven bewegingen tot veneus bloed door het capillair stroomt. Verzamel de sonde per ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bloed buis.
- Na bloedafname, offeren het dier door het injecteren van 500 mg / kg lichaamsgewicht ketamine in de staartader.
- Tel de bloedcellen met behulp van een hematologie-analysator voor een kwantitatieve beoordeling van leukocyten, erytrocyten, trombocyten, hemoglobine en hematocriet.
- Centrifugeer de resterende EDTA bloed bij 2500 x g en kamertemperatuur gedurende 10 min. Pipetteer en vries het bloedplasma voor verder onderzoek.
- Met een schaar, knip de oorschelpen en ze op te lossen in 4% formaldehyde voor histologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effecten van Cannabinoid Treatment thrombogenese
Na injectie van 0,05 ml FITC-dextran, fototoxisch trombus inductie leidt tot een endotheliale laesie en de vorming van een pariëtale plaatjesprop (figuren 2 en 3). In deze studie thrombus-inductie na ip injectie van cannabinoïden (5 mg / kg lichaamsgewicht) of vehikel tot een trombotische occlusie vat alle venules (figuur 4). Bij met hulpstof behandelde dieren, de tijd tot trombusvorming werd 430 s (25 percentiel: 330 s; 75ste percentiel: 637 s). Noch cannabidiol (CBD), noch WIN55,212-2 (WIN) administratie toonde een significant effect op de vaartuig occlusie tijden. Echter, de endogene cannabinoïde anandamide verminderde significant de tijd die nodig is voor de vorming van een trombus en trombotische vaartuig occlusie tot 270 s (25e percentiel: 240s; 75ste percentiel: 360 s, P <0,05 versus vehikel).
Om te testen of de hydrolyse van anandamide en de daaropvolgende cyclooxygenase-afhankelijke omzetting van zijn product, arachidonzuur, is betrokken bij trombusvorming door anandamide, werd de niet specifieke cyclooxygenase remmer indomethacine samen met anandamide in een andere reeks experimenten (figuur 5). Nogmaals, bij injectie van 0,1 ml van FITC-dextran, anandamide (10 mg / kg lichaamsgewicht) de trombusvorming verminderde maal in vergelijking met vehikel (P <0,05 versus vehikel). Terwijl indomethacine behandeling alleen geen effect op venulaire occlusie tijd gehad, cyclooxygenase inhibitoren op-anandamide behandelde dieren significant verlengd trombusvorming tot 300 s (25 percentiel: 240 s; 75ste percentiel: 420 B), vergeleken met de mediaan van 160 s (25 percentiel: 100 s; 75ste percentiel: 200 B) na anandamide tre atment alleen (P <0,05 versus anandamide). Vatafsluiting gevechten vehikelbehandeling en indomethacine / anandamide gelijktijdige toediening niet significant 2.
Figuur 1. Bereiding van de halsader (A) en plaatsing van het oor voor intravitale microscopie (B). (A) De bewerking stereomicroscoop, wordt de rechter halsader bereid. De hechtingen voor het plaatsen van de linker oor zijn gestikt voor de injectie van FITC-dextran. De wond van de stand dissectie van de linker halsader wordt gesloten met hechtingen transcutane (B). De linker oor wordt bevestigd met polypropyleen 7/0 hechtingen. Een dekglaasje wordt zorgvuldig geplaatst zonder samendrukken van de basale vaten van het oor. Een verwarmingsplaat houdt de lichaamstemperatuur van het dier gedurende het gehele experiment.OM / files / ftp_upload / 55174 / 55174fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 intravitale microscopie en trombus inductie. Dezelfde venule getoond vóór (A) en na (B) thrombus inductie bij 10X, 20X en 63X vergroting (links naar rechts). Het bloedplasma is gekleurd met 0,05 ml fluoresceïne-isothiocyanaat gemerkt dextran (FITC-dextran, 5%). De trombus is gemarkeerd met *. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. venular trombus inductie. Dezelfde venule weergegeven before (A) na 100 s (B) en na 300 s (C) van epi-belichting door middel van intravitale fluorescentiemicroscopie. Reactieve zuurstofspecies ontstaan door blauw licht epi-belichting (450-490 nm) van FITC-dextran en beïnvloeden het endotheel. Aldus worden de bloedplaatjes geactiveerd en zich aan blootgelegde subendotheliale structuren, waardoor primaire vorming pariëtale thrombus (B) en vervolgens volledig trombotische occlusie vat (C). Dit cijfer is aangepast Grambow 3. De trombus is gemarkeerd met *. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Grafiek van de Stroom Tonen van het experimentele protocol. </ Strong> Cannabinoid behandeling door ip injectie van de respectievelijke cannabinoïde (5/10 mg / kg lichaamsgewicht) werd uitgevoerd 30 minuten voor IVM en de inductie van trombusvorming in het rechter oor op dag 0. IVM beperkt tot 1 uur. 47 uur later, op dag 2, werd hetzelfde protocol toegepast op het linkeroor van de muis voor het bemonsteren van het bloed. Dit cijfer is aangepast Grambow 3. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. venulaire trombusvorming na Single Cannabinoid Behandeling en Cyclooxygenase Remming. Occlusie tijden van venules in muizen ondergaan licht / kleurstof trombus inductie. (A) Dieren werden behandeld met DMSO bevattende voertuig (VEH) of met cannabinoïden anandamide (AEA), WIN55,212-2 (WIN) of cannabidiol (CBD) (5 mg / kg lichaamsgewicht, n = 5). 0,05 ml 5% FITC-dextran geïnjecteerd iv voorafgaande aan inductie trombus. In een andere instelling, 0,1 ml 5% FITC-dextraan (B) anandamide (10 mg / kg lichaamsgewicht) werd gecombineerd met indomethacine (Indo) (5 mg / kg lichaamsgewicht) om het effect van cyclooxygenase-afhankelijke producten trombusvorming beoordelen aan anandamide (n = 5). Kruskal-Wallis one-way ANOVA op rangen werd gevolgd door Dunn's post hoc analyse (A en B). De waarden worden gegeven als mediaan en IQR (5e, 25ste, 75ste en 95ste percentiel). * P <0,05 versus vehikel, #P <0,05 versus anandamide, § P <0,05 versus indomethacine. Dit cijfer is aangepast Grambow 3. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal cruciale stappen voor de succesvolle trombus inductie in de oorlel van SKH1-Hr hr muizen. Voor het oplossen van problemen, worden de respectievelijke stappen van het protocol aangegeven tussen haakjes.
Onderzoek omstandigheden zijn ideaal bij jonge dieren op de leeftijd van 4-6 weken en met een lage verhoorning van de opperhuid. Bij oudere dieren, de kwaliteit van visualisatie van de vaten slechter en meer vergelijkbaar vanwege de hogere afstand tussen het huidoppervlak en doelvaten (stap 1.1).
De extravasatie van FITC-dextran op het gebied van onderzoek voorkomen moet de vaststelling hechtdraden als marginaal worden geplaatst mogelijk. Nabij de steken, kunnen fluorescente kleurstof extravasatie en het contrast tussen de extravasculaire ruimte en de vaten te verminderen. Deze uitstorting van de kleurstof vordert langzaam. Wanneer de hechtingen worden genaaid zoals hierboven genoemd 15 minuten voorafgaand aan de injectie van FITC-dextran, goodonderzoek naar de voorwaarden van intravitale microscopie worden gewaarborgd (stap 2.8).
FITC-dextran wordt langzaam via de nieren geëlimineerd. De combinatie van de fluorescente kleurstof met een hoog molecuulgewicht dextran (150 kDa) vertraagt extravasatie en uitscheiding. In deze studie, de tijd voor microscopie en trombus inductie beperkt tot 1 uur de invloed van excretie en lage fluorescerende kleurstof plasmaconcentraties op trombusvorming beletten.
Het vullen van de spuiten wordt geen luchtbellen overblijven voor de injectie, omdat zelfs kleine iv toegediend luchtbellen in de spuit dodelijk zijn voor het dier (stap 2,5) kunnen zijn. Bij het uittrekken van de spuit uit de halsader na de iv injectie regelmatig bloeden optreedt (stap 2.6). Vervuiling van de vervolgens onderzocht oor met bloed of FITC-dextran maakt intravitale microscopie hoofdzaak moeilijk of zelfs onmogelijk. Zo wordt de voorbereiding van de contralaterale oor en halsader aan te bevelen.
Het dekglaasje moet zorgvuldig worden toegepast, zonder enige extra druk (stap 4.5). Anders wordt de bloedstroom in de gehele oor afgenomen als gevolg van de samendrukking van de basale vaten, waarbij de occlusie tijden bij thrombusvorming geïnduceerd wordt, kan verminderen. De nauwkeurige plaatsing vanhet dekglaasje kan worden geverifieerd met de stereomicroscoop. De venulen moeten voortdurend worden gevuld, met name aan de randen van het dekglaasje. Het dekglaasje worden gebruikt om het contact van de waterdruppel met als doel de intravitale fluorescentiemicroscoop garanderen. De onderdompeling heeft gedurende de gehele thrombus-inductie te verkrijgen om de epi-belichting van het vat met 100% lichtintensiteit verzekeren. De beste manier om de stabiele plaatsing van de druppel water te bereiken is met behulp van het dekglaasje. Aanbrengen van de druppel op bevochtigde doorschijnende plastic folie of direct op de huid veroorzaakt afvoer van het water en onbestendige onderdompeling.
Betekenis en beperkingen van de oorlel van de haarloze SKH1-Hr hr Mouse
De SKH1-Hr uur haarloze muis staat een rechtstreekse functionele beeldvorming van de vaten in de oorlel behulp intravitale microscopie 2, 4, 2. Het volledige microvasculaire netwerk, bestaande uit venulen, arteriolen en capillairen tot 100 pm in diameter, kan worden gevisualiseerd en in real time onderzocht. Dit maakt het oor van haarloze muizen een geschikt model voor de studie van wondgenezing 6, 7, axiale-patroon platen 2, 5, 5 macromoleculaire lekkage en microvasculaire trombusvorming 8, 9, 10. De beschikbaarheid van schepen tot 100 pm in diameter is een limiet aan het model. Afschuifspanning, bloedstroming en vat architectuur verschillen in kleine en grote vaten. Daarom kan modellen zoals de halsslagader of de femorale vaten meer geschikt voor studies gericht op macrovasculaire trombusvorming.
Alle alternatieve modellen van intravitale visualisatie van microcirculatie, zoals de wang van de hamster 11, de dorsale huidplooi kamer van de muis 12, 13, of cremaster spier van de rat 9, 10 vereisen chirurgische voorbereiding. Vaten van het oor van de haarloze muis zijn toegankelijk zonder het risico van weefselbeschadiging door een operatie, zodat er geen invloed op de meetparameters door ontsteking, vasoconstrictie en activatie van hemostase in de oorlel van de haarloze muis 14. Hoewel er geen chirurgische voorbereiding nodig is, de beeldresolutie en helderheid zijn vergelijkbaar met andere modellen (bijvoorbeeld de dorsale huidplooi kamer en cremaster voorbereiding). Om een hoge beeldkwaliteit te bereiken, dient het protocol goed te volgen, en jonge muizen met minder verhoorning thij dermis moeten worden gebruikt.
Door hun oppervlakkige lokalisatie, kunnen de vaten van het oor gemakkelijk worden bestudeerd door intravitale fluorescentiemicroscopie. Zij stellen thermoregulatie bij dieren door hun instelling van de vatdiameter. Daarom room- en lichaamstemperatuur worden gestandaardiseerd reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Alle oorlel vaartuigen vertegenwoordigen perifere vaten in huidweefsel. Wanneer het in schepen, worden perifere vaten gekenmerkt door verschillende histologische structuren en receptorexpressie. Daarom zijn ook andere modellen (bijvoorbeeld de voorbereiding van de mesenteriale venulen en arteriolen) wellicht meer redelijk voor het onderzoek van de specifieke kwesties met betrekking tot het centrum van vaartuigen.
Een andere beperking van het beschreven model is de beperking van het gebruik van haarloze SKH1-Hr uur muizen, die minder vaak voor andere muizenstammen. Daarom is het fokken van transgene haarloze muizen kan zijn arbeidious en duur. Chemische en mechanische ontharing kan lokale ontsteking veroorzaken en niet het haar wortels, die visualisatie kwaliteit kunnen beïnvloeden te verwijderen. Zoals een goede visualisatie kwaliteit en lage afstand tussen het oppervlak en het doelvat is van cruciaal belang voor een betrouwbare trombus inductie; andere modellen (bijvoorbeeld de dorsale skinfold kamer) van de muis kan geschikter voor studies dat bepaalde muizenstammen met bont vereisen. Anderzijds, de oorlel model maakt de simulatie van verschillende pathologische aandoeningen. Bijvoorbeeld kan de microcirculatie bij kritisch geperfuseerde weefsel wordt onderzocht na de ligatuur van twee van de drie neurovasculaire bundels 15. Analyse van de microcirculatie gedurende wondgenezing is een geschikt voorbeeld voor de toepassing van het oor van de haarloze muis model 16.
Voor sommige experimentele vragen, is het belangrijk om hetzelfde dier op verschillende tijdstippen na te gaan in Assess de tijdvolgorde van behandeling. In de onlangs gepubliceerde experimentele studie werd trombus inductie in het linkeroor niet veranderd door voorbehandeling van het rechteroor 3. Daarom is een ander voordeel van het model is de mogelijkheid trombus inductie in elk oor van dezelfde muis op twee verschillende tijdstippen. Inzake dierenbescherming, de experimentele bereidingswijze is minimaal invasief voor de dieren, en de muizen geen te herstellen van een operatie of een bij dorsale huidplooi kamer tussen de experimenten. In elk dier kan ten minste vijf geschikte vaten per aar worden afgesloten door fototoxische thrombus inductie, kan zoveel gegevens worden verzameld met een klein aantal dieren.
Betekenis en beperkingen van intravitale microscopie en Trombus Inductie
Intravitale fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van de microcirculatie in real time 5. Na intraveneuze toediening, FITC Dextran kleurt het bloedplasma. Het maakt de waarneming van trombus groei vanaf het begin van de inductie tot volledige vat occlusie. Witte en rode bloedcellen kunnen worden geïdentificeerd als hiaten in het contrastmiddel. Voor verder onderzoek (bijvoorbeeld granulocyt-endotheel interacties), kunnen witte bloedcellen worden gekleurd met rhodamine-6G.
De registratie en offline analyse van het experiment kan de in vivo meting van rode bloedcel snelheid arteriolaire vatbeweging, capillaire dichtheid en microvasculaire diameter. Deze parameters spelen een belangrijke rol in de vorming van een trombus, flap perfusie en wondgenezing. Waarneming door intravitale microscopie kunnen direct en continu deze dynamische perfusie parameters en hun verandering te kwantificeren tijdens het experiment 5. Andere technieken, zoals xenon uitwassen weefsel zuurstofniveaus, laser Doppler of kleurstofdiffusie, ook minimaal invasief, maar beperkt door thij indirecte meting van de bloedstroom. Dit kan de geldigheid van de experimentele resultaten beïnvloeden. Daarom worden directe methoden de voorkeur.
De reactie van de fluorescerende kleurstof en het licht van een bepaalde golflengte leidt tot de afgifte van reactieve zuurstofspecies, die plaatselijk het endotheel 17 beschadigen. De blootstellingstijd van de vloeiende bloed deeltjes 1000x minder in vergelijking met het endotheel. Daarom is het thrombogene effect primair te wijten aan fototoxisch endotheliale laesie en niet door directe fototoxische bloedplaatjesactivatie 18. Bloedplaatjes worden geactiveerd door contact met de blootliggende subendotheliale matrix en vormen een bloedplaatjes prop 19 (figuur 3). Dit mechanisme van thrombogenesis speelt een opmerkelijke rol in vele situaties, zoals instabiele angina pectoris en vasculaire anastomose.
Licht / kleurstof trombus inductie is minder invasief dan de alternative methoden voor het maken endotheliale lesies door de ballonkatheter 20, elektrische stroom 21, laser 22 of 19 ontsteking. Trombus inductie met licht / kleurstof fungeert ook strikt lokaal in de lichtbundel van het objectief. Daarom zijn aangrenzende vaten niet direct beïnvloed en kan worden gebruikt voor daaropvolgende inductie trombus. Licht / kleurstof trombus inductie kan worden uitgevoerd in zowel de venulen en arteriolen. In de huidige studie werden venulen uitsluitend behandeld omdat epi-verlichting van arteriolen vasospasme kunnen veroorzaken, waardoor de occlusie tijden 19 kunnen beïnvloeden.
Anesthesie werd uitgevoerd met de combinatie van xylazine en ketamine, gevestigd in de veterinaire en experimentele geneeskunde. De drugs werden geïnjecteerd ip. Met bovengenoemde dosering voldoende anesthesie met chirurgie tolerantie gedurende 30 minuten en slaap gedurende 1,5 - 2 uur werd bereikt.
Het oor van de haarloze SKH1-Hr hr muis is goed ingeburgerd in wondgenezing en flap onderzoek. Verschillende studies hebben het model met succes gebruikt voor trombus inductie en trombolyse 3, 23, 24, 25, 26. Als het protocol goed wordt uitgevoerd, intravitale microscopie in de oorlel van de haarloze SKH1-Hr uur muis is een betrouwbare, gemakkelijk en efficiënt hulpmiddel voor het bestuderen van microcirculatie en trombusvorming. Het is eenvoudig om verschillende pathologische omstandigheden te simuleren, terwijl het model biedt een uitstekende experimentele setting om cruciale parameters van de microcirculatie in vivo te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SKH-1/hr mice | Charles River | 477 | can be purchased from other vendors |
| standard laboratory food | ssniff Spezialdiaeten | V1594-0 | can be purchased from other vendors |
| operation stereomicroscope | Leica | M651/M655 | can be purchased from other vendors |
| intravital microscope | Zeiss | Axiotech Vario 100 | can be purchased from other vendors |
| objective (20X/0.95) | Zeiss | 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR | can be purchased from other vendors |
| objective (63X/0.95) | Zeiss | 63x/0,95 W; ACHROPLAN | can be purchased from other vendors |
| black and white CCD-camera | Pieper | FK 6990 IQ-S | can be purchased from other vendors |
| DVD-recorder | Panasonic | DMR-EX99V | can be purchased from other vendors |
| sodium chloride | Braun | 5/12612055/1011 | can be purchased from other vendors |
| Ketamine 10% | Bela pharm | F3901-6 | can be purchased from other vendors |
| Xylazine 2% | Bayer | 6293841.00.00 | can be purchased from other vendors |
| FITC-dextran 5% | Sigma | 46945-100MG-F | can be purchased from other vendors |
| dexapanthenol 5% eye ointment | Bayer | 6029009.00.00 | can be purchased from other vendors |
| formaldehyde 4% | Sigma | HT501128-4L | can be purchased from other vendors |
| DMSO | Sigma | 472301 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 5 x 5 x 1 mm | Menzel | L4339 | can be purchased from other vendors |
| Adhesive strips | Leukosilk | 4683400 | can be purchased from other vendors |
| centrifuge | Beckman Coulter | CLGS 15 | can be purchased from other vendors |
| hematology analyzer | Sysmex | KX-21 A6980 | can be purchased from other vendors |
| EDTA-blood tube | Sarstedt | 201,341 | can be purchased from other vendors |
| cotton swabs | Sanyo | 604-A-1 | can be purchased from other vendors |
| infrared light | Beurer | 5/13855 | can be purchased from other vendors |
| single use synringe | Braun | 2020-08 | can be purchased from other vendors |
| insulin syringe | Braun | 9161502 | can be purchased from other vendors |
| disposable hypodermic needles | Braun | 465 7640 | can be purchased from other vendors |
| end-to-end capillary | Sarstedt | 19,447 | can be purchased from other vendors |
| heating plate | Klaus Effenberg | OP-T 185/03 | can be purchased from other vendors |
| scissors 14.5 cm | Aesculap | BC259R | can be purchased from other vendors |
| needle Holder | Aesculap | BM081R | can be purchased from other vendors |
| microforceps | Aesculap | BD331R | can be purchased from other vendors |
| microscissors | Aesculap | OC496R | can be purchased from other vendors |
| scalpel 21 | Dahlhausen | 11.000.00.511 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 7-0 | Ethicon | XNEH7470 | can be purchased from other vendors |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XN8706.P33 | can be purchased from other vendors |
| electrocautery | Servoprax | H40140 | can be purchased from other vendors |
| acrylglass pad | integrated heating, 0.5 cm high plane |
References
- White, R. H. The epidemiology of venous thromboembolism. Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).
- Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
- Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity. Biofactors. , (2016).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).
- Goertz, O., et al. Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing. Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).
- Goertz, O., et al. Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo. J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).
- Roesken, F., et al. A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse. Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).
- Sorg, H., et al. Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model. Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).
- Sorg, H., et al. Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study. Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).
- Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells. Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331 (1975).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).
- Grambow, E., et al. Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice. Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).
- Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).
- Harder, Y., et al. Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin. Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).
- Langer, S., et al. Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice. Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).
- Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction. Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).
- Herrmann, K. S., et al. Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran. Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).
- Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo. Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).
- Lee, W. M., Lee, K. T. Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding. Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).
- Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels. Angiology. 11, 35-39 (1960).
- Rosen, E. D., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).
- Agero, U., et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).
- Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels. Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).
- Bilheiro, R. P., et al. The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis. Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).
- Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases. Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).
