Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Visualisering av cellesyklus Variasjoner og Bestemmelse av Nukleasjon i postnatal cardiomyocytes

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Physiology I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Introduction

Riktig identifisering av cardiomyocyte kjerner og cellesyklus status er av avgjørende betydning for bestemmelse av hjertemuskelen omsetning og regenerering. Dette gjelder spesielt for bruk av atom markører, slik som pHH3, Ki-67, eller thymidin analoger, for identifisering av cellesyklusaktiviteten. Som den proliferative kapasiteten til voksne pattedyr-kardiomyocytter er meget liten 1, en falsk identifikasjon av en kjerne for en positiv proliferasjon markør av en kardiomyocytt kjerne kan gjøre en avgjørende forskjell i resultatet av en proliferasjonsanalyse. Videre cardiomyocytes er utsatt for variasjoner i cellesyklusen, slik som endoreduplication og acytokinetic mitose, noe som fører til polyploide celler og multinucleated heller enn i celledeling. For dette formål, er tolkningen av antistoffarging mot vanlige cellesyklus markører ikke konkluderende i alle tilfeller.

Her presenterer vi metoder for straight-forwa rd anerkjennelse av mus cardiomyocytes og deres nukleær i native isolerte celler og seksjoner tykke vevet ved postnatal og voksne stadier av utvetydig identifisering av sine kjerner. For dette formål ble en transgen mus linje med kardiomyocytt-spesifikk ekspresjon av et fusjonsprotein bestående av humant histon H2B og mCherry under kontroll av den Myh6 promoter (Myh6-H2B-MCH) benyttes to. Kryss avl denne musen linje med en transgen indikator spredning mus linje, i hvilken ekspresjonen av en EGFP-anillin fusjonsproteinet står under kontroll av den allestedsnærværende kylling aktin-promoteren med et CMV-enhancer (CAG-EGFP-anillin), gjør det mulig å bestemmelse av cellesyklusstatus. Stillaset protein anillin er spesielt uttrykt i cellesyklusen aktive celler 3, og dens differensial subcellulær lokalisasjon i løpet av cellesyklusen tillater direkte følgecellesyklusutvikling med en høy oppløsning av M-Phaseef "> 4. Derfor er den doble transgene mus kan brukes for å diskriminere mellom prolifererende kardiomyocytter og de som gjennomgår cellesyklusvariasjoner. Dette viser seg spesielt nyttig i screening for sprednings-induserende substanser in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer i denne protokollen som involverer dyr var i samsvar med etiske normer ved Universitetet i Bonn og overholdt retningslinjene fra direktiv 2010/63 / EU av Europaparlamentet om vern av dyr som brukes til vitenskapelige formål.

1. In Vitro Visualisering av Cell Cycle Aktivitet i Postnatal cardiomyocytes

  1. Postnatal kardiomyocytt dissosiasjon
    1. Pre-eksperimentelle forberedelser
      1. Forbered kulturmedium (IMDM, 1% penicillin / streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 0,1% β-mercaptoethanol); medium 1: legg FCS til 2%; medium 2: legg FCS til 20%.
      2. Belegge en 96-brønners dyrkningsskål (halv-vekstområde: 15 mm 2) med 0,1% gelatin i PBS-løsning.
    2. hjerte disseksjon
      1. Forbered en petriskål med 15 ml PBS og lagre den på is. Steriliser to pinsett og liten saks ved å sette dem på et tørt glass perle sterilisator. Sacrifice neonatal transgene mus (CAG-EGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) ved halshogging. Åpne thorax, dissekere hjerte ut, som beskrevet i Ehler et al. 2013 (J Vis Exp .; (79). 50154 doi: 10,3791 / 50 154), og overføre den til iskald PBS. Gå videre til neste musen.
      2. Hvis du bruker ikke-homozygote hekkende par, identifisere de transgene hjerter med et fluorescerende mikroskop. Sett hjertene i PBS under et fluorescerende mikroskop. Sjekk for EGFP-anillin uttrykk (Eks .: 488 nm; Em .: 509 nm) og H2B-MCH uttrykk (Eks .: 587 nm; Em .: 610 nm) med riktige filtersett.
    3. kardiomyocytt isolasjon
      1. Distansere de valgte hjerter ved hjelp av neonatal hjertet dissosiasjon kit. Inkuber enzymblandingen 1 ved 37 ° C i 5 minutter. For å få en ml av den endelige enzymblandingen, tilsett 945 mL av enzymet mix 1-55 mL av enzymet mix to.
      2. Overfør opptil 4 hjerter fra P1 - P3 mus eller opp til 2 hjerter fra P4 - P6 mus til en 1,5 ml reaction tube inneholder 1 ml av enzymet blanding og skjær midt i små biter med saks. Overfør løsningen til 15 ml reaksjonsrørene.
      3. Inkuber ved 37 ° C i 15 min. For å maksimalisere kontakt mellom vev og enzymer, sett 15 ml rør nesten horisontalt i inkubatoren. Bland ved pipettering 5 - 10 ganger opp og ned med en 5-ml pipette. Gjenta dette trinnet tre ganger.
      4. Legg 7,5 ml av medium 2 (20% FCS) for å stoppe enzymreaksjonen. Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 70-mikrometer celle sil. Skyll celle sil med 3 ml medium to.
      5. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 x g i 15 min og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 500 ul av medium 1; røde blodcellelysering er ikke nødvendig for videre eksperimenter. Pipetter 10 ul av cellesuspensjonen inn i en celle tellekammer og bestemme antall celler.
      6. For en 96-brønns plate: frø 10.000 celler per brønn i 120 mL av medium 1 (2% FCS). Plasscellene i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) og fortsette umiddelbart til transfeksjon.
  2. Transfeksjon av neonatal cardiomyocytes med sirnas eller miRNAs
    1. Tørk en benk med RNase dekontaminering løsning for å fjerne RNases. Rengjør følgende materiale med RNase dekontaminering løsning: 10-mL, 100 mL, og 200-ul pipetter og en isboks. Tine siRNA lager porsjoner (100 mm) på is.
    2. Forbered 2 mikrometer arbeider bestander av Si / mirnas i redusert serum medium (98 mL av redusert serum medium + 2 mL av siRNA 100 mikrometer lager). Arbeids lager skal brukes samme dag. Frysing er ikke anbefalt.
    3. Tilsett 4 mL av 2 pM lager til 6 mL av redusert serummedium til en 0,5-ml reaksjonsrøret (mengde for en 96-brønners, slutt si / miRNA konsentrasjon i 140 ul: ~ 57 nM). Velge en passende volum for det antall brønner som skal transfekteres med en viss Si / miRNA.
    4. Forbered en mester blanding av transfeksjon reagens. Bruk 10 mL (0,6 mL av transfeksjon reagens + 9,4 mL av redusert serum medium) for hver brønn (96 brønner totalt).
    5. Tilsett si / miRNA bland til transfeksjon reagens mix. Inkuber i 5 min på is. Pipetter 20 ul i hver brønn. Inkuber cellene i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO 2 og deretter erstatte mediet i hver brønn med 120 mL av medium 1. Etter 24 timer eller mer, går du videre til fiksering og immunfluorescens farging.
  3. Fiksering og immunfluorescens farging
    1. Fjern mediet og vask cellene en gang med PBS. Dekk cellene med 4% formaldehyd-oppløsning i 20 min. Ta av formaldehyd løsning og vaske cellene gang med PBS, og deretter dekke dem med PBS for lagring eller gå videre til farging.
    2. Inkuber med primært antistoff (konsentrasjon i henhold til produsentens instruksjoner) i 0,2% Triton-X og 5% esel serum i minst 2 timer.Ved farging for α-actinin (fortynning 1: 400; monoklonalt anti-α-actinin), flekk over natten ved 4 ° C.
    3. Fjern det primære antistoff og vask 3 ganger med PBS. Fortynn det sekundære antistoff i Hoechst oppløsning på 1: 400 og inkuberes i 1 time ved romtemperatur beskyttet mot lys. Fjern antistoff, vask med PBS 3 ganger, og dekker cellene med PBS for lagring ved 4 ° C.
  4. Konfokal video mikroskopi
    1. Bruk en konfokalmikroskop for bildet oppkjøpet. Åpne bildebehandlingsprogrammer. Åpne "A1plus Settings" og merk av i boksene for CH1, CH2, og CH3. Sett Ch1 til DAPI, CH2 å EGFP, CH3 til Cy3, og CH4 til Cy4 ved å klikke på rullegardinmenyen.
      1. For hver kanal, klikk på HV og sett den til 80 ved hjelp av glidebryteren. Sett Offset til 0 ved å bruke glidebryterne, og klikk på "Home" -knappen for å stille pinhole til startposisjon. Sett skannestørrelsen til 1024 x 1024 ved å klikke på rullegardinmenyen.
      2. Klikk optimalisere for å åpne"XYZ Størrelse Setup" vinduet. Sjekk "Perfect voxel" boksen under "Forslag til trinn (z)". Øk laser intensiteter inntil bildet er verken undereksponert eller overeksponert.
        MERK: For eksempel; CH1 (DAPI): 16%, CH2 (EGFP): 12%, Ch3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%. Still Offset for alle kanaler til 0.
    2. Ta bilder med en 20X objektiv (200X forstørrelse). Skanne et stort bilde som består av fliser bilder (f.eks 3 x 3).
      1. I bildebehandlingsprogrammer, gå til "Hent" og velg "Scan stort bilde" fra rullegardinmenyen. Under "Area", velg "nåværende posisjon er øverst i venstre hjørne" fra rullegardinmenyen og sette "Antall felt i X og Y" til 3 x 3. Klikk på "Scan".
  5. bilde~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
    1. Definere antallet cardiomyocyte kjerner ved å telle H2B-Ch signaler og antallet av kardiomyocytter ved å telle α-actinin signaler.
        <li> Klikk på "Mål" og velg "Manuell Measurement" fra rullegardinmenyen. Velg "Teller" fra neste rullegardinmenyen. Klikk på kjerner med H2B-MCH signaler, og dermed merking og telling dem. Gjør det samme for α-actinin-positive celler for å få antallet kardiomyocytter.
    2. Count S / G2 fase cardiomyocytes med atom EGFP-anillin signaler (EGFP-anillin + / H2BmCh + kjerner). Klikk på "Mål" og velg "Manuell Measurement" fra rullegardinmenyen. Velg "Teller" fra neste rullegardinmenyen. Marker kjernene med EGFP-anillin signaler og H2B-MCH signaler ved å klikke på dem.
    3. Tell cardiomyocytes med mitose-spesifikk EGFP-anillin signaler (for eksempel figur 1F og G), for eksempel cytoplasmatic signaler, kontraktile ringer, og midbodies. Klikk på "Mål" og velg "Manuell Measurement" fra rullegardinmenyen. Velg "teller" fra neste pulldown menyen. Mark cardiomyocytes med mitose spesifikke EGFP-anillin signaler (f.eks figur 1F og G), cytoplasmatic signaler, kontraktile ringer, og midbodies ved å klikke på dem.

2. Fastsettelse av Nukleasjon i Voksen cardiomyocytes av Langendorff Dissosiasjon og Tykke vevsdelene

  1. Isolering av voksne cardiomyocytes av Langendorff dissosiasjon
    1. Forberedelser før hjerte disseksjon
      1. Fyll en insulinsprøyte (30-gauge nål) med heparin (20 enheter / g kroppsvekt). Ta tak i mus ved nakkeskinnet. Løft og snu musen bakover for å eksponere magen for injeksjon.
      2. Utfør en intraperitoneal injeksjon. Sett heparinisert musen tilbake inn i buret og vent i minst 15 minutter før du starter hjerte disseksjon. Skyll og lufte Langendorff apparat med 5 - 10 ml av perfusjon buffer (perfusjon buffer: 135 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2.5 mM HEPES, 5 mM glukose og 25 mM BDM i DDH 2 O, juster til pH 7,4 med NaOH).
    2. hjerte disseksjon
      1. Forbered en 10-cm petriskål med kjølt (4 ° C) PBS og plassere den på is. Fyll og ventilere et 1-ml sprøyte som er koblet til en kanyle (20 gauge) med PBS. Fest kanylen med modelleire på grensen av petriskål. Sett kanylen tuppen litt under PBS overflaten.
      2. Offer musen ved halshugging. Tørk magen med 70% etanol løsning. Lag et snitt fra midten av magen til brystbenet med kirurgiske saks. Fjern mellomgulvet og kuttet thorax bilateralt med kirurgiske saks.
      3. Løft og fikse sternum med en 20-gauge nål, åpner brysthulen, og forsiktig tak i hjerte med anatomiske tang. Løft hjerte og fjerne det fra lungene og blodkar ved å kutte karene i utstrømningen kanalen.
        MERK: Å identifisere aorta, plasserer hjerte medsin ventral siden opp. Dette reduserer avstanden mellom begge atriene, så aorta med sine grener kan bli funnet mellom atriene. Avhengig av individuell hjertet arkitektur, kan grenene fjernes hvis rektor grenen av aorta er fortsatt lang nok.
      4. Overfør hjertet til 10-cm petriskål med kjølt PBS (se trinn 2.1.2.1). Cannulate hjertet ved å trekke den stigende aorta på en G20x1 ½ injeksjon kanyle, som ble avstumpet av en oscillerende multiverktøy for å unngå skade på vev. Fest aorta med en tråd på kanylen. Skyll forsiktig hjertet med PBS for å fjerne overflødig blod ved å trykke sprøytestempelet. En liten utvidelse av hjertet skal være synlig.
    3. Langendorff hjerte dissosiasjon
      1. Koble cannulated hjertet raskt til Luer lock adapter på Langendorff perfusjon apparat. Perfuse hjertet med 30 ml oksygenert perfusjon-buffer ved 37 ° C i 5 minutter med en strømningshastighet på en dråpe / s. the strømningshastighet kan tilpasses ved regulering av O 2 strømmen i Langendorff-apparat ved hjelp av trykkreduksjonsventil (trykk mellom 0 og 200 mbar).
      2. Forbered fordøyelsen buffer umiddelbart før bruk: perfusjon buffer med 6 Collage B U, 10.000 enheter Trypsin, og 50 mikrometer CaCl 2. Fjern perfusjon buffer og starte den enzymatiske fordøyelse ved å tilsette 30 ml varm (37 ° C) og oksygenert fordøyelse buffer.
        MERK: Mengden Collage B må titreres avhengig av aktiviteten til ulike grupper.
      3. Regulere strømnings til en hastighet på en dråpe / s og fordøye hjerte for 10 - 13 min. For å unngå forurensning, må du ikke bruke utstrømming igjen. Overfør hjerte til en 10 cm petriskål med 5 ml buffer fordøyelse. Dissekere vev manuelt med tenger ved å holde hjertet med en pinsett og ved hjelp av det andre paret for å rive hjertet i små biter.
        MERK: På dette trinnet, atriene kan skilles, kuttet i småstykkene (med iris saks), og digerert i 30 minutter i 750 mL av fordøyelse buffer i inkubator ved 37 ° C for å oppnå isolerte celler atrielle. For å få rene atrial cardiomyocytes, pipette opp og ned flere ganger med en 1-ml pipette. Stopp enzymreaksjonen ved å tilsette 750 mL av stop-løsning.
      4. Stopp fordøyelsen ved å tilsette 5 ml stopp løsning (perfusjon buffer med 5% FBS og 50 M CaCl 2). Ved hjelp av en serologisk pipette, filtrere cellesuspensjonen gjennom en 100-um celle sil og samle cellene i et 50 ml sentrifugerør. Sentrifuger den filtrerte cellesuspensjonen ved 80 x g i 1 min ved romtemperatur.
      5. Kast supernatanten og forsiktig cellepelleten suspenderes i 10 ml stoppløsning ved anvendelse av en 10 ml serologisk pipette. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 80 x g i 1 min ved romtemperatur.
      6. Etter sentrifugering, kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml kulturmedium (IMDM med 20% FCS, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 50 ug / ml hver av penicillin og streptomycin, og 0,1 mM β-merkaptoetanol) for dyrking. Alternativt går du til trinn 2.2, "immunfluorescens flekker", og fikse cellene.
      7. For fiksering på 24-brønners plater, tallerken 10 000 av de isolerte celler per brønn på 8 ug / ml laminin-belagte dekkglass i 24-brønners plater med 500 ul kulturmedium ved 37 ° C og 5% CO2 i minst 3 h .
  2. Immunfluorescens flekker på Langendorff isolerte cardiomyocytes i suspensjon
    1. Fix Langendorff-isolert kardiomyocytter i 1 ml 4% PFA i PBS, pH 7,4, i 15 minutter ved romtemperatur. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 800 xg i 2 minutter ved romtemperatur, fjerner fiksativ, og vaske cellene to ganger med PBS.
    2. Resuspender de faste kardiomyocytter i 1 ml PBS og enten fortsette med immunofluorescens flekker eller lagre dem i 500 ul PBS per brønn påen 24-brønns plate ved 4 ° C. Overføre en del av cellesuspensjonen (~ 100-200 ul) til et mikrosentrifugerør. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 800 xg i 2 min ved romtemperatur og kast supernatanten.
    3. Permeabilize, blokk, og flekke cellene med primært antistoff mot α-actinin ved å tilsette 200 ul av primært antistoff fortynnet 1: 400 i PBS med 0,2% Triton X-100 og 5% esel serum i 1 time ved romtemperatur.
    4. Sentrifuger ved 800 xg i 2 min ved romtemperatur og kast supernatanten. Vask cellepelleten med PBS og sentrifuger ved 800 xg i 2 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og inkuber i 200 mL av Alexa-Fluor-konjugert sekundært antistoff (anti-mus lgG1) fortynnet 1: 400 i Hoechst fargestoff (arbeidsløsning: 1 pg / ml) i 1 time ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
    5. Sentrifuger ved 800 xg i 2 min ved romtemperatur og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet. Beskytt prøven mot lys. Resuspend cellene i 200-500 ul PBS og overfør 100-300 mL av cellesuspensjonen til en brønn av en mikroskopi kammer. Lukk lokket av kammeret og lagre cellene ved 4 ° C inntil avbildning. Beskytt mot lys.
  3. Analyse av nukleær av Langendorff-isolerte kardiomyocytter
    1. Ta bilder fra α-actinin-farget cardiomyocytes med en 25X objektiv, som tilsvarer en 250x forstørrelse. Tell antall H2B-MCH + kjerner bare i de cardiomyocytes som jevnlig farget av α-actinin og viser typisk stavformet morfologi og derfor antas å være intakt.
    2. Telle minst 100 kardiomyocytter fra tre forskjellige hjerter. Beregn prosenter av mononukleære, binuclear, og trinuclear cardiomyocytes.
      MERK: Vanligvis binuclear celler bør utgjør ca 80 - 90%, mens trinuclear celler og de med større antall kjerner er sjeldne (<1% på Langendorff-isolerte kardiomyocytter, <3% i tykke skiver). Atriale cardiomyocytes er betydelig mindre enn ventrikkel cardiomyocytes. Typisk mononukleære celler utgjør 90% av den totale populasjonen.
  4. Isolasjon, fiksering, og nedfrysing av voksne hjerter som forberedelse til tykke skiver
    1. Montere en perfusjon apparat for fiksering ved å koble en 50 ml sprøyte til en 3-veis stoppekran med en Heidelberger forlengelsesrør og et andre tre-veis stoppekran. Feste sprøyten i et stativ på en slik måte at gjennomstrømnings er aktivert ved hjelp av tyngdekraft. Fylle systemet med 15 ml PBS.
    2. Følg trinn 2.1.2.1-2.1.2.4, "hjerte forberedelse." Koble G20x1 ½ injeksjon kanyle med hjertet til Luer lock adapter av boble-free-PBS-fylt perfusjon apparater og perfuse det med PBS. Fylle systemet med 10 - 15 ml av 4% formaldehyd i PBS, som deretter perfusert gjennom hjertet. Immersion fikse hjertet i 4% formaldehyd løsning over natten.
    3. Sett på 4% formaldehydoppløsning med PBS og vaske hjerte i PBS på en horisontal risteapparat ved 150 rpm i 8 timer ved romtemperatur. Bytte ut PBS med 20% sukkrose-løsning for å dehydrere hjertet over natten ved 4 ° C.
    4. Frys hjertet i cryo-embedding medium i en liten form.
      1. Sett opp et beger fylt med 2-methylbutane og legg den i en boks med tørris. Sett hjerte i en fryseform tidligere halve fylt med cryo innstøpningsmediet og dekke den helt med cryo innstøpningsmediet. Plasser forsiktig formen inn i den kalde beger, hindre kontakt av cryo-innstøpningsmediet med 2-methylbutane. Oppbevar frosset vev ved -80 ° C inntil bruk.
  5. Utarbeidelse av tykke hjerte skiver
    1. Bruk følgende oppsett i en cryotome: et objekt temperatur på -18 til -20 ° C, en kammertemperatur på -21 til -23 ° C, en lysning vinkel på knivholderen på 4 °, og Feather R35 mikrotom kniver.
    2. Ta cryopreserved organ fra frysebeholderen og fikse det på prøveplaten med cryo-innstøpningsmediet hjelp av rask frysing sokkel. Plasser hjertet på en slik måte at snitte begynner på toppen.
    3. Trim bort 50-mikrometer skiver til jevn klippeplanet oppnås og orgelet blir synlig. Klipp 50-mikrometer vevssnitt ved hjelp av cryotome i manuell modus med en langsom hastighet og med stabiliseringsplaten plassert på kniven. Mount stykker på saltbehandlede objektglass. La skivene tørke i 30 minutter ved romtemperatur og lagre skinnene ved -80 ° C eller beis direkte.
  6. Farging av tykke hjerte skiver (kjerner og cellemembraner)
    1. Behandling av hjerte skiver med RNAse A (20 ug / ml) i vaskebuffer (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5, og 50 mM EDTA) i en kyvette i 1 time ved 37 ° C. Inkuber skivene i 0,2% Triton-X i vaskebuffer i 30 minutter ved romtemperatur. Vask skivene to ganger i 5 minutter hver gang i vaskebuffer i en kyvette på enhorisontal rister ved romtemperatur.
    2. Stain over natten med 1 uM TO-PRO3 jodid (642/661) og fluorescein-koblet hvetekim agglutinin (WGA, 1: 100) i vaskebuffer ved 4 ° C. Vask skivene tre ganger i 5 minutter hver med vaskebuffer i kyvetter på en horisontal ryste og dekke dem med polyvinylalkohol monteringsmedium med et anti-fading reagens og et dekkglass.
  7. Bilde oppkjøp
    1. Bruk helst en invertert confocal laser scanning mikroskop utstyrt med en 40X / 1,15 NA vann-dipping objektiv. Søk etter øye for et område innenfor den sektoren som består av langs foret cardiomyocytes; for dette formål, fluorescein-WGA kanal (eks .: 488 nm) er best egnet.
      MERK: Dette trinnet er viktig, som de øvre og nedre grense for de cardiomyocytes bør være synlig i z-stack for senere analyser. Som bildedybden er begrenset til ~ 30 nm og tykkelsen av skiven er 50 um, er det ikke mulig å imalder tverrsnitt av disse cellene (celle-lengde: ~ 120 mikrometer).
    2. Juster oppsettet i bildebehandlingsprogrammer. Åpne bildebehandlingsprogrammer. Åpne A1plus Innstillinger og merk av i boksene for CH2, CH3 og CH4. Sett CH2 å EGFP, CH3 til Alx546, og CH4 til Alx647 ved å klikke på rullegardinmenyen.
      1. For hver kanal, klikk på HV og sett den til 80 ved hjelp av glidebryteren. Sett Offset til 0 ved å bruke glidebryterne. Klikk på "Home" -knappen for å stille inn pinhole til utgangsposisjonen. Sett skannestørrelsen til 1024 x 1024 ved å klikke på nedtrekksmenyen og klikk optimalisere for å åpne "XYZ Size Setup" vinduet. Sjekk "Perfect voxel" boksen under "Forslag til trinn (z)".
    3. Klikk på "live scan" og justere laser intensiteter ved å klikke på glidebryterne på de enkelte kanalene. Sjekk "Z Series" boksen på "ND Acquisition" -vinduet og klikk på "definert av øverste knappen" boksen. Definere den øverste ogknappen på z-stack ved å klikke på de riktige knappene etter justering av fokus på mikroskopet. Still z-trinns bredde til 0,5 um.
      MERK: Dybden av z-stabelen er begrenset av den optiske penetrering i vevet og signal-til-støy-forhold.
    4. Gå til "A1plus Innstillinger" og sett Linje Gjennomsnitt / Integral til 2-4 ved å klikke på rullegardinmenyen. Finjustere laser intensiteter; pinhole bør være så liten som mulig for å bilde i et fokalplan.
  8. Analyse av kjerne
    1. Åpne bildeanalyse programvare og laste z-stack av interesse.
    2. manuelt fastslå kjernedannelse i z-stabler ved å gå gjennom de forskjellige lag i stabelen for å identifisere celler som ligger fullstendig inne i stabelen; Dette er tilfellet når WGA farging er synlig i alle dimensjoner. Tell antall kjerner (de fleste av dem vil være binuclear) og merk den analyserte cellen ved en merknad i programvaren.
      3. <li> Bestem antall CM kjerner (H2B-MCH +) og totalt kjerner (TO-PRO3 +) i 3D rekonstruksjoner for enkeltkanaler (figur 2D). I bildebehandlingsprogrammer, klikk på "Binary" og velg "Define Threshold 3D" fra rullegardinmenyen. Velg fra kanalen nedtrekksmenyen enten Alx546 for antall CM kjerner eller Alx647 for det totale antallet kjerner. Ved å klikke på de aktuelle piler, sette programmet til "Smooth 4x", Clean 1x, og Fyll hullene på. Sjekk "Size" boksen og sett den til 5 mikrometer ved hjelp av glidebryteren. Sett terskelen ved hjelp av glidebryteren til separate objekter vises.
      MERK: Etter bruk av fragmentering, viser resultatene vinduet en tabell med tallfestede arrangementer og en farget fragmentering av bildet. Som noen kjerner direkte kontakt med hverandre, manuelt korrigere den automatiske måleresultatet for dubletter, som ikke kan være riktig atskilt av programvaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å analysere virkningene av sirnas / mirnas på cellesyklusen aktiviteten til barsel cardiomyocytes in vitro, cardiomyocytes av dobbel-transgene Myh6-H2B-MCH / CAG-EGFP-anillin mus ble isolert på postnatal dag 3 (P3) og transfektert med cellesyklus aktivitet fremkallende miR199 5, siRNA p27, og siRNA Fzr1. Sammenlignet med den negative kontroll (figur 1A), bilder av miR199- (figur 1B) og siRNA p27- (figur 1C) transfektert kardiomyocytter viser en induksjon av cellesyklusaktiviteten. I EGFP-anillin musemodell, kan sirnas mot Fzr1 brukes som transfeksjon kontroller, som inhibering av Fzr1 fører til opphopning av EGFP-anillin fusjonsprotein i kjernen av transfekterte celler og et tap av Fzr1 fører til hemming av APC Fzr1. Fzr1 er en kofaktor av anaphase fremmende kompleks E3 ligase, som retter seg mot anillin for Proteasomal degradering. Figur 1D viser en konfokal oversikt bilde av siRNA Fzr1-transfekterte cardiomyocytes 3 dager etter transfeksjon, som indikerer en transfeksjon effektivitet på ~ 45%. Cardiomyocytes som utfører endoreduplication (f.eks etter knockdown av p27 6) viser utelukkende atom EGFP-anillin uttrykk (figur 1E) eller er EGFP-anillin negativ (se diskusjon). De uttrykker ikke EGFP-anillin i M-fase-typisk lokalisering (figur 1F og G), som endoreduplication bare består av en endo-S-fasen (EGFP-anillin-positiv) og en endo-G fase (EGFP-anillin-negative ). I endo-G-fase, er det APC aktiv, noe som resulterer i ubiquitinering og nedbrytning av EGFP-anillin i proteasomet.

Kvantifisering av mono- og binucleated cardiomyocyte partier på voksne stadiet kan utføres enten ved enkelt-celle-nivå etter Langendorff dissosiasjon av Myh6-H2B-MCH transgene hjerter eller i tykke cryoslices av transgene hjerter. Etter den enzymatiske fordøyelse av hjertevevet ved Langendorff-apparat, atriene og ventriklene kan separeres mekanisk og analysert uavhengig av hverandre. Figur 2A viser et representativt bilde av ikke-faste H2B-MCH transgen ventrikkel cardiomyocytes etter Langendorff isolasjon med en høy grad av binucleated cardiomyocytes, som indikert av den kjernefysiske H2B-MCH uttrykk. Derimot, er de fleste av atrial cardiomyocytes mononukleærerte (figur 2B). Som den enzymatiske fordøyelse ikke resulterer i 100% enkeltceller, er mønsteret av kryss-striation åpenbart av α-actinin farging muliggjør diskriminering mellom binucleated kardiomyocytter (kontinuerlig mønster av tverr striation, figur 2C) og celle dubletter. Figur 2D viser et eksempel på identifikasjonen av en binucleated kardiomyocytt inn påhick skive.

3D-rekonstruksjoner av tykke skiver av voksen Myh6-H2B-MCH transgene hjerter kan brukes til å bestemme andelen av cardiomyocyte kjerner under fysiologiske betingelser i vevet. Ved hjelp av 3D-modulen i bildebehandlingsprogrammer, Hoechst-farget kjerner og H2B-MCH-positive kjerner kan oppdages og telles automatisk, som vist i Figur 2E. Det endelige resultatet skal korrigeres manuelt for dubletter, noe som betyr kjerner som direkte berører hverandre, i dette tilfellet. For å analysere kjerneindeks på cardiomyocytes i tykke skiver, er det nødvendig å bla gjennom bunken manuelt, som kjernen ikke nødvendig ligge innenfor en z-planet. WGA farging gir mulighet for påvisning av cellerammer.

Figur 1
Figur 1: Eksempler på InVitro Visualisering av Cell Cycle Aktiviteten i barsel cardiomyocytes etter Transfeksjon med siRNAs. (AD) P3 cardiomyocytes fra EGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH hjerter farget for α-actinin (hvit). Cardiomyocyte kjerner er identifisert av H2B-MCH signal (rødt), cellesyklus aktivitet ved EGFP-anillin signaler (grønn), og kjerner av Hoechst atom fargestoff (blå). (A) P3-kardiomyocytter transfektert med krafse siRNA tjene som negativ kontroll. Baren er 100 mikrometer. (B) P3 cardiomyocytes transfektert med miRNA-199 skjerm betydelig mer EGFP-anillin signaler enn kontrollgruppen (A). Baren er 100 mikrometer. (C) Eksempel på utelukkende atom EGFP-anillin signaler etter transfeksjon med P27 sirnas, indikerer endoreduplication. Baren er 80 mikrometer. (D) Transfeksjon med siRNA mot Fzr1 for bestemmelse av transfeksjonseffektiviteten. Som EGFP-anillin accumulates, antallet EGFP-anillin + kardiomyocytter indikerer transfeksjonseffektiviteten. Baren er 80 mikrometer. (EG) Ulike lokaliseringer av EGFP-anillin (grønn) i cardiomyocytes løpet av cellesyklusen: kjernefysiske lokalisering (pil i E), kontraktile ring (piler i F), og midbody lokalisering (pilen i G). Linjen er 20 mikrometer i (E) og 10 mikrometer i (F og G). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Eksempler for vurdering av Multinucleation av Langendorff Isolering av cardiomyocytes fra H2B-MCH Mus og ved 3D Analyse av tykke skiver. (A, B) Ventrikulær (A) og atrial (B) cardiomyocytes fra hjerter fra voksen H2B-MCH transgene mus etter isolering av Langendorff dissosiasjon. Stolpene er 50 mikrometer. (C) cardiomyocytes fra Myh6-H2B-MCH hjerter farget for α-actinin (grønn). Cardiomyocyte kjerner er identifisert av H2B-MCH signal (rødt). Baren er 10 mikrometer. (D) Binucleated kardiomyocytt i en tykk skive (piler). Cardiomyocyte kjerner er identifisert av H2B-MCH signal (rødt), cellekantlinjer av WGA farging (grønn), og kjerner av ToPro3 (hvit). Baren er 50 mikrometer. (E) Arbeidsflyt for 3D-analyse av binucleation i tykke skiver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er en uenighet om hvorvidt cardiomyocytes er i stand til å oppgi cellesyklus og dele etter skade og under vev homeostase. Verdier for den grunnleggende omsetning på cardiomyocytes har fått i området mellom 1% 1 og 80% 7. Også etter en hjerteskade, har induksjon av cellesyklusaktiviteten og genereringen av nye kardiomyocytter blitt rapportert i randsonen, med verdier mellom 0,0083% til 8 og 25 - 40% 7. Disse uoverensstemmelsene kan delvis forklares med ulike eksperimentelle tilnærminger for å identifisere hjerte kjerner, en prosess som er svært utfordrende på histologiske snitt 9 og under celledeling. Som cardiomyocytes er utsatt for variasjoner av cellesyklusen, er det av avgjørende betydning for å skjelne ekte celledeling fra endoreduplication og acytokinetic mitose, noe som fører til polyploide celler og multinucleated. Tilidentifisering av celledeling, er det nødvendig å visualisere kjennetegnene ved celledeling, slik som kontraktile ringer og midbodies, samt for å bestemme prosentandelen av binucleated kardiomyocytter. Vi har utviklet teknikker for å analysere cellesyklusaktiviteten i kardiomyocytter i detalj, og for å bestemme deres grad av nukleær i isolerte celler eller i tykke seksjoner.

Det er viktig å merke seg at EGFP-anillin system gir direkte bevis for celledeling, gjennom visualisering av en symmetrisk kontraktile ring (figur 1F) og midbody (figur 1G), og indirekte bevis for endoreduplication og acytokinetic mitose. Som tidligere beskrevet, forekomsten av en ensidig inntrengning av den kontraktile ringen er en indikator på binucleation 10, og dette kan observeres med det EGFP-anillin system.

Endoreduplication er foreslått så lenge ingen kontraktile ring eller midbody er observert, noe som gjør beregninger av sannsynligheten for å påvise disse lokaliseringer obligatorisk. Forutsatt et cellesyklusvarighet på 25 timer, en gjennomsnittlig varighet av kontraktile ring synlighet av 20 min, og en midbody varighet av 1 time, bør det være en kontraktile ring i 100 dele EGFP-anillin-positive celler og 4 midbodies. Statistisk sett vil et minimum av 25 EGFP-anillin-positive celler må analyseres for å skille celledeling fra variasjoner av cellesyklusen. Dette nummeret endres tilsvarende som cellesyklus varighet (som ofte er ukjent) øker eller minsker. Dette innebærer også at flertallet av EGFP-anillin signaler vil være nukleær (figur 1E), som M-fase, den eneste fasen med ikke-nukleære lokaliseringene, bare varer i omtrent 1 time.

Under postnatal utvikling tar binucleation sted i mus hjerter og øker til 90% i ventrikkel cardiomyocytes (~ 25% hos mennesker) 11. for analysen av regenerering i hjertet, er det viktig å bestemme graden av binucleation. Vi beskriver to metoder for å håndtere denne viktige morfologiske trekk: nemlig Langendorff dissosiasjon og etablering av tykke deler av hjertevevet. Mens Langendorff isolasjon er enklere og raskere, morfologi av tykke seksjoner er mer tidkrevende, men også mer nøyaktig. Interessant nok har vi funnet at Langendorff isolasjon overvurderer den prosentandel av binuclear kardiomyocytter. Dette kan skyldes ulike overlevelse av mononukleære og binuclear celler i løpet av denne heller stiv prosedyren.

Som induksjon av spredning i postnatal cardiomyocytes er en ny tilnærming i hjerte gjenfødelse, beskriver denne protokollen en screening system ved å kombinere to transgene mus linjer, Myh6-H2BmCh og CAG-EGFP-anillin. Cardiomyocytes isolert fra hjerter på postnatal dager P1 - P6 kan lett dyrkes og transfektert med mirnas ellersirnas eller behandlet med biblioteker av små molekyler. Cardiomyocyte kjerner kan manuelt eller automatisk av programvare algoritmer, og potensielle "treff" kan bestemmes ved en økning i MCH + kjerner nummer. Diskrimineringen av celledeling fra endoreduplication og acytokinetic mitose kan gjøres ved kvantifisering av de forskjellige lokaliseringer av EGFP-anillin signaler. Dette systemet vil kaste nytt lys på reguleringsmekanismer liggende postnatal kardiomyocytt proliferasjon, og kan føre til oppdagelse av nye terapeutiske midler for behandling av hjertesykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt 821472
100 µm cell strainer Becton Dickinson GmbH/Falcon 352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican Braun, Melsungen 4657519
20 gauge needle Becton Dickinson GmbH 301300
24-well plates Becton Dickinson GmbH/Falcon 353047
2-Methyl-butane Carl Roth GmbH + Co. KG 3927.1
37% formaldehyde solution AppliChem GmbH  A0936,1000
3-way stopcock B. Braun Medical Inc. 16494C
50 mL syringe B. Braun Medical Inc. 8728810F
70% ethanol Otto Fischar GmbH 27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody Jackson ImmunoResearch 115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG Sigma-Aldrich, Steinheim A7811
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area Greiner bio-one 675986
Collagenase B Roche 11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E Nikon
cryostat CM 3050S Leica
donkey serum Jackson Immuno Research, Suffolk, GB 017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
EDTA Sigma-Aldrich E4884
fetal calf serum PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%) PanReac AppliChem A3697
Gelatine from porcine skin, Type A Sigma-Aldrich, Steinheim G2500
glass coverslips VWR 631-0146
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Heidelberger extension tube IMPROMEDIFORM GmbH MF 1833
Heparin-Natrium Ratiopharm 5394.02.00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HistoBond microscope slides Marienfeld 0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL) Sigma Aldrich, Taufkirchen B2261
Insulin syringe Becton Dickinson GmbH 300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) Gibco/Life Technologies, Darmstadt 21980-032
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin Corning 354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt 13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey) Jackson ImmunoResearch 715-175-151
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
microcentrifuge tube Sarstedt 72690
Mini shaker VWR 12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p Ambion/Thermo Fischer Scientific 4464066
Biopsy Mold Sakura Finetek/ VWR 4565
M-slide 8-well ibiTreat ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Merck Millipore 567530
negative control(scrambled RNA) Ambion/Thermo Fischer Scientific AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA Gibco/Life Technologies, Darmstad 11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco 51985-026
P21-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies, Darmstadt 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Steinheim 14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading Sigma-Aldrich 10981
RNase A Qiagen 1007885
RNaseZap Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt AM9780
sample containers Vitlab 80731
Serological pipette Greiner 607180
software NIS Elements Nikon
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek/ VWR 25608-930
ToPro3 iodide (642/661) Molecular probes/ThermoFisher Scientific T3605
Tris Sigma-Aldrich T1503
Triton X Fluka 93418
Triton X-100 Fluka 93418
Trypsin Sigma-Aldrich T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled Vector Laboratories VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody Sigma-Aldrich A7811
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Tags

Developmental Biology Hjerteinfarkt biologi kardiomyocytt spredning genetisk forandret mus Cardiac utvikling cellebiologi cellekultur
Visualisering av cellesyklus Variasjoner og Bestemmelse av Nukleasjon i postnatal cardiomyocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D.,… More

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D., Fleischmann, B. K., Hesse, M. Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (120), e55204, doi:10.3791/55204 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter