Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Visualisering af cellecyklus Variationer og Bestemmelse af Kimdannelse i postnatale cardiomyocytter

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Physiology I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Introduction

Den korrekte identifikation af cardiomyocyte kerner og cellecyklus status er af afgørende betydning for bestemmelse af hjertemusklen omsætning og regeneration. Dette gælder især for anvendelsen af ​​nukleare markører, såsom phh3, Ki-67, eller thymidinanaloger, til identifikation cellecyklusaktivitet. Som proliferative kapacitet voksne mammale cardiomyocytter er meget lille 1, en falsk identifikation af en kerne positiv for en proliferationsmarkør af en cardiomyocyte kerne kunne gøre en afgørende forskel i resultatet af en proliferationsassay. Desuden cardiomyocytter er tilbøjelige til variationer i cellecyklussen, såsom endoreduplikation og acytokinetic mitose, som resulterer i polyploide og flerkernede celler frem for i celledeling. Til dette formål fortolkningen af ​​antistof-farvning mod almindelige cellecyklus markører, ikke i alle tilfælde.

Her præsenteres metoder til straight-forwa rd anerkendelse af mus cardiomyocytter og deres nuclearity i native isolerede celler og tykke vævssnit ved postnatal og voksne stadier af utvetydig identifikation af deres kerner. Til dette formål blev en transgen mus linje med cardiomyocyte-specifik ekspression af et fusionsprotein bestående af menneskelige histon H2B og mCherry under kontrol af Myh6 promotor (Myh6-H2B-MCH), der anvendes 2. Krydsbestøvning denne mus linje med en transgen proliferation indikator mus linje, hvori ekspressionen af ​​et eGFP-anillin fusionsproteinet er under kontrol af den allestedsnærværende kylling actinpromotor med en CMV enhancer (CAG-eGFP-anillin), giver mulighed for bestemmelse af cellecyklus status. Stilladset protein anillin udtrykkes specifikt i celle-cyklus aktive celler 3, og dens differential subcellulære lokalisering under cellecyklussen muliggør levende sporing cellecyklusfremadskriden med en høj opløsning på M-faseef "> 4. Derfor er den dobbelte transgene mus kan bruges til at skelne mellem prolifererende cardiomyocytter og dem, der undergår celle-cyklus variationer. Dette beviser især nyttigt i screening for proliferationsinducerende stoffer in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurerne i denne protokol, der involverer dyr var i overensstemmelse med de etiske standarder ved universitetet i Bonn og overholdt retningslinjerne fra direktiv 2010/63 / EU af Europa-Parlamentet om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål.

1. In vitro Visualisering af Cell Cycle Aktivitet i Fødselsdepression cardiomyocytter

  1. Fødselsdepression cardiomyocyte dissociation
    1. Pre-eksperimentelle præparater
      1. Forbered dyrkningsmedier (IMDM, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 0,1% β-mercaptoethanol); medium 1: tilføje FCS til 2%; medium 2: tilføje FCS til 20%.
      2. Coat en 96-brønds dyrkningsplade (halv-vækstområde: 15 mm 2) med 0,1% gelatine i PBS-opløsning.
    2. heart dissektion
      1. Forbered en petriskål med 15 ml PBS og gemme det på is. Sterilisere to pincetter og en lille saks ved at sætte dem i et tørt glas perle sterilisator. Sacrifice neonatal transgene mus (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) ved halshugning. Åbne thorax, dissekere hjerte ud, som beskrevet i Ehler et al. , 2013 (J Vis Exp .; (79):. 50154 doi: 10,3791 / 50154), og overføre den til det iskolde PBS. Gå videre til den næste mus.
      2. Hvis du bruger ikke-homozygote ynglepar, identificere de transgene hjerter med et fluorescerende mikroskop. Sætte hjerter i PBS under et fluorescensmikroskop. Check for eGFP-anillin udtryk (Eks .: 488 nm; Em .: 509 nm) og H2B-MCH-ekspression (Eks .: 587 nm; Em .: 610 nm) med de passende filtersæt.
    3. cardiomyocyte isolation
      1. Dissociere udvalgte hjerter ved hjælp af neonatal hjerte dissociation kit. Inkubér enzymblandingen 1 ved 37 ° C i 5 min. At opnå 1 ml af den endelige enzymblandingen tilsættes 945 pi enzymblanding 1 til 55 pi enzymblanding 2.
      2. Overfør op til 4 hjerter fra P1 - P3 mus eller op til 2 hjerter fra P4 - P6 mus til et 1,5-ml reaction rør indeholdende 1 ml enzymblanding og skæres hjertet i små stykker med en saks. Opløsningen overføres til 15 ml reaktionsrør.
      3. Der inkuberes ved 37 ° C i 15 minutter. For at maksimere kontakten mellem vævet og enzymerne, satte 15 ml rør næsten vandret i inkubatoren. Bland ved pipettering 5 - 10 gange op og ned med en 5-ml pipette. Gentag dette trin tre gange.
      4. Tilføj 7,5 ml medium 2 (20% FCS) for at stoppe enzymreaktionen. Filtrer cellesuspensionen gennem en 70-um cellefilter. Skyl cellesigte med 3 ml medium 2.
      5. Centrifuger cellesuspensionen ved 300 x g i 15 minutter og kassér supernatanten. Pellet resuspenderes i 500 pi medium 1; lyse af røde blodlegemer er ikke påkrævet for yderligere forsøg. Pipetter 10 pi af cellesuspensionen i en celle tællekammer og bestemme antallet af celler.
      6. For en 96-brønds plade: frø 10.000 celler per brønd i 120 pi medium 1 (2% FCS). Placerede celler i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) og fortsæt straks til transfektion.
  2. Transfektion af neonatale cardiomyocytter med siRNAs eller miRNA
    1. Tør en bænk med RNase dekontaminering løsning til at fjerne de RNaser. Rengør følgende materiale med RNase dekontaminering opløsning: 10-pi, 100-pi, og 200-pi pipetter og en is boks. Thaw siRNA lager portioner (100 um) på is.
    2. Forbered 2 um arbejder lagre af Si / miRNA i reduceret serummedium (98 pi reduceret serum medium + 2 pi siRNA 100 uM stamopløsning). Arbejdsgruppen lager skal anvendes samme dag. Nedfrysning kan ikke anbefales.
    3. Tilsæt 4 pi af 2 uM lager til 6 pi reduceret serum medium til en 0,5-ml reaktionsrør (mængde, der er 96-brønd; endelig si / miRNA koncentration i 140 pi: ~ 57 nM). Vælg et passende volumen for det antal brønde, der skal transficeres med en vis si / miRNA.
    4. Forbered en master mix af transfektion reagens. Brug 10 uL (0,6 pi transfektionsreagens + 9,4 pi reduceret serum medium) for hver brønd (96 brønde i alt).
    5. Tilsæt si / miRNA mix til transfektionsreagens mix. Der inkuberes i 5 minutter på is. Pipetter 20 pi til hver brønd. Inkuberes cellerne i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO 2 og derefter erstatte mediet i hver brønd med 120 pi medium 1. Efter 24 timer eller mere, gå videre til fiksering og immunfluorescensfarvning.
  3. Fiksering og immunfluorescensfarvning
    1. Fjern mediet og vask cellerne én gang med PBS. Dæk cellerne med 4% formaldehydopløsning i 20 minutter. Tag formaldehydopløsning og vask cellerne en gang med PBS, og derefter dække dem med PBS til opbevaring eller fortsætte til immunfarvning.
    2. Inkuber med primært antistof (koncentrationen i henhold til producentens anvisninger) i 0,2% Triton-X og 5% donkey serum i mindst 2 timer.Hvis farvning for α-actinin (fortynding 1: 400; monoklonalt anti-α-actinin), bejdse natten over ved 4 ° C.
    3. Fjern det primære antistof og vask 3 gange med PBS. Fortynd det sekundære antistof i Hoechst-opløsning 1: 400 og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur beskyttet mod lys. Fjern antistof, vask med PBS 3 gange, og dækker cellerne med PBS til opbevaring ved 4 ° C.
  4. Konfokal video mikroskopi
    1. Brug en konfokal mikroskop for erhvervelse billedet. Åbn imaging-softwaren. Åbn "A1plus Settings" og markere felterne for CH1, CH2, og CH3. Indstil Ch1 til DAPI, Ch2 til eGFP, CH3 til Cy3, og CH4 til CY4 ved at klikke på rullemenuen.
      1. For hver kanal, skal du klikke på HV og sæt den til 80 ved hjælp af skyderen. Indstil Offset til 0 ved hjælp af skyderne, og klik på knappen "Home" for at indstille pinhole til udgangsposition. Indstil scanning størrelse til 1024 x 1024 ved at klikke på rullemenuen.
      2. Klik optimere at åbne"XYZ Size Setup" vinduet. Afkrydsningsfelt "Perfect Voxel" under "Foreslåede Trin (z)". Forøg laser intensiteter indtil billedet hverken undereksponeret eller overeksponeret.
        BEMÆRK: For eksempel; CH1 (DAPI): 16%, CH2- (eGFP): 12%, CH3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%. Indstil Offset for alle kanaler til 0.
    2. Tag billeder med en 20X mål (200X forstørrelse). Scanne et stort billede, der består af flise billeder (f.eks 3 x 3).
      1. I imaging-softwaren, gå til "Acquire" og vælg "Scan stort billede" fra rullemenuen. Under "Area", vælg "aktuelle position er i øverste venstre hjørne" i rullemenuen og indstil "Antal felter i X og Y" til 3 x 3. Klik på "Scan".
  5. billedanalyse
    1. Definere antallet af cardiomyocyte kerner ved at tælle H2B-Ch signaler og antallet af cardiomyocytter ved tælling α-actinin signaler.
        <li> Klik på "Measure" og vælg "Manuel måling" i rullemenuen. Vælg "Tæller" fra næste rullemenuen. Klik på kerner med H2B-MCH-signaler, og derved mærkning og tælle dem. Gør det samme for α-actinin-positive celler til at få antallet af cardiomyocytter.
    2. Count S / G2 cardiomyocytter fase med nukleare eGFP-anillin signaler (eGFP-anillin + / H2BmCh + kerner). Klik på "Measure" og vælg "Manuel måling" i rullemenuen. Vælg "Tæller" fra næste rullemenuen. Marker kerner med eGFP-anillin signaler og H2B-MCH signaler ved at klikke på dem.
    3. Tæl cardiomyocytter med mitose-specifikke eGFP-anillin signaler (f.eks figur 1F og G), såsom cytoplasmatiske signaler, kontraktile ringe og midbodies. Klik på "Measure" og vælg "Manuel måling" i rullemenuen. Vælg "Tæller" fra næste pulldown menu. Mark cardiomyocytter med mitose-specifik eGFP-anillin signaler (f.eks, figur 1F og G), cytoplasmatisk signaler, kontraktile ringe og midbodies ved at klikke på dem.

2. Bestemmelse af Kimdannelse i Voksen cardiomyocytter ved Langendorff Dissociation og Tykke vævssnit

  1. Isolering af voksne cardiomyocytter ved Langendorff dissociation
    1. Forberedelser før hjerte dissektion
      1. Fyld en insulinsprøjte (30-gauge nål) med heparin (20 enheder / g legemsvægt). Tag fat i musen ved nakken. Løft og drej musen tilbage for at blotlægge maven til injektion.
      2. Udfør en intraperitoneal injektion. Sæt hepariniseret musen tilbage i buret og vent mindst 15 minutter, før du starter hjerte dissektion. Skyl og ventilere Langendorff apparat med 5 - 10 ml perfusion buffer (perfusion buffer: 135 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,5 mM HEPES, 5 mM glucose og 25 mM BDM i Hedeselskabet 2 O, justeres til pH 7,4 med NaOH).
    2. heart dissektion
      1. Forbered en 10 cm petriskål med afkølet (4 ° C) PBS og placere den på is. Fyld og ventilere en 1 ml sprøjte forbundet med en kanyle (20 gauge) med PBS. Fastgør kanylen med modellervoks på grænsen af ​​petriskålen. Anbring kanylespidsen lidt under PBS overflade.
      2. Sacrifice musen ved cervikal dislokation. Tør maven med 70% ethanol-opløsning. Lave et snit fra midten af ​​maven til brystbenet med kirurgiske sakse. Fjern membranen og skære brystkassen bilateralt med kirurgiske sakse.
      3. Løft og løse brystbenet med en 20-gauge kanyle, åbne brysthulen, og forsigtigt fat i hjerte med anatomiske pincet. Løft hjerte og fjerne det fra lungerne og kar ved at skære Kar udstrømning tarmkanalen.
        BEMÆRK: For at identificere aorta, placere hjerte meddens ventrale side op. Dette formindsker afstanden mellem de to forkamre, så aorta med sine grene kan findes mellem atrierne. Afhængig af den enkelte hjerte arkitektur, kan grenene fjernes, hvis den vigtigste gren af ​​aorta er stadig lang nok.
      4. Overfør hjertet til 10 cm petriskål indeholdende kølet PBS (se trin 2.1.2.1). Kanyle hjertet ved at trække den opstigende aorta på en G20x1 ½ injektion kanyle, som blev gjort stumpe med et oscillerende multi-værktøj til at undgå vævsbeskadigelse. Fastgør aorta med en tråd på kanylen. skylles forsigtigt hjertet med PBS for at fjerne overskydende blod ved at trykke sprøjtens stempel. En lille udvidelse af hjertet skal være synlig.
    3. Langendorff hjerte dissociation
      1. Tilslut den kanyle hjerte hurtigt til Luer lock adapter Langendorff perfusion apparatet. Perfundere hjertet med 30 ml oxygeneret perfusion buffer ved 37 ° C i 5 minutter med en strømningshastighed på 1 dråbe / s. the strømningshastighed kan tilpasses ved at regulere O 2 strømmen i Langendorff apparatet ved hjælp af trykreduktionsventil (tryk mellem 0 og 200 mbar).
      2. Forbered fordøjelsen buffer umiddelbart før anvendelse: perfusionsbuffer med 6 U Collagenase B, 10.000 enheder trypsin, og 50 uM CaCl2. Fjern perfusion buffer og starte den enzymatiske fordøjelse ved tilsætning 30 ml varm (37 ° C) og oxygeneret digestionspuffer.
        BEMÆRK: Mængden af ​​collagenase B skal titreres afhængig af aktiviteten af ​​forskellige partier.
      3. Juster flowet til en hastighed på 1 dråbe / s og fordøje hjertet for 10 - 13 min. For at undgå forurening, skal du ikke bruge udstrømningen igen. Overfør hjertet til 10 cm petriskål med 5 ml spaltningsbuffer. Dissekere væv manuelt med pincet ved at holde hjertet med en tang og bruge det andet par at rippe hjertet i små stykker.
        BEMÆRK: I dette trin atrierne kan adskilles, skåret i småstykker (med iris saks), og fordøjet i 30 minutter i 750 pi digestionspuffer i inkubatoren ved 37 ° C for at opnå isolerede atrielle celler. For at få rene atriale cardiomyocytter, pipette op og ned flere gange ved hjælp af en 1-ml pipette. Stop enzymreaktionen ved at tilsætte 750 pi af stop-løsning.
      4. Stop fordøjelse ved tilsætning af 5 ml stopopløsning (perfusion buffer med 5% FBS og 50 uM CaCl2). Ved hjælp af en serologisk pipette foretage cellesuspensionen gennem en 100-um cellefilter og opsamle cellerne i et 50 ml centrifugerør. Centrifugeres den filtrerede cellesuspension ved 80 x g i 1 min ved stuetemperatur.
      5. Supernatanten kasseres, og forsigtigt resuspender cellepelleten i 10 ml stopopløsning anvendelse af en 10 ml serologisk pipette. Centrifuger cellesuspensionen ved 80 x g i 1 min ved stuetemperatur.
      6. Efter centrifugering, supernatanten og udeluk cellerne i 1 ml dyrkningsmedium (IMDM med 20% FCS, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 50 ug / ml hver af penicillin og streptomycin, og 0,1 mM β-mercaptoethanol) til dyrkning. Alternativt, gå videre til trin 2.2, "immunfluorescensfarvning", og fikseres cellerne.
      7. Til fastgørelse på 24-brønds plader, plade 10.000 af de isolerede celler per brønd på 8 pg / ml laminin-overtrukne dækglas i 24-brønds plader med 500 pi dyrkningsmedium ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 3 timer .
  2. Immunofluorescens-farvning på Langendorff-isolerede cardiomyocytter i suspension
    1. Fix Langendorff-isolerede cardiomyocytter i 1 ml 4% PFA i PBS, pH 7,4, i 15 minutter ved stuetemperatur. Centrifuger cellesuspensionen ved 800 xg i 2 min ved stuetemperatur, fjern fiksativ, og vask af cellerne to gange med PBS.
    2. Resuspender de faste cardiomyocytter i 1 ml PBS og enten fortsætte med immunfluorescensfarvning eller opbevare dem i 500 pi PBS per brønd påen 24-brønds plade ved 4 ° C. Overfør en del af cellesuspensionen (~ 100 - 200 pi) til et mikrocentrifugerør. Centrifuger cellesuspensionen ved 800 xg i 2 min ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
    3. Permeabilisere, blok, og plette cellerne med primært antistof mod α-actinin ved tilsætning af 200 pi primært antistof fortyndet 1: 400 i PBS med 0,2% Triton X-100 og 5% donkey serum i 1 time ved stuetemperatur.
    4. Centrifuger ved 800 xg i 2 min ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Vask cellepelleten med PBS og centrifugeres ved 800 xg i 2 min ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og inkuberes i 200 pi Alexa-Fluor-konjugeret sekundært antistof (anti-muse IgG1) fortyndet 1: 400 i Hoechst-farvestof (arbejdsopløsning: 1 ug / ml) i 1 time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
    5. Centrifuger ved 800 xg i 2 min ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Gentag dette trin. Beskytte prøven mod lys. Resuspend cellerne i 200 - 500 pi PBS og overføres der 100 - 300 pi af cellesuspensionen til en brønd i en mikroskopi kammer. Luk låget af kammeret og opbevare cellerne ved 4 ° C indtil billeddannelse. Beskyttes mod lys.
  3. Analyse af nuclearity af Langendorff-isolerede cardiomyocytter
    1. Tag billeder fra α-actinin-farvet cardiomyocytter med en 25X objektiv, svarende til en 250X forstørrelse. Tæl antallet af H2B-MCH + kerner kun i de cardiomyocytter, som regelmæssigt farvet af α-actinin og vise typiske stang formet morfologi og derfor antages at være intakt.
    2. Tæl mindst 100 cardiomyocytter fra tre forskellige hjerter. Beregn procentdele af mononukleære, Binuclear, og trinuclear cardiomyocytter.
      BEMÆRK: Typisk bør Binuclear celler udgør ca. 80 - 90%, mens trinuclear celler og dem med et større antal kerner er sjældne (<1% i Langendorff-isolerede cardiomyocytter, <3% i tykke skiver). Atrielle cardiomyocytter er væsentligt mindre end ventrikulære cardiomyocytter. Typisk mononukleære celler udgør 90% af den samlede befolkning.
  4. Isolation, fiksering, og nedfrysning af voksne hjerter som forberedelse til tykke skiver
    1. Saml en perfusion apparat til fiksering ved at forbinde en 50-ml sprøjte til en 3-vejs stophane med en Heidelberger forlængelsesrør og en anden 3-vejs stophane. Fastgør sprøjten i en stand på en sådan måde, at gennemstrømning er aktiveret ved hjælp af tyngdekraften. Fyld systemet med 15 ml PBS.
    2. Følg trin 2.1.2.1-2.1.2.4, "hjerte forberedelse." Tilslut G20x1 ½ injektionskanyle med hjertet til Luer lock adaptor af boblen, frit PBS-fyldt perfusion apparat og perfundere det med PBS. Fyld systemet med 10 - 15 ml 4% formaldehyd i PBS, som derefter perfunderet gennem hjertet. Immersion fix hjertet i 4% formaldehyd løsning natten over.
    3. Udskift 4% formaldehydopløsning med PBS og vask hjertet i PBS på en horisontal ryster ved 150 rpm i 8 timer ved stuetemperatur. Ombytte PBS med 20% saccharoseopløsning til dehydrering af hjertet natten over ved 4 ° C.
    4. Frys hjertet i kryo-indlejringsmedium i en lille støbeform.
      1. Opsæt et bæger fyldt med 2-methylbutan og læg den i en kasse med tøris. Sæt hjerte i en indefrysning støbeform tidligere halvt fyldt med cryo indlejring medium og dække det helt med cryo indlejring medium. Placer forsigtigt formen i den kolde bæger, forhindrer kontakt af cryo-embedding medium med 2-methylbutan. Opbevar frosne væv ved -80 ° C indtil anvendelse.
  5. Fremstilling af tykke hjerte skiver
    1. Brug følgende setup i en cryotome: et objekt temperatur på -18 til -20 ° C, et kammer temperatur på -21 til -23 ° C, en clearing vinkel på kniven indehaver af 4 °, og Feather R35 mikrotomknive og knive.
    2. Tag den kryopræserverede organ fra indefrysning beholder og ordne det på prøven disken med cryo-embedding medium ved hjælp af hurtig nedfrysning hylden. Placer hjertet på en sådan måde, at sektionering begynder ved toppunktet.
    3. Trim væk 50-um skiver indtil en jævn skæreplan opnås og orglet bliver synlig. Skær 50 um vævssnit ved hjælp af cryotome i manuel tilstand med en langsom hastighed og med anti-roll plade placeret på kniven. Mount skiver på saltvandsbehandlede mikroskopobjektglas. Lad skiverne tørre i 30 minutter ved stuetemperatur og opbevares objektglassene ved -80 ° C eller pletter direkte.
  6. Farvning af tykke hjerte skiver (kerner og cellemembraner)
    1. Behandling af hjerteproblemer skiver med RNAse A (20 ug / ml) i vaskebuffer (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5, og 50 mM EDTA) i en kuvette i 1 time ved 37 ° C. Inkubér skiverne i 0,2% Triton-X i vaskebuffer i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask skiverne to gange i 5 min hver i vaskebuffer i en kuvette på enhorisontal ryster ved stuetemperatur.
    2. Stain natten over med 1 um til-PRO3 iodid (642/661) og fluorescein-koblet hvedekimagglutinin (WGA, 1: 100) i vaskebuffer ved 4 ° C. Vask skiver tre gange i 5 min hver med vaskebuffer i kuvetter på en vandret shaker og dække dem med polyvinylalkohol monteringsmedium med et anti-fading reagens og et dækglas.
  7. Billede erhvervelse
    1. Ideelt set, skal du bruge en omvendt konfokal laser scanning mikroskop udstyret med en 40X / 1,15 NA vand-dypning mål. Søg efter øje for et område i skive, der består af langsgående foret cardiomyocytter; til dette formål, fluorescein-WGA-kanal (Eks .: 488 nm) er bedst egnet.
      BEMÆRK: Dette trin er vigtigt, da de øvre og nedre grænser for cardiomyocytter skal være synlige i z-stakken til senere analyser. Som det billeddannende dybde er begrænset til ~ 30 nm, og tykkelsen af ​​den skive er 50 um, er det ikke muligt at imalder tværsnit af disse celler (celle længde: ~ 120 um).
    2. Juster opsætningen i imaging software. Åbn imaging-softwaren. Åbne A1plus Indstillinger og markere felterne for CH2, CH3, og CH4. Indstil Ch2 at EGFP, CH3 til Alx546, og CH4 til Alx647 ved at klikke på rullemenuen.
      1. For hver kanal, skal du klikke på HV og sæt den til 80 ved hjælp af skyderen. Indstil Offset til 0 ved hjælp af skyderne. Klik på knappen "Home" for at indstille pinhole til udgangspositionen. Indstil scanning størrelse til 1024 x 1024 ved at klikke på rullemenuen og klik optimere for at åbne "XYZ Size Setup" vinduet. Markér feltet "Perfect Voxel" under "Foreslåede Trin (z)".
    3. Klik på "live scan" og justere laser intensiteter ved at klikke på skyderne på de enkelte kanaler. Markér feltet "Z Series" på "ND Acquisition" vinduet og klik på "defineret ved øverste knap" boksen. Definer toppen ogknap af z-stakken ved at klikke på de relevante knapper efter justering af fokus på mikroskopet. Indstil z-trins bredde til 0,5 um.
      BEMÆRK: Dybden af ​​z-stakken er begrænset af den optiske penetration i vævet og signal-til-støj-forhold.
    4. Gå til "A1plus Indstillinger" og indstille linje Average / Integral til 2-4 ved at klikke på rullemenuen. Finjuster laser intensiteter; pinhole bør være så lille som muligt for at billedet i et brændplan.
  8. Analyse af nukleering
    1. Åbn billedet analyse software og indlæse z-stak af interesse.
    2. Manuelt bestemme kernedannelse i z-stakke ved at rulle gennem de forskellige lag af stakken for at identificere celler, der ligger helt inden stakken; dette er tilfældet, når den WGA-farvning er synlig i alle dimensioner. Tæl antallet af kerner (de fleste af dem vil være Binuclear) og markere det analyserede celle ved en anmærkning i softwaren.
      3. <li> Bestem antallet af CM kerner (H2B-MCH +) og totale kerner (TO-PRO3 +) i 3D rekonstruktioner for de enkelte kanaler (figur 2D). I imaging software, klik på "Binary" og vælg "Definer Threshold 3D" fra rullemenuen. Vælg fra kanalen rullemenuen enten Alx546 for antallet af CM kerner eller Alx647 for antallet af totale kerner. Ved at klikke på de relevante pile, indstille programmet til "Smooth 4x", Clean 1x, og Fyld huller på. Markér feltet "Størrelse", og sæt den til 5 um ved hjælp af skyderen. Indstil tærsklen ved hjælp af skyderen, indtil separate objekter vises.
      BEMÆRK: Efter påføring af fragmentering, resultaterne vindue viser en tabel over kvantificerede begivenheder og en farvet fragmentering af billedet. Som nogle kerner direkte kontakt med hinanden, manuelt korrigere automatisk måleresultat for dubletter, som måske ikke korrekt adskilt af softwaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at analysere effekterne af siRNA'er / miRNA på cellecyklus aktivitet postnatale cardiomyocytter in vitro, cardiomyocytter af dobbelt-transgene Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin mus blev isoleret på postnatal dag 3 (P3) og transficeret med cellecyklus aktivitet-fremkaldende miR199 5, siRNA p27, og siRNA Fzr1. Sammenlignet med den negative kontrol (figur 1A), billeder af miR199- (figur 1B) og siRNA p27- (figur 1C) transficerede cardiomyocytter viser en induktion af cellecyklusaktivitet. I EGFP-anillin musemodel, kan siRNAs mod Fzr1 anvendes som transfektions kontroller, som inhibering af Fzr1 fører til akkumulering af eGFP-anillin fusionsproteinet i kernerne i transficerede celler og et tab af Fzr1 fører til inhibering af APC Fzr1. Fzr1 er en cofaktor af anafase-fremmende kompleks E3 ligase, som er rettet mod anillin for proteasomal nedbrydning. Figur 1D viser et konfokalt oversigtsbillede af siRNA Fzr1-transficerede cardiomyocytter 3 dage efter transfektion, hvilket indikerer en transfektionseffektivitet på ~ 45%. Cardiomyocytter der udfører endoreduplikation (fx efter knockdown af p27 6) viser udelukkende nukleare eGFP-anillin udtryk (figur 1E), eller er eGFP-anillin negativ (se diskussionen). De udtrykker ikke eGFP-anillin i M-fase-typiske lokaliseringer (figur 1F og G), som endoreduplikation kun består af en endo-S fase (eGFP-anillin-positiv) og en endo-G fase (eGFP-anillin-negative ). I endo-G fase APC er aktiv, hvilket resulterer i ubiquitinering og nedbrydning af eGFP-anillin i proteasomet.

Kvantificering af mono- og binucleated cardiomyocyte portioner på den voksne fase kan udføres enten på det encellede niveau efter Langendorff dissociation af Myh6-H2B-MCH transgene hjerter eller i tykke cryoslices af transgene hjerter. Efter den enzymatiske fordøjelse af hjertevævet ved Langendorff apparat, atrier og ventrikler kan separeres mekanisk og analyseret uafhængigt af hinanden. Figur 2A viser et repræsentativt billede af ikke-faste H2B-MCH transgene ventrikulære cardiomyocytter efter Langendorff isolation med en høj grad af binucleated cardiomyocytter, som angivet ved den nukleare H2B-MCH-ekspression. Derimod er de fleste af atrial cardiomyocytter mononukleære (figur 2B). Som den enzymatiske fordøjelse ikke resulterer i 100% enkeltceller, mønstret for cross-riller afsløret ved α-actinin farvning letter diskrimination mellem binucleated cardiomyocytter (kontinuerligt mønster af tværgående riller, figur 2C) og celle-dubletter. Figur 2D viser et eksempel på identifikation af en binucleated cardiomyocyte ind påHick skive.

3D rekonstruktioner af tykke skiver af voksent Myh6-H2B-MCH transgene hjerter kan anvendes til at bestemme andelen af ​​cardiomyocyte kerner under fysiologiske betingelser i vævet. Brug af 3D-modulet for imaging software, Hoechst-farvede kerner og kan påvises H2B-MCH-positive kerner og tælles automatisk, som illustreret i figur 2E. Det endelige resultat bør korrigeres manuelt for dubletter, hvilket betyder kerner, der direkte berører hinanden, i dette tilfælde. For at analysere kernedannelse indeks af cardiomyocytter i tykke skiver, er det nødvendigt manuelt at rulle gennem stakken, som kernerne ikke nødvendigt ligge inden en z-planet. WGA-farvning muliggør påvisning af celle- grænserne.

figur 1
Figur 1: Eksempler på InVitro Visualisering af Cell Cycle Aktivitet i postnatale cardiomyocytter efter transfektion med siRNA'er. (AD) P3 cardiomyocytter fra eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH hjerter farvet for α-actinin (hvid). Cardiomyocyte kerner identificeres af H2B-MCH signal (rød), cellecyklus aktivitet ved eGFP-anillin signaler (grøn), og kerner af Hoechst nuklear farvestof (blå). (A) P3 cardiomyocytter transficeret med scramble siRNA tjene som negativ kontrol. Baren er 100 um. (B) P3 cardiomyocytter transficeret med miRNA-199 display betydeligt flere eGFP-anillin signaler end kontrolgruppen (A). Baren er 100 um. (C) Eksempel på udelukkende nukleare eGFP-anillin signaler efter transfektion med P27 siRNA'er, hvilket indikerer endoreduplikation. Baren er 80 um. (D) Transfektion med siRNA mod Fzr1 til bestemmelse af transfektionseffektiviteten. Som eGFP-anillin ackumulerer, antallet af eGFP-anillin + cardiomyocytter viser transfektionseffektiviteten. Baren er 80 um. (EG) Forskellige lokaliseringer af eGFP-anillin (grøn) i cardiomyocytter under cellecyklus: nukleare lokalisering (pil i E), kontraktile ring (pile i F), og midterstykke lokalisering (pil i G). Linjen er 20 um i (E) og 10 um i (F og G). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Eksempler på vurdering af multinukleation ved Langendorff Isolering af cardiomyocytter fra H2B-MCH mus og ved 3D Analyse af tykke skiver. (A, B) Ventrikulær (A) og atrial (B) cardiomyocytter fra hjerter fra voksne H2B-MCH transgene mus efter isolering ved Langendorff dissociation. Søjlerne er 50 um. (C) cardiomyocytter fra Myh6-H2B-MCH hjerter farvet for α-actinin (grøn). Cardiomyocyte kerner identificeres af H2B-MCH signal (rød). Baren er 10 um. (D) Binucleated cardiomyocyte i en tyk skive (pile). Cardiomyocyte kerner identificeres af H2B-MCH signal (rød), cellekanter af WGA farvning (grøn), og kerner fra ToPro3 (hvid). Baren er 50 um. (E) Workflow for 3D-analyse af binucleation i tykke skiver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er en uenighed om, hvorvidt cardiomyocytter er i stand til at indtaste hele cellecyklus og dele efter skade og under vævshomeostase. Værdier for den grundlæggende omsætning af cardiomyocytter har fået i området mellem 1% 1 og 80% 7. Også efter en kardiel læsion, har induktionen af cellecyklus aktivitet og fremme af nye cardiomyocytter blevet rapporteret i grænseområdet, med værdier mellem 0,0083% 8 og 25 - 40% 7. Disse afvigelser kan til dels forklares ved forskellige eksperimentelle metoder til at identificere hjerte-kerner, en proces, der er meget udfordrende på histologiske snit 9 og under celledeling. Som cardiomyocytter er tilbøjelige til variationer af cellecyklussen, er det af afgørende betydning at skelne ægte celledeling fra endoreduplikation og acytokinetic mitose, hvilket fører til polyploide og flerkernede celler. Tilidentifikation af celledeling, er det nødvendigt at visualisere kendetegnende for celledeling, såsom kontraktile ringe og midbodies, samt at bestemme procentdelen af ​​binucleated cardiomyocytter. Vi har udviklet teknikker til at analysere cellecyklus aktivitet i cardiomyocytter i detaljer og til at bestemme deres grad af nuclearity i isolerede celler eller i tykke sektioner.

Det er vigtigt at bemærke, at EGFP-anillin system giver direkte bevis for celledeling, gennem visualisering af en symmetrisk kontraktile ring (figur 1F) og midterskroget (figur 1G), og indirekte bevis for endoreduplikation og acytokinetic mitose. Som tidligere beskrevet, forekomsten af en ensidig indtrængning af den kontraktile ring er en indikator for binucleation 10, og dette kan observeres med EGFP-anillin system.

Endofordobling foreslås så længe ingen kontraktile ring eller midbody overholdes, hvilket gør beregningerne af sandsynlighederne for at opdage disse lokaliseringer obligatorisk. Antages en celle cyklus varighed på 25 timer, en gennemsnitlig varighed på kontraktile ring synlighed på 20 minutter, og en midterskrog vedvarende 1 time, bør der være en kontraktile ring i 100 dividere eGFP-anillin-positive celler og 4 midbodies. Statistisk set vil mindst 25 eGFP-anillin-positive celler skal analyseres for at skelne celledeling fra variationer af cellecyklus. Dette tal ændrer derfor som varigheden celle cyklus (som ofte er ukendt) stiger eller falder. Dette indebærer også, at størstedelen af eGFP-anillin signaler vil være nukleart (fig 1E), som M-fase, den eneste fase med ikke-nukleare lokaliseringer, varer kun ca. 1 time.

Under postnatal udvikling, binucleation foregår i mus hjerter og stiger til 90% i ventrikulære cardiomyocytter (~ 25% hos mennesker) 11. for analysen af ​​regenerering i hjertet, er det vigtigt at bestemme graden af ​​binucleation. Vi beskriver to metoder til at løse denne vigtige morfologiske træk: nemlig Langendorff dissociation og oprettelsen af ​​tykke sektioner af hjertevæv. Mens Langendorff isolation er nemmere og hurtigere, morfologi tykke sektioner er mere tidskrævende, men også mere nøjagtige. Interessant nok har vi fundet, at Langendorff isolation overvurderer procentdelen af ​​Binuclear cardiomyocytter. Dette kan skyldes forskellige overlevelsesrater for mononukleære og Binuclear celler under denne temmelig stiv procedure.

Som induktion af proliferation i postnatal cardiomyocytter er en spirende tilgang i hjertets regenerering, denne protokol beskriver en screening-system ved at kombinere to transgene mus linjer, Myh6-H2BmCh og CAG-eGFP-anillin. Cardiomyocytter isoleret fra hjerter på postnatal dag P1 - P6 kan let dyrkes og transficeret med miRNA ellersiRNAs eller behandlet med biblioteker af små molekyler. Cardiomyocyte kerner kan manuelt eller automatisk af softwarealgoritmer, og potentielle "hits" kan bestemmes ved en stigning i MCH + kerner nummer. Diskriminering af celledeling fra endoreduplikation og acytokinetic mitose kan gøres ved kvantificering af de forskellige lokaliseringer af EGFP-anillin signaler. Dette system bør kaste nyt lys på reguleringsmekanismer underliggende postnatal cardiomyocyte spredning og kan føre til opdagelsen af ​​nye terapeutiske midler til behandling af hjertesygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt 821472
100 µm cell strainer Becton Dickinson GmbH/Falcon 352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican Braun, Melsungen 4657519
20 gauge needle Becton Dickinson GmbH 301300
24-well plates Becton Dickinson GmbH/Falcon 353047
2-Methyl-butane Carl Roth GmbH + Co. KG 3927.1
37% formaldehyde solution AppliChem GmbH  A0936,1000
3-way stopcock B. Braun Medical Inc. 16494C
50 mL syringe B. Braun Medical Inc. 8728810F
70% ethanol Otto Fischar GmbH 27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody Jackson ImmunoResearch 115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG Sigma-Aldrich, Steinheim A7811
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area Greiner bio-one 675986
Collagenase B Roche 11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E Nikon
cryostat CM 3050S Leica
donkey serum Jackson Immuno Research, Suffolk, GB 017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
EDTA Sigma-Aldrich E4884
fetal calf serum PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%) PanReac AppliChem A3697
Gelatine from porcine skin, Type A Sigma-Aldrich, Steinheim G2500
glass coverslips VWR 631-0146
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Heidelberger extension tube IMPROMEDIFORM GmbH MF 1833
Heparin-Natrium Ratiopharm 5394.02.00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HistoBond microscope slides Marienfeld 0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL) Sigma Aldrich, Taufkirchen B2261
Insulin syringe Becton Dickinson GmbH 300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) Gibco/Life Technologies, Darmstadt 21980-032
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin Corning 354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt 13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey) Jackson ImmunoResearch 715-175-151
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
microcentrifuge tube Sarstedt 72690
Mini shaker VWR 12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p Ambion/Thermo Fischer Scientific 4464066
Biopsy Mold Sakura Finetek/ VWR 4565
M-slide 8-well ibiTreat ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Merck Millipore 567530
negative control(scrambled RNA) Ambion/Thermo Fischer Scientific AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA Gibco/Life Technologies, Darmstad 11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco 51985-026
P21-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies, Darmstadt 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Steinheim 14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading Sigma-Aldrich 10981
RNase A Qiagen 1007885
RNaseZap Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt AM9780
sample containers Vitlab 80731
Serological pipette Greiner 607180
software NIS Elements Nikon
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek/ VWR 25608-930
ToPro3 iodide (642/661) Molecular probes/ThermoFisher Scientific T3605
Tris Sigma-Aldrich T1503
Triton X Fluka 93418
Triton X-100 Fluka 93418
Trypsin Sigma-Aldrich T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled Vector Laboratories VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody Sigma-Aldrich A7811
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Tags

Developmental Biology myokardie biologi cardiomyocyte spredning Genetisk ændrede mus Cardiac udvikling Cellebiologi Cell kultur
Visualisering af cellecyklus Variationer og Bestemmelse af Kimdannelse i postnatale cardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D.,… More

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D., Fleischmann, B. K., Hesse, M. Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (120), e55204, doi:10.3791/55204 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter