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Developmental Biology

प्रसव के बाद cardiomyocytes में कोशिका चक्र बदलाव के दृश्य और Nucleation का निर्धारण

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Physiology I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Introduction

cardiomyocyte नाभिक और कोशिका चक्र स्थिति की सही पहचान के हृदय की मांसपेशी कारोबार और उत्थान के निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। इस तरह के pHH3, की-67, या Thymidine analogs के रूप में परमाणु मार्कर, कोशिका चक्र गतिविधि की पहचान करने के लिए, के उपयोग के लिए विशेष रूप से सच है। के रूप में वयस्क स्तनधारी cardiomyocytes के proliferative क्षमता बहुत छोटी सी 1, एक नाभिक एक cardiomyocyte नाभिक के प्रसार मार्कर प्रसार परख के परिणाम में एक महत्वपूर्ण अंतर कर सकता है के लिए सकारात्मक का एक झूठी पहचान है। इसके अलावा, इस तरह के cardiomyocytes endoreduplication और acytokinetic बँटवारा के रूप में सेल चक्र में बदलाव, जो polyploid और multinucleated कोशिकाओं में बजाय कोशिका विभाजन में परिणाम की संभावना है। यह अंत करने के लिए, आम सेल चक्र मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला की व्याख्या के सभी मामलों में निर्णायक नहीं है।

यहाँ, हम सीधे-forwa के लिए तरीके प्रस्तुत माउस cardiomyocytes के आरडी मान्यता और उनके नाभिक की स्पष्ट पहचान के द्वारा प्रसव के बाद और वयस्क चरणों में देशी अलग कक्षों और मोटी ऊतक वर्गों में उनकी nuclearity। उस प्रयोजन के लिए, एक संलयन Myh6 प्रमोटर (Myh6-H2B-एमसीएच) के नियंत्रण में मानव हिस्टोन H2B और mCherry से मिलकर प्रोटीन की cardiomyocyte विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन 2 इस्तेमाल किया गया था। एक ट्रांसजेनिक प्रसार सूचक माउस लाइन के साथ इस माउस लाइन, जिसमें एक EGFP-anillin संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति एक सीएमवी बढ़ाने के साथ सर्वव्यापी चिकन actin प्रमोटर के नियंत्रण में है क्रॉस-प्रजनन (सीएजी-EGFP-anillin), के लिए अनुमति देता है सेल चक्र स्थिति का निर्धारण। मचान प्रोटीन anillin विशेष रूप से सक्रिय कोशिकाओं 3 सेल चक्र में व्यक्त किया जाता है, और सेल चक्र के दौरान अपने अंतर subcellular स्थानीयकरण एम चरण के एक उच्च संकल्प के साथ लाइव-ट्रैकिंग सेल चक्र प्रगति के लिए अनुमति देता हैएफई "> 4। इसलिए, डबल ट्रांसजेनिक चूहों proliferating cardiomyocytes और उन है कि सेल चक्र से गुजरना रूपों के बीच भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह इन विट्रो में प्रसार उत्प्रेरण पदार्थों के लिए स्क्रीनिंग में विशेष रूप से उपयोगी साबित होता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल के जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं बॉन विश्वविद्यालय की नैतिक मानकों के अनुसार में थे और वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल जानवरों के संरक्षण पर निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संसद के यूरोपीय संघ से दिशा-निर्देशों का पालन किया।

1. प्रसव के बाद cardiomyocytes में कोशिका चक्र गतिविधि के इन विट्रो दृश्य में

  1. प्रसव के बाद cardiomyocyte हदबंदी
    1. पूर्व प्रयोगात्मक की तैयारी
      1. संस्कृति मीडिया (IMDM, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 0.1% β-mercaptoethanol) तैयार करें; मध्यम 1: 2% से जोड़ने एफसीएस; मध्यम 2: 20% करने के लिए जोड़ एफसीएस।
      2. कोट एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान (आधा विकास क्षेत्र: 15 मिमी 2) पीबीएस समाधान में 0.1% जिलेटिन के साथ।
    2. हार्ट विच्छेदन
      1. पीबीएस के 15 एमएल के साथ एक पेट्री डिश तैयार है और बर्फ पर दुकान। उन्हें एक सूखी गिलास मनका अजीवाणु में डालने से दो चिमटी और छोटे कैंची जीवाणुरहित। कत्ल द्वारा नवजात ट्रांसजेनिक चूहों (सीएजी-EGFP-anillin / Myh6-H2B-एमसीएच) बलिदान। छाती खोलें, Ehler एट अल में वर्णित के रूप में दिल काटना। 2013 (जम्मू विज़ भूत .; (79):। 50154 डोई: 10.3791 / 50154), और ठंडा पीबीएस को हस्तांतरण। अगले माउस पर जाएं।
      2. गैर homozygous प्रजनन जोड़े का उपयोग करते हैं, तो एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ ट्रांसजेनिक दिलों की पहचान। एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे पीबीएस में दिल रखो। EGFP-anillin अभिव्यक्ति के लिए चेक (पूर्व .: 488 एनएम, उन्हें .: 509 एनएम) और H2B-एमसीएच अभिव्यक्ति (पूर्व .: 587 एनएम, उन्हें .: 610 एनएम) उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ।
    3. cardiomyocyte अलगाव
      1. नवजात दिल हदबंदी किट का उपयोग करके चयनित दिलों अलग कर देना। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम मिश्रण 1 सेते हैं। अंतिम एंजाइम मिश्रण के 1 एमएल प्राप्त करने के लिए, एंजाइम मिश्रण 2 के 55 μL एंजाइम मिश्रण 1 के 945 μL जोड़ें।
      2. एक 1.5 एमएल आर पी 6 को चूहों - पी 4 से 2 दिलों को पी 3 चूहों या ऊपर - P1 से 4 दिलों को हस्तांतरणeaction एंजाइम मिश्रण के 1 एमएल युक्त ट्यूब और कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में दिल काटा। 15 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में समाधान स्थानांतरण।
      3. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ऊतक और एंजाइमों के बीच संपर्क को अधिकतम करने के लिए, इनक्यूबेटर में लगभग क्षैतिज 15 मिलीलीटर ट्यूब डाल दिया। 10 बार ऊपर और नीचे एक 5 एमएल विंदुक के साथ - 5 pipetting द्वारा मिक्स। इस कदम के तीन बार दोहराएँ।
      4. मध्यम 2 (20% एफसीएस) के 7.5 एमएल एंजाइम की प्रतिक्रिया को रोकने के लिए जोड़ें। एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर। मध्यम 2 का 3 एमएल के साथ सेल झरनी कुल्ला।
      5. 15 मिनट के लिए 300 × छ पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मध्यम 1 के 500 μL में गोली Resuspend; लाल रक्त सेल आगे के प्रयोगों के लिए आवश्यक नहीं है। एक सेल गिनती चैम्बर में सेल निलंबन के pipet 10 μL और कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण।
      6. बीज मध्यम 1 के 120 μL (2% एफसीएस) में अच्छी तरह से प्रति 10,000 कोशिकाओं: एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए। जगहएक मशीन में कोशिकाओं (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) और अभिकर्मक के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  2. siRNAs या miRNAs के साथ नवजात cardiomyocytes के अभिकर्मक
    1. RNase परिशोधन समाधान के साथ एक बेंच साफ कर लें RNases हटा दें। साफ RNase परिशोधन समाधान के साथ निम्न सामग्री: 10 μL, 100 μL, और 200 μL pipettes और एक आइस बॉक्स। बर्फ पर पिघलना siRNA शेयर aliquots (100 माइक्रोन) के।
    2. कम सीरम मध्यम (कम सीरम मध्यम + 2 siRNA के μL 100 माइक्रोन के शेयर के 98 μL) में सी / miRNAs की 2 माइक्रोन से काम कर रहा शेयरों तैयार करें। काम कर शेयर एक ही दिन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। बर्फ़ीली सिफारिश नहीं है।
    3. (;: ~ 57 एनएम 140 μL में अंतिम सी / miRNA एकाग्रता एक 96 अच्छी तरह से करने के लिए राशि) 4 μL 2 माइक्रोन शेयर की एक 0.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए कम सीरम माध्यम के 6 μL जोड़ें। कुओं की संख्या के लिए एक उचित मात्रा एक निश्चित सी / miRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा करने के लिए चुनें।
    4. अभिकर्मक अभिकर्मक के एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। 10 μL अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए (अभिकर्मक अभिकर्मक + 9.4 कम सीरम माध्यम की μL का 0.6 μL) (96 कुओं कुल) का प्रयोग करें।
    5. Si जोड़ें / miRNA अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए मिश्रण। बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। Pipet 20 प्रत्येक कुएं में μL। 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और फिर मध्यम 1. 120 μL के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक में मध्यम जगह 24 घंटे या उससे अधिक के बाद निर्धारण और immunofluorescence धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें।
  3. फिक्सेशन और immunofluorescence धुंधला
    1. मध्यम निकालें और पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। 20 मिनट के लिए 4% formaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं को कवर। formaldehyde समाधान उतारो और पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें, और फिर भंडारण के लिए पीबीएस के साथ उन्हें कवर या immunostaining करने के लिए आगे बढ़ें।
    2. कम से कम 2 घंटे के लिए 0.2% में ट्राइटन एक्स और 5% गधा सीरम (निर्माता के निर्देशों के अनुसार एकाग्रता) प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।अगर α-actinin के लिए धुंधला (कमजोर पड़ने 1: 400, मोनोक्लोनल विरोधी α-actinin), दाग रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। Hoechst समाधान 1 में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला: 400 और आरटी पर 1 घंटे प्रकाश से सुरक्षित लिए सेते हैं। एंटीबॉडी निकालें, पीबीएस 3 बार से धो लें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कवर किया।
  4. Confocal माइक्रोस्कोपी वीडियो
    1. छवि अधिग्रहण के लिए एक confocal खुर्दबीन का प्रयोग करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें। "A1plus सेटिंग्स" खोलें और CH1, CH2, और CH3 के लिए बक्से की जाँच करें। लटकते मेनू पर क्लिक करके DAPI, CH2 EGFP, CH3 Cy3 करने के लिए, और Ch4 को Cy4 करने के लिए Ch1 सेट करें।
      1. प्रत्येक चैनल के लिए, एचवी पर क्लिक करें और 80 को यह स्लाइडर पट्टी का उपयोग करके निर्धारित किया है। स्लाइडर सलाखों का उपयोग करके ऑफसेट 0 करने के लिए सेट करें, और घर की स्थिति को पिनहोल स्थापित करने के लिए "होम" बटन पर क्लिक करें। लटकते मेनू पर क्लिक करके 1024 x 1024 को आकार स्कैन सेट करें।
      2. खोलने के लिए अनुकूलन के लिए क्लिक करें"XYZ आकार सेटअप" खिड़की। "सुझाए गए कदम (जेड)" के तहत "बिल्कुल सही Voxel" बॉक्स की जाँच करें। लेजर की तीव्रता में वृद्धि जब तक तस्वीर को न तो है और न ही अंडरएक्स्पोज़ overexposed है।
        नोट: उदाहरण के लिए, Ch1 (DAPI): 16%, CH2 (EGFP): 12%, CH3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%। 0 करने के लिए सभी चैनलों के लिए ऑफसेट सेट।
    2. एक 20x उद्देश्य (200x बढ़ाई) का उपयोग कर तस्वीरें ले लो। टाइल छवियों से मिलकर एक बड़ी छवि के लिए स्कैन (जैसे, 3 एक्स 3)।
      1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, "अधिग्रहण" और लटकते मेनू से "बड़ी छवि के लिए स्कैन" का चयन करने के लिए जाना। के तहत "क्षेत्र," चयन लटकती मेनू से "मौजूदा स्थिति ऊपरी बाएँ कोने में है" और स्थापित करने के लिए 3 एक्स 3. क्लिक करें "एक्स और वाई में खेतों की संख्या" "स्कैन।"
  5. छवि विश्लेषण
    1. H2B-चौधरी संकेतों और α-actinin संकेतों की गणना के द्वारा cardiomyocytes की संख्या की गणना के द्वारा cardiomyocyte नाभिक की संख्या को परिभाषित करें।
        <li> "उपाय" पर क्लिक करें और लटकते मेनू से "मैनुअल माप" चुनें। अगले लटकती मेनू से "मायने रखता है" चुनें। H2B-एमसीएच संकेतों के साथ नाभिक पर क्लिक करें, जिससे अंकन और उन्हें गिनती। cardiomyocytes की संख्या प्राप्त करने के लिए α-actinin पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए एक ही मत करो।
    2. गणना एस / परमाणु EGFP-anillin संकेतों (EGFP-anillin + / H2BmCh + नाभिक) के साथ G2 चरण cardiomyocytes। "उपाय" पर क्लिक करें और लटकते मेनू से "मैनुअल माप" चुनें। अगले लटकती मेनू से "मायने रखता है" चुनें। उन पर क्लिक करके EGFP-anillin संकेतों और H2B-एमसीएच संकेतों के साथ मार्क नाभिक।
    3. ऐसे cytoplasmatic का संकेत है, सिकुड़ा अंगूठियां, और midbodies के रूप में बँटवारा विशेष EGFP-anillin संकेतों (जैसे, चित्रा 1F और जी), के साथ cardiomyocytes गणना। "उपाय" पर क्लिक करें और लटकते मेनू से "मैनुअल माप" चुनें। अगले पुल से "मायने रखता है" चुनेंldown मेनू। मार्क उन पर क्लिक करके बँटवारा विशेष EGFP-anillin संकेतों (जैसे, चित्रा 1F और जी), cytoplasmatic का संकेत है, सिकुड़ा अंगूठियां, और midbodies साथ cardiomyocytes।

Langendorff हदबंदी और मोटी ऊतक वर्गों द्वारा वयस्क cardiomyocytes में Nucleation का निर्धारण 2.

  1. Langendorff हदबंदी से वयस्क cardiomyocytes के अलगाव
    1. दिल विच्छेदन से पहले तैयारी
      1. एक इंसुलिन सिरिंज (30 गेज सुई) हेपरिन के साथ (20 इकाइयों / जी शरीर के वजन) भरें। गर्दन के कूड़ा द्वारा माउस समझ। लिफ्ट और इंजेक्शन के लिए पेट को बेनकाब करने के लिए माउस बारी पीछे की ओर।
      2. एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करना। heparinized माउस पिंजरे में वापस रखो और दिल विच्छेदन शुरू करने से पहले इंतजार में कम से कम 15 मिनट। कुल्ला और 5 के साथ Langendorff तंत्र हवादार - (10 छिड़काव बफर एमएल छिड़काव बफर: 135 मिमी NaCl, 4 मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2, 2.5 मिमी HEPES, 5 मिमी ग्लूकोज, और DDH 2 हे में 25 मिमी BDM, NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित)।
    2. हार्ट विच्छेदन
      1. ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश तैयार है और बर्फ पर जगह है। भरें और एक 1 एमएल पीबीएस के साथ एक प्रवेशनी (20 गेज) से जुड़े सिरिंज हवादार। पेट्री डिश की सीमा पर क्ले मॉडलिंग के साथ प्रवेशनी को ठीक करें। प्रवेशनी टिप थोड़ा पीबीएस सतह के नीचे रखें।
      2. ग्रीवा अव्यवस्था से माउस बलिदान। 70% इथेनॉल समाधान के साथ पेट साफ कर लें। शल्य कैंची के साथ उरोस्थि के मध्य पेट से एक चीरा। डायाफ्राम निकालें और शल्य कैंची के साथ द्विपक्षीय छाती काटा।
      3. लिफ्ट और एक 20 गेज सुई के साथ उरोस्थि ठीक, वक्ष गुहा खुला, और धीरे संरचनात्मक संदंश के साथ दिल समझ। दिल लिफ्ट और बहिर्वाह पथ की वाहिकाओं काटने से फेफड़े और वाहिका से हटा दें।
        ध्यान दें: महाधमनी की पहचान करने के लिए, के साथ दिल की स्थितिअपने उदर पक्ष अप। यह दोनों के बीच की दूरी कम हो जाती है अटरिया, तो इसकी शाखाओं के साथ महाधमनी अटरिया के बीच पाया जा सकता है। व्यक्ति के हृदय वास्तुकला के आधार पर, शाखाओं यदि महाधमनी के प्रिंसिपल शाखा अभी भी काफी लंबा है हटाया जा सकता है।
      4. ठंडा पीबीएस युक्त 10 सेमी पेट्री डिश के लिए दिल स्थानांतरण (कदम 2.1.2.1 देखें)। एक G20x1 आधा इंजेक्शन प्रवेशनी, जो एक oscillating बहु उपकरण के द्वारा पा लिया गया था ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए पर आरोही महाधमनी खींच कर दिल Cannulate। प्रवेशनी पर एक धागे के साथ महाधमनी को ठीक करें। धीरे पीबीएस के साथ दिल कुल्ला सिरिंज सवार धक्का द्वारा अतिरिक्त रक्त हटा दें। दिल की एक मामूली वृद्धि दिखाई जानी चाहिए।
    3. Langendorff दिल हदबंदी
      1. Langendorff छिड़काव उपकरण पर Luer ताला एडाप्टर के लिए तेजी से cannulated दिल जुड़ें। 1 बूंद / एस के प्रवाह की दर के साथ 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीजन छिड़काव बफर के 30 एमएल के साथ दिल छिड़कना। गुई प्रवाह की दर के दबाव को कम करने के वाल्व (0 और 200 के बीच मिलीबार दबाव) का उपयोग Langendorff तंत्र के भीतर हे 2 प्रवाह को विनियमित द्वारा रूपांतरित किया जा सकता है।
      2. साथ 6 यू कोलेजिनेस बी, 10,000 इकाइयों trypsin, और 50 माइक्रोन के 2 CaCl छिड़काव बफर: उपयोग करने से पहले तुरंत पाचन बफर तैयार करें। छिड़काव बफर निकालें और गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) और ऑक्सीजन पाचन बफर के 30 एमएल जोड़कर enzymatic पाचन शुरू करते हैं।
        नोट: कोलेजिनेस बी की राशि विभिन्न बैचों की गतिविधि पर निर्भर करता है titrated किया जाना चाहिए।
      3. 1 बूंद / एस की दर के लिए प्रवाह को समायोजित और 10 के लिए दिल को पचाने - 13 मिनट। संक्रमण से बचने के लिए, फिर तपका प्रयोग नहीं करते। पाचन बफर के 5 एमएल के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए दिल स्थानांतरण। संदंश की एक जोड़ी के साथ दिल पकड़ रहा है और छोटे टुकड़ों में दिल चीर करने के लिए अन्य जोड़ी का उपयोग करके संदंश के साथ मैन्युअल ऊतक काटना।
        नोट: इस चरण में, अटरिया अलग किया जा सकता है, छोटे में कटौतीटुकड़े (परितारिका कैंची के साथ), और इनक्यूबेटर में पाचन बफर के 750 μL में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आदेश पृथक आलिंद कोशिकाओं को प्राप्त करने में पच। एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग कर शुद्ध आलिंद cardiomyocytes, pipet ऊपर और नीचे कई बार मिलता है। स्थान पर समाधान के 750 μL जोड़कर एंजाइम की प्रतिक्रिया बंद करो।
      4. स्थान पर समाधान के 5 एमएल (5% FBS और 50 माइक्रोन के CaCl 2 के साथ छिड़काव बफर) जोड़कर पाचन बंद करो। एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर और एक 50-एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 80 XG पर फ़िल्टर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
      5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे से एक 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग रोकने के समाधान के 10 एमएल में सेल गोली resuspend। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 80 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
      6. Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 20% एफसी के साथ संस्कृति के माध्यम से (IMDM के 1 एमएल में कोशिकाओं resuspendएस, 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, संवर्धन के लिए 50 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.1 मिमी β-mercaptoethanol के प्रत्येक)। वैकल्पिक रूप से, कदम के लिए 2.2, "immunofluorescence धुंधला," और ठीक कोशिकाओं आगे बढ़ें।
      7. कम से कम 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के माध्यम से 500 μL के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें में 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर निर्धारण, अच्छी तरह से 8 माइक्रोग्राम / एमएल laminin लेपित coverslips पर प्रति अलग कक्षों की प्लेट 10,000 और 5% सीओ 2 के लिए ।
  2. निलंबन में Langendorff पृथक cardiomyocytes पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. पीबीएस में 4% पीएफए ​​के 1 एमएल, 7.4 पीएच में फिक्स Langendorff पृथक cardiomyocytes, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 800 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, लगानेवाला हटाने, और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    2. पीबीएस के 1 एमएल में तय cardiomyocytes Resuspend और या तो immunofluorescence धुंधला के साथ आगे बढ़ना या पीबीएस के 500 μL में उन्हें अच्छी तरह से प्रति पर स्टोर4 डिग्री सेल्सियस पर 24 अच्छी तरह से थाली। एक microcentrifuge ट्यूब के लिए - (200 μL ~ 100) सेल निलंबन का एक हिस्सा स्थानांतरण। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 800 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. Permeabilize, ब्लॉक, और 1 पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μL जोड़कर α-actinin के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग: कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.2% ट्राइटन X-100 और 5% गधा सीरम के साथ पीबीएस में 400।
    4. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 800 XG पर पीबीएस के साथ सेल गोली और सेंट्रीफ्यूज धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एलेक्सा-स्त्राव संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μL (विरोधी माउस IgG1) में सेते हैं 1 पतला: कमरे के तापमान पर 1 घंटे, प्रकाश से सुरक्षित करने के लिए: Hoechst डाई में 400 (1 माइक्रोग्राम / एमएल काम कर समाधान)।
    5. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। इस चरण को दोहराएँ। प्रकाश से नमूना सुरक्षित रखें। आर200 में कोशिकाओं esuspend - पीबीएस के 500 μL और 100 हस्तांतरण - एक माइक्रोस्कोपी चैंबर के एक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 300 μL। चैम्बर के ढक्कन बंद करें और इमेजिंग जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की दुकान। लाइट से बचाएँ।
  3. Langendorff पृथक cardiomyocytes के nuclearity का विश्लेषण
    1. α-actinin से सना हुआ cardiomyocytes से छवियों को एक 25x उद्देश्य के साथ ले लो, एक 250X बढ़ाई के लिए इसी। केवल उन cardiomyocytes कि नियमित रूप से α-actinin से सना हुआ और ठेठ छड़ी के आकार आकृति विज्ञान दिखाने के लिए और इसलिए बरकरार हो ग्रहण कर रहे हैं में H2B-एमसीएच + नाभिक की संख्या की गणना।
    2. गणना तीन अलग-अलग दिलों से कम से कम 100 cardiomyocytes। mononuclear, binuclear, और trinuclear cardiomyocytes के प्रतिशत की गणना।
      नोट: - 90%, जबकि trinuclear कोशिकाओं और नाभिक का अधिक से अधिक संख्या के साथ उन दुर्लभ (Langendorff पृथक cardiomyocytes में <1% कर रहे हैं, <आमतौर पर, binuclear कोशिकाओं के चारों ओर 80 बनाना चाहिएमोटी स्लाइस में 3%)। अलिंद cardiomyocytes वेंट्रिकुलर cardiomyocytes की तुलना में काफी छोटे होते हैं। आमतौर पर, mononuclear कोशिकाओं की कुल जनसंख्या का 90% है।
  4. अलगाव, निर्धारण, और मोटी स्लाइस के लिए तैयारी के रूप में वयस्क दिल की cryopreservation
    1. एक Heidelberger विस्तार ट्यूब और एक दूसरे 3 तरह पानी निकलने की टोंटी के साथ एक 3-जिस तरह से पानी निकलने की टोंटी के लिए एक 50-एमएल सिरिंज जोड़ने के द्वारा निर्धारण के लिए एक छिड़काव उपकरण इकट्ठा करो। इस तरह है कि प्रवाह के माध्यम से गंभीरता से सक्षम किया गया है में एक स्टैंड में सिरिंज को ठीक करें। पीबीएस के 15 एमएल के साथ प्रणाली भरें।
    2. कदम 2.1.2.1-2.1.2.4, का पालन करें "दिल तैयारी।" बुलबुला मुक्त-पीबीएस भरा छिड़काव उपकरण की Luer ताला एडाप्टर के लिए दिल के साथ G20x1 आधा इंजेक्शन प्रवेशनी कनेक्ट और पीबीएस के साथ यह छिड़कना। पीबीएस में 4% formaldehyde के 15 एमएल, जो तब दिल के माध्यम से भरकर रखा जाता है - 10 के साथ प्रणाली भरें। विसर्जन रात भर 4% formaldehyde समाधान में दिल को ठीक।
    3. 4% formaldehyde बदलेंपीबीएस के साथ समाधान और कमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए 150 rpm पर एक क्षैतिज प्रकार के बरतन पर पीबीएस में दिल धो लें। 20% sucrose के समाधान के साथ पीबीएस का आदान-प्रदान 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर दिल निर्जलीकरण।
    4. एक छोटी सी सांचे में क्रायो embedding माध्यम में दिल रुक।
      1. एक बीकर 2-methylbutane के साथ भरा सेट अप और सूखी बर्फ के साथ एक बॉक्स में जगह है। एक ठंड ढालना क्रायो embedding माध्यम के साथ पहले से आधा भरा में दिल में डाल दिया है और यह पूरी तरह से कवर क्रायो embedding माध्यम के साथ। ध्यान से ठंड बीकर में ढालना जगह, 2-methylbutane साथ क्रायो embedding माध्यम के संपर्क को रोकने। -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक जमे हुए ऊतक स्टोर।
  5. मोटी स्लाइस दिल की तैयारी
    1. -18 -20 डिग्री सेल्सियस की एक वस्तु के तापमान, -21 -23 डिग्री सेल्सियस के एक कक्ष तापमान, 4 डिग्री की चाकू धारक पर एक समाशोधन कोण, और पंख R35 microtome ब्लेड: एक cryotome में निम्नलिखित सेटअप का प्रयोग करें।
    2. cryopreserved ओ लेठंड कंटेनर से rgan और जल्दी ठंड शेल्फ का उपयोग कर क्रायो embedding माध्यम के साथ नमूना डिस्क पर यह तय कर लो। इस तरह है कि सेक्शनिंग शीर्ष पर शुरू होता है में दिल की स्थिति।
    3. 50 माइक्रोन स्लाइस दूर ट्रिम जब तक एक भी काटने विमान हासिल की है और अंग दिखाई हो जाता है। एक धीमी गति से वेग के साथ और विरोधी रोल प्लेट चाकू पर रखा के साथ मैनुअल मोड में cryotome का उपयोग करके 50 माइक्रोन ऊतक स्लाइस काटें। खारा इलाज खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट स्लाइस। स्लाइस कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सूखी और सीधे डिग्री सेल्सियस या दाग -80 पर स्लाइड की दुकान।
  6. मोटी दिल स्लाइस की धुंधला (नाभिक और कोशिका झिल्ली)
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक क्युवेट में धोने बफर (0.5 एम NaCl, 0.1 एम Tris पीएच 7.5, और 50 मिमी EDTA) में RNase एक (20 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ दिल स्लाइस समझो। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए धोने के बफर में 0.2% ट्राइटन एक्स स्लाइस सेते हैं। स्लाइस एक पर एक क्युवेट में धोने बफर में 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोकमरे के तापमान पर क्षैतिज प्रकार के बरतन।
    2. दाग रात भर 1 माइक्रोन के लिए-PRO3 आयोडाइड (642/661) और fluorescein मिलकर गेहूं के बीज agglutinin (WGA, 1: 100) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कपड़े धोने बफर में। स्लाइस एक क्षैतिज प्रकार के बरतन पर cuvettes में धोने बफर के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं और एक विरोधी लुप्त होती अभिकर्मक और एक गिलास coverslip के साथ polyvinyl शराब बढ़ते मध्यम के साथ उन्हें कवर।
  7. चित्र अधिग्रहण
    1. आदर्श रूप में, एक औंधा confocal लेजर स्कैनिंग एक 40X / 1.15 एनए पानी की सूई उद्देश्य के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। टुकड़ा है कि longitudinally लाइन में खड़ा cardiomyocytes के होते हैं के भीतर एक क्षेत्र के लिए आंखों से खोज; उस उद्देश्य के लिए, fluorescein-WGA चैनल (पूर्व .: 488 एनएम) सबसे उपयुक्त है।
      नोट: यह कदम आवश्यक है, के रूप में cardiomyocytes के ऊपरी और निचले सीमा बाद में विश्लेषण के लिए जेड ढेर के भीतर दिखाई जानी चाहिए। के रूप में इमेजिंग गहराई ~ करने के लिए 30 एनएम ही सीमित है और टुकड़ा की मोटाई 50 माइक्रोन है, इसे im करने के लिए संभव नहीं हैइन कोशिकाओं की उम्र पार वर्गों (सेल लंबाई: ~ 120 माइक्रोन)।
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर सेटअप को समायोजित करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें। ओपन A1plus सेटिंग और CH2, CH3, और Ch4 के लिए बक्से की जाँच करें। EGFP करने के लिए, Alx647 को Alx546 को CH3, और Ch4 लटकते मेनू पर क्लिक करके Ch2 सेट करें।
      1. प्रत्येक चैनल के लिए, एचवी पर क्लिक करें और 80 को यह स्लाइडर पट्टी का उपयोग करके निर्धारित किया है। स्लाइडर का उपयोग करके सलाखों 0 करने के लिए ऑफसेट सेट करें। घर की स्थिति को पिनहोल स्थापित करने के लिए "होम" बटन पर क्लिक करें। लटकते मेनू पर क्लिक करके 1024 x 1024 को आकार स्कैन सेट और "XYZ आकार सेटअप" विंडो खोलने के लिए अनुकूलन क्लिक करें। "सुझाए गए कदम (जेड)" के तहत "बिल्कुल सही Voxel" बॉक्स की जाँच करें।
    3. पर "लाइव स्कैन" क्लिक करें और अलग-अलग चैनलों पर स्लाइडर सलाखों पर क्लिक करके लेजर तीव्रता को समायोजित। "एन डी अधिग्रहण" खिड़की पर 'जेड सीरीज "बॉक्स को चेक करें और" शीर्ष बटन द्वारा परिभाषित "बॉक्स पर क्लिक करें। शीर्ष परिभाषित करें औरजेड ढेर माइक्रोस्कोप पर फोकस समायोजित करने के बाद उचित बटन पर क्लिक करके के बटन। 0.5 माइक्रोन के लिए z कदम चौड़ाई सेट करें।
      नोट: जेड ढेर की गहराई ऊतक और संकेत करने वाली शोर अनुपात के भीतर ऑप्टिकल प्रवेश द्वारा सीमित है।
    4. "A1plus सेटिंग्स" के लिए जाओ और लटकते मेनू पर क्लिक करके लाइन औसत / 2-4 के लिए इंटीग्रल निर्धारित किया है। ठीक धुन लेजर तीव्रता; पिनहोल एक फोकल हवाई जहाज़ में छवि के क्रम में संभव के रूप में छोटा होना चाहिए।
  8. केंद्रक का विश्लेषण
    1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और ब्याज की जेड ढेर लोड।
    2. मैन्युअल आदेश कोशिकाओं है कि पूरी तरह से ढेर के भीतर झूठ की पहचान करने में ढेर की विभिन्न परतों के माध्यम से स्क्रॉल करके जेड के ढेर में न्यूक्लिएशन निर्धारित; इस मामले में जब WGA धुंधला सभी आयामों में दिखाई दे रहा है। नाभिक की संख्या की गणना (उनमें से ज्यादातर binuclear हो जाएगा) और सॉफ्टवेयर में एक एनोटेशन द्वारा विश्लेषण सेल निशान।
      3. <li> मुख्यमंत्री नाभिक (H2B-एमसीएच +) और एकल चैनल (चित्रा 2 डी) के लिए 3 डी पुनर्निर्माण में कुल नाभिक (TO-PRO3 +) की संख्या निर्धारित करते हैं। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, "बाइनरी" पर क्लिक करें और चुनें लटकते मेनू से "सीमा 3 डी परिभाषित करें"। चैनल लटकते मेनू या तो कुल नाभिक की संख्या के लिए मुख्यमंत्री नाभिक या Alx647 की संख्या के लिए Alx546 से चुनें। उचित तीर क्लिक करके, कार्यक्रम के लिए "चिकनी 4x", स्वच्छ 1x सेट, और पर छेद भरें। "आकार" बॉक्स को चेक करें और 5 माइक्रोन के लिए यह स्लाइडर पट्टी का उपयोग करके निर्धारित किया है। स्लाइडर पट्टी का उपयोग कर जब तक अलग वस्तुओं दिखाई द्वारा सीमा निर्धारित करें।
      नोट: विखंडन को लागू करने के बाद, परिणाम विंडो मात्रा निर्धारित घटनाओं और छवि का एक रंग का विखंडन की एक मेज से पता चलता है। जैसा कि कुछ नाभिक सीधे एक दूसरे से संपर्क करें, मैन्युअल दोहरी है, जो सही तरीके से सॉफ्टवेयर से अलग नहीं किया जा सकता है के लिए स्वत: माप परिणाम सही।

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Representative Results

आदेश में इन विट्रो में प्रसव के बाद cardiomyocytes, डबल ट्रांसजेनिक Myh6-H2B-एमसीएच / कैग-EGFP-anillin चूहों के cardiomyocytes के सेल चक्र गतिविधि पर siRNAs / miRNAs के प्रभावों का विश्लेषण करने में प्रसव के बाद 3 दिन (पी 3) पर अलग और साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे सेल चक्र गतिविधि उत्प्रेरण miR199 5, siRNA p27, और siRNA Fzr1। नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1 ए) की तुलना में, miR199- (चित्रा 1 बी) और siRNA p27- (चित्रा 1 सी) के चित्रों cardiomyocytes कोशिका चक्र गतिविधि का एक प्रेरण दिखाने ट्रांसफ़ेक्ट। EGFP-anillin माउस मॉडल में, Fzr1 के खिलाफ siRNAs अभिकर्मक नियंत्रण के रूप में, के रूप में Fzr1 के निषेध ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के नाभिक में EGFP anillin संलयन प्रोटीन का संचय और Fzr1 का नुकसान होता है एपीसी के निषेध के लिए होता है इस्तेमाल किया जा सकता Fzr1। Fzr1 anaphase को बढ़ावा देने के जटिल E3 ligase के एक सहायक कारक है, जो दक्षिण अफ्रीका के लिए anillin को निशाना बनाता हैOmal गिरावट। चित्रा -1 siRNA Fzr1 ट्रांसफ़ेक्ट cardiomyocytes 3 दिन अभिकर्मक के बाद, ~ 45% एक अभिकर्मक दक्षता का संकेत है की एक confocal अवलोकन तस्वीर दिखाता है। Cardiomyocytes कि (, जैसे p27 6 की पछाड़ना के बाद) endoreduplication प्रदर्शन विशेष रूप से परमाणु EGFP-anillin अभिव्यक्ति (चित्रा 1E) दिखाने के लिए या EGFP-anillin नकारात्मक (चर्चा देखें) कर रहे हैं। वे व्यक्त नहीं करते एम चरण-ठेठ localizations (चित्रा 1F और जी) में EGFP anillin, के रूप में endoreduplication केवल एक इंडो-एस चरण (EGFP-anillin पॉजिटिव) और एक इंडो-जी चरण (EGFP-anillin नकारात्मक होते हैं )। इंडो-जी चरण में, एपीसी एंटीबॉडी में ubiquitination और EGFP-anillin की गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप, सक्रिय है।

वयस्क अवस्था में मोनो और binucleated cardiomyocyte भागों की मात्रा लैन के बाद एकल कोशिका के स्तर पर या तो किया जा सकता हैMyh6-H2B-एमसीएच ट्रांसजेनिक दिल की या ट्रांसजेनिक दिलों की मोटी cryoslices में gendorff हदबंदी। Langendorff तंत्र, अटरिया और निलय में हृदय के ऊतकों के enzymatic पाचन के बाद यंत्रवत् अलग किया जा सकता है और एक दूसरे की स्वतंत्र रूप से विश्लेषण किया। के रूप में परमाणु H2B-एमसीएच अभिव्यक्ति ने संकेत दिया चित्रा 2A, binucleated cardiomyocytes के एक उच्च डिग्री के साथ Langendorff अलगाव के बाद गैर तय H2B-एमसीएच ट्रांसजेनिक वेंट्रिकुलर cardiomyocytes के एक प्रतिनिधि तस्वीर दिखाता है। इसके विपरीत, आलिंद cardiomyocytes के बहुमत (चित्रा 2 बी) mononucleated रहे हैं। जैसा कि enzymatic पाचन 100% एकल कक्षों में परिणाम नहीं करता है, पार striation α-actinin धुंधला द्वारा पता चला की तर्ज सेल दोहरी binucleated cardiomyocytes के बीच भेदभाव (पार striation के सतत पैटर्न, चित्रा -2) और सुविधा। चित्रा 2 डी में एक binucleated cardiomyocyte की पहचान का एक उदाहरण दिखाता हैदेहाती टुकड़ा।

वयस्क Myh6-H2B-एमसीएच ट्रांसजेनिक दिलों की मोटी स्लाइस के 3D पुनर्निर्माण ऊतक के भीतर शारीरिक शर्तों के तहत cardiomyocyte नाभिक के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर के 3 डी मॉड्यूल का उपयोग करना, Hoechst से सना हुआ नाभिक और के रूप में चित्रा 2 ई में सचित्र H2B-एमसीएच पॉजिटिव नाभिक का पता लगाया जा सकता है और स्वचालित रूप से गिना। अंतिम परिणाम दोहरी के लिए मैन्युअल रूप से सही किया जाना चाहिए, नाभिक है कि सीधे एक दूसरे को स्पर्श, इस मामले में अर्थ। मोटी स्लाइस में cardiomyocytes के केंद्रक सूचकांक का विश्लेषण करने के लिए, इसे मैन्युअल ढेर के माध्यम से स्क्रॉल करने के लिए, के रूप में नाभिक एक z विमान के भीतर नहीं आवश्यक झूठ करना आवश्यक है। WGA धुंधला सेल सीमाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

आकृति 1
चित्रा 1: के उदाहरणप्रसव के बाद cardiomyocytes में कोशिका चक्र गतिविधि के इन विट्रो दृश्य siRNAs के साथ अभिकर्मक के बाद। (ई) EGFP-anillin / Myh6-H2B-एमसीएच दिलों α-actinin (सफेद) के लिए दाग से पी 3 cardiomyocytes। Cardiomyocyte नाभिक Hoechst परमाणु डाई (नीला) द्वारा EGFP-anillin संकेतों (हरा), और नाभिक से H2B-एमसीएच संकेत (लाल), कोशिका चक्र गतिविधि के द्वारा पहचाने जाते हैं। (ए) पी 3 cardiomyocytes हाथापाई siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं। बार 100 माइक्रोन है। (बी) के पी 3 cardiomyocytes miRNA-199 प्रदर्शन काफी नियंत्रण (ए) की तुलना में अधिक EGFP-anillin संकेतों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट। बार 100 माइक्रोन है। (सी) p27 siRNAs के साथ अभिकर्मक के बाद विशेष रूप से परमाणु EGFP-anillin का संकेत है, यह दर्शाता है endoreduplication का उदाहरण है। बार 80 माइक्रोन है। (डी) अभिकर्मक दक्षता के निर्धारण के लिए Fzr1 के खिलाफ siRNA अभिकर्मक के साथ। EGFP-anillin एसी के रूप मेंcumulates, EGFP-anillin + cardiomyocytes की संख्या अभिकर्मक दक्षता को दर्शाता है। बार 80 माइक्रोन है। (ईजी) सेल चक्र के दौरान cardiomyocytes में EGFP anillin (हरा) के विभिन्न localizations: परमाणु स्थानीयकरण (ई में तीर), सिकुड़ा अंगूठी (एफ में तीर), और midbody स्थानीयकरण (जी में तीर)। बार में 20 माइक्रोन (ई) और 10 माइक्रोन (एफ और जी) में है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: H2B-एमसीएच चूहे से cardiomyocytes के Langendorff अलगाव द्वारा Multinucleation के आकलन के लिए और मोटी स्लाइस के 3 डी विश्लेषण से उदाहरण हैं। (ए, बी) वेंट्रिकुलर (ए) और आलिंद (बी) वयस्क एच 2 से दिल से cardiomyocytesLangendorff हदबंदी से अलगाव के बाद बी-एमसीएच ट्रांसजेनिक चूहों। सलाखों के 50 माइक्रोन कर रहे हैं। (सी) Myh6-H2B-एमसीएच दिलों α-actinin (हरा) के लिए दाग से cardiomyocytes। Cardiomyocyte नाभिक H2B-एमसीएच संकेत (लाल) द्वारा पहचाने जाते हैं। बार 10 माइक्रोन है। एक मोटी टुकड़ा (तीर) में (डी) Binucleated cardiomyocyte। Cardiomyocyte नाभिक H2B-एमसीएच संकेत (लाल), ToPro3 द्वारा WGA धुंधला द्वारा सेल सीमाओं (हरा), और नाभिक (सफेद) द्वारा पहचाने जाते हैं। बार 50 माइक्रोन है। (ई) मोटी स्लाइस में binucleation के 3 डी विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वहाँ पर कि क्या cardiomyocytes कोशिका चक्र फिर से दर्ज है और चोट के बाद और ऊतक homeostasis दौरान विभाजित करने में सक्षम हैं एक विवाद है। Cardiomyocytes के बुनियादी कारोबार के लिए मान 1% 1 और 80% से 7 के बीच सीमा में दी गई है। 40% 7 - इसके अलावा एक कार्डियक घाव के बाद, सेल चक्र गतिविधि की प्रेरण और नए cardiomyocytes की पीढ़ी 0.0083% 8 और 25 के बीच सीमा क्षेत्र में सूचना दी गई है, मूल्यों के साथ। इन विसंगतियों आंशिक रूप से एक प्रक्रिया है कि histological वर्गों 9 पर और कोशिका विभाजन के दौरान बहुत ही चुनौतीपूर्ण है हृदय नाभिक की पहचान करने, विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोण से समझाया जा सकता है। cardiomyocytes कोशिका चक्र के बदलाव से ग्रस्त हैं के रूप में, यह endoreduplication और acytokinetic बँटवारा, जो polyploid और multinucleated कोशिकाओं के लिए नेतृत्व से प्रामाणिक कोशिका विभाजन भेद करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। के लियेकोशिका विभाजन की पहचान, यह इस तरह सिकुड़ा के छल्ले और midbodies के रूप में कोशिका विभाजन की पहचान, कल्पना करने के लिए, साथ ही binucleated cardiomyocytes का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। हम तकनीक विकसित की है विस्तार से cardiomyocytes में कोशिका चक्र गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए और अलग कक्षों में या मोटी वर्गों में nuclearity की उनकी डिग्री का निर्धारण करने के लिए।

यह ध्यान रखें कि EGFP-anillin प्रणाली एक सममित सिकुड़ा अंगूठी (चित्रा 1F) और midbody (चित्रा 1G), और endoreduplication और acytokinetic बँटवारा के लिए अप्रत्यक्ष सबूत के दृश्य के माध्यम से कोशिका विभाजन के प्रत्यक्ष सबूत प्रदान करता है महत्वपूर्ण है। पहले से वर्णित के रूप में, सिकुड़ा अंगूठी के एक एकतरफा ingression की घटना binucleation 10 का सूचक है, और इस EGFP-anillin प्रणाली के साथ मनाया जा सकता है।

Endoreduplication कोई सिकुड़ा अंगूठी या मील के रूप में लंबे समय के रूप में सुझाव दिया गया हैdbody मनाया जाता है, जो अनिवार्य इन स्थानीयकरण का पता लगाने की संभावनाओं की गणना करता है। 25 घंटा की कोशिका चक्र की अवधि, 20 मिनट की सिकुड़ा अंगूठी दृश्यता की औसत अवधि, और 1 घंटा की midbody हठ मानते हुए, वहाँ EGFP-anillin पॉजिटिव कोशिकाओं और 4 midbodies विभाजित 100 में 1 सिकुड़ा अंगूठी होना चाहिए। सांख्यिकीय बोल, 25 EGFP-anillin पॉजिटिव कोशिकाओं की एक न्यूनतम कोशिका चक्र की विविधताओं से कोशिका विभाजन भेद करने के लिए विश्लेषण करने की आवश्यकता होगी। यह संख्या कोशिका चक्र की अवधि (जो अक्सर अज्ञात है) के रूप में उसी के अनुसार बदलता बढ़ जाती है या कम हो जाती है। यह भी संकेत मिलता है कि EGFP-anillin संकेतों के बहुमत परमाणु (चित्रा 1E) हो जाएगा, एम चरण, गैर परमाणु स्थानीयकरण के साथ ही चरण के रूप में, केवल लगभग 1 घंटे तक रहता है।

प्रसव के बाद विकास के दौरान, binucleation माउस दिलों में जगह लेता है और (मानव में 25% ~) 11 वेंट्रिकुलर cardiomyocytes में 90% तक बढ़ जाती है। एफओr दिल में उत्थान का विश्लेषण, यह binucleation की डिग्री का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। अर्थात्, Langendorff हदबंदी और हृदय के ऊतकों की मोटी वर्गों के सृजन: हम इस महत्वपूर्ण रूपात्मक सुविधा के समाधान के लिए दो विधियों का वर्णन। जबकि Langendorff अलगाव आसान और तेजी से होता है, मोटी वर्गों की आकृति विज्ञान अधिक समय लगता है लेकिन यह भी ज्यादा सटीक है। दिलचस्प बात यह है, हमने पाया कि Langendorff अलगाव binuclear cardiomyocytes का प्रतिशत overestimates है। यह इस बल्कि कठोर प्रक्रिया के दौरान mononuclear और binuclear कोशिकाओं के विभिन्न जीवित रहने की दरों की वजह से हो सकता है।

प्रसव के बाद cardiomyocytes में प्रसार की प्रेरण हृदय उत्थान में एक उभरती हुई दृष्टिकोण है, इस प्रोटोकॉल के दो ट्रांसजेनिक माउस लाइनों, Myh6-H2BmCh और नियंत्रक एवं महालेखा परीक्षक-EGFP-anillin संयोजन के द्वारा एक स्क्रीनिंग प्रणाली का वर्णन है। प्रसव के बाद दिन P1 पर दिल से अलग cardiomyocytes - पी 6 आसानी से संवर्धित किया जा सकता है और ट्रांसफ़ेक्ट miRNAs के साथ याsiRNAs या छोटे अणुओं के पुस्तकालयों के साथ इलाज किया। Cardiomyocyte नाभिक स्वयं या स्वतः सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम से पता लगाया जा सकता है, और संभावित 'हिट' मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य + नाभिक संख्या में वृद्धि के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। endoreduplication और acytokinetic बँटवारा से कोशिका विभाजन के भेदभाव EGFP-anillin संकेतों के विभिन्न localizations की मात्रा का ठहराव के द्वारा किया जा सकता है। इस प्रणाली के लिए नियामक तंत्र अंतर्निहित प्रसव के बाद cardiomyocyte प्रसार पर कुछ नया प्रकाश डाला जाना चाहिए और हृदय रोगों के उपचार के लिए नई चिकित्सीय एजेंट की खोज करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt 821472
100 µm cell strainer Becton Dickinson GmbH/Falcon 352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican Braun, Melsungen 4657519
20 gauge needle Becton Dickinson GmbH 301300
24-well plates Becton Dickinson GmbH/Falcon 353047
2-Methyl-butane Carl Roth GmbH + Co. KG 3927.1
37% formaldehyde solution AppliChem GmbH  A0936,1000
3-way stopcock B. Braun Medical Inc. 16494C
50 mL syringe B. Braun Medical Inc. 8728810F
70% ethanol Otto Fischar GmbH 27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody Jackson ImmunoResearch 115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG Sigma-Aldrich, Steinheim A7811
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area Greiner bio-one 675986
Collagenase B Roche 11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E Nikon
cryostat CM 3050S Leica
donkey serum Jackson Immuno Research, Suffolk, GB 017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
EDTA Sigma-Aldrich E4884
fetal calf serum PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%) PanReac AppliChem A3697
Gelatine from porcine skin, Type A Sigma-Aldrich, Steinheim G2500
glass coverslips VWR 631-0146
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Heidelberger extension tube IMPROMEDIFORM GmbH MF 1833
Heparin-Natrium Ratiopharm 5394.02.00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HistoBond microscope slides Marienfeld 0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL) Sigma Aldrich, Taufkirchen B2261
Insulin syringe Becton Dickinson GmbH 300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) Gibco/Life Technologies, Darmstadt 21980-032
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin Corning 354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt 13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey) Jackson ImmunoResearch 715-175-151
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
microcentrifuge tube Sarstedt 72690
Mini shaker VWR 12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p Ambion/Thermo Fischer Scientific 4464066
Biopsy Mold Sakura Finetek/ VWR 4565
M-slide 8-well ibiTreat ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Merck Millipore 567530
negative control(scrambled RNA) Ambion/Thermo Fischer Scientific AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA Gibco/Life Technologies, Darmstad 11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco 51985-026
P21-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies, Darmstadt 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Steinheim 14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading Sigma-Aldrich 10981
RNase A Qiagen 1007885
RNaseZap Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt AM9780
sample containers Vitlab 80731
Serological pipette Greiner 607180
software NIS Elements Nikon
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek/ VWR 25608-930
ToPro3 iodide (642/661) Molecular probes/ThermoFisher Scientific T3605
Tris Sigma-Aldrich T1503
Triton X Fluka 93418
Triton X-100 Fluka 93418
Trypsin Sigma-Aldrich T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled Vector Laboratories VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody Sigma-Aldrich A7811
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim M3148

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References

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  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
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प्रसव के बाद cardiomyocytes में कोशिका चक्र बदलाव के दृश्य और Nucleation का निर्धारण
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Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D.,… More

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D., Fleischmann, B. K., Hesse, M. Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (120), e55204, doi:10.3791/55204 (2017).

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