Introduction
La corretta identificazione dei nuclei cardiomiociti e lo stato del ciclo cellulare è di cruciale importanza per la determinazione del fatturato muscolo cardiaco e la rigenerazione. Ciò è particolarmente vero per l'uso di marcatori nucleari, come pHH3, Ki-67, o analoghi della timidina, per l'identificazione dell'attività ciclo cellulare. Poiché la capacità proliferativa dei cardiomiociti mammiferi adulti è molto piccolo 1, una falsa identificazione di un nucleo positivo per un marker di proliferazione di un nucleo cardiomiociti potrebbe fare una differenza cruciale nel risultato di un saggio di proliferazione. Inoltre, cardiomiociti sono inclini a variazioni del ciclo cellulare, come endoreduplicazione e mitosi acytokinetic, che determinano cellule poliploidi e multinucleate piuttosto che nella divisione cellulare. A tal fine, l'interpretazione della colorazione anticorpi contro marcatori del ciclo cellulare comuni non è determinante in tutti i casi.
Qui, vi presentiamo i metodi per il diritto-forwa il riconoscimento Rd di cardiomiociti di topo e la loro nuclearità in cellule isolate nativi e sezioni di tessuto di spessore nelle fasi post-natali e adulti dall'identificazione univoca dei loro nuclei. A tal fine, una linea di topi transgenici con espressione specifici cardiomiociti di una proteina di fusione che consiste di H2B istone umano e mCherry sotto il controllo del promotore Myh6 (Myh6-H2B-MCH) è stato usato 2. Incroci questa linea di topi con una linea di topi indicatore di proliferazione transgenico, in cui l'espressione di una proteina di fusione eGFP-anillin è sotto il controllo del onnipresente promotore pollo actina con potenziatore CMV (CAG-eGFP-anillin), consente la determinazione dello stato del ciclo cellulare. Il anillin proteina ponteggio è specificamente indicato nella cellula-ciclo cellulare attivo 3, e il suo differenziale localizzazione subcellulare durante il ciclo cellulare permette per la progressione del ciclo cellulare live-tracciamento con una risoluzione di M-Phaseef "> 4. Pertanto, i topi transgenici doppia può essere utilizzato per discriminare tra cardiomiociti proliferanti e quelli che subiscono variazioni del ciclo cellulare. Questo dimostra particolarmente utile nello screening per sostanze proliferazione di indurre in vitro.
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Protocol
Tutte le procedure di questo protocollo che coinvolge gli animali erano in conformità con gli standard etici della Università di Bonn e rispettate le linee guida della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.
1. In Vitro visualizzazione di Cell ciclo di attività in postnatale cardiomiociti
- Postnatale dissociazione cardiomiociti
- preparazioni pre-sperimentali
- Preparare terreni di coltura (IMDM, 1% di penicillina / streptomicina, aminoacidi non essenziali 1%, 0,1% β-mercaptoetanolo); medio 1: aggiungi FCS al 2%; media 2: aggiungere FCS al 20%.
- Coat un 96 pozzetti cultura piatto (zona mezza di crescita: 15 mm 2) con 0,1% di gelatina in soluzione PBS.
- dissezione del cuore
- Preparare una capsula di Petri con 15 ml di PBS e memorizzarlo sul ghiaccio. Sterilizzare due pinze e forbici piccole mettendoli in un luogo asciutto sterilizzatore a perle di vetro. Sacrificio neonatale topi transgenici (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) per decapitazione. Aprire il torace, sezionare il cuore fuori, come descritto in Ehler et al. 2013 (J Exp Vis .; (79):. 50154 doi: 10.3791 / 50154) e le trasferisce al ghiacciata PBS. Passare alla prossima mouse.
- Se si utilizza coppie nidificanti non omozigoti, identificare i cuori transgenici con un microscopio a fluorescenza. Mettere i cuori in PBS sotto un microscopio a fluorescenza. Controllare per l'espressione eGFP-anillin (Es .: 488 nm; em .: 509 nm) e l'espressione H2B-MCH (Es .: 587 nm; em .: 610 nm) con gli appositi set di filtri.
- isolamento cardiomiociti
- Dissociare il cuore selezionati utilizzando il kit di cuore di dissociazione neonatale. Incubare la miscela enzimatica 1 a 37 ° C per 5 min. Per ottenere 1 mL del mix enzimatico finale, aggiungere 945 ml di mix dell'enzima 1-55 ml di enzima mix 2.
- Trasferimento fino a 4 cuori da P1 - P3 topi o fino a 2 cuori da P4 - P6 topi ad un R da 1,5 mlTubo eaction contenente 1 ml di miscela enzimatica e tagliare cuore in piccoli pezzi con le forbici. Trasferire la soluzione in 15 ml provette di reazione.
- Incubare a 37 ° C per 15 min. Per massimizzare il contatto tra il tessuto e gli enzimi, inserire il tubo 15 mL quasi orizzontalmente nell'incubatrice. Mescolare pipettando 5 - 10 volte su e giù con una pipetta da 5 mL. Ripetere questa operazione tre volte.
- Aggiungere 7,5 ml di mezzo 2 (20% FCS) per arrestare la reazione enzimatica. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 70 micron. Risciacquare il filtro cella con 3 ml di terreno 2.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 g per 15 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 500 ml di media 1; rosso lisi delle cellule del sangue non è richiesta per ulteriori esperimenti. Pipettare 10 ml di sospensione cellulare in una camera di conteggio delle cellule e determinare il numero di cellule.
- Per una piastra a 96 pozzetti: semi di 10.000 cellule per pozzetto in 120 ml di media 1 (2% FCS). Postole cellule in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) e procedere immediatamente alla trasfezione.
- preparazioni pre-sperimentali
- Transfection di cardiomiociti neonatali con siRNA o miRNA
- Pulire una panchina con soluzione di decontaminazione RNase per rimuovere le RNasi. Pulire il seguente materiale con la soluzione di decontaminazione RNase: 10-ml, 100-ml, e 200-microlitri pipette e una scatola di ghiaccio. Immagini aliquote disgelo siRNA (100 micron) su ghiaccio.
- Preparare 2 mM scorte di lavoro del SI / miRNA nel medio siero ridotta (98 ml di riduzione media di siero + 2 ml di siRNA 100 micron magazzino). Lo stock di lavoro deve essere utilizzato lo stesso giorno. Il congelamento non è raccomandato.
- Aggiungere 4 ml di 2 mM magazzino a 6 ml di siero medio ridotto a un tubo di reazione 0,5 mL (importo per un 96 pozzetti; SI finale / concentrazione miRNA in 140 ml: ~ 57 nm). Scegliere un volume adeguato numero di pozzi da transfettate con un certo SI / miRNA.
- Preparare una master mix del reagente di trasfezione. Utilizzare 10 ml (0,6 ml di trasfezione reagente + 9,4 ml di siero di riduzione media) per ogni pozzetto (96 pozzetti totali).
- Aggiungere il si / miRNA mix al mix trasfezione reagente. Incubare per 5 minuti in ghiaccio. Pipettare 20 microlitri in ciascun pozzetto. Incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 e quindi sostituire il mezzo in ogni pozzetto con 120 ml di media 1. Dopo 24 ore o più, procedere alla fissazione e immunofluorescenza.
- Fissazione e immunofluorescenza
- Rimuovere il mezzo e lavare le cellule una volta con PBS. Coprire le cellule con soluzione di formaldeide 4% per 20 min. Togliere la soluzione di formaldeide e lavare le cellule una volta con PBS, e poi coprirli con PBS per lo stoccaggio o procedi alla immunocolorazione.
- Incubare con l'anticorpo primario (concentrazione secondo le istruzioni del produttore) in 0,2% Triton-X e 5% di siero asino per almeno 2 h.Se la colorazione per la α-actinina (diluizione 1: 400; monoclonale anti-α-actinina), macchia notte a 4 ° C.
- Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte con PBS. Diluire l'anticorpo secondario in soluzione Hoechst 1: 400 e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Rimuovere l'anticorpo, lavare con PBS 3 volte, e coprire le cellule con PBS per la conservazione a 4 ° C.
- La microscopia confocale il video
- Utilizzare un microscopio confocale per l'acquisizione delle immagini. Aprire il software di imaging. Aprire "Impostazioni A1plus" e selezionare le caselle per Ch1, Ch2 e Ch3. Impostare Ch1 a DAPI, Ch2 per eGFP, Ch3 a Cy3, e CH4 per Cy4 cliccando sul menu a tendina.
- Per ogni canale, cliccare su HV e impostarlo su 80 utilizzando la barra di scorrimento. Impostare l'offset a 0 utilizzando le barre di scorrimento, e clicca sul pulsante "Home" per impostare il foro stenopeico alla posizione iniziale. Impostare il formato di scansione di 1.024 x 1.024 cliccando sul menu a tendina.
- Fare clic su Ottimizza per aprirefinestra "XYZ Size Setup". Casella "perfetto Voxel" sotto "Passo suggerito (z)". Aumentare l'intensità del laser fino a quando l'immagine non è né sottoesposta né sovraesposto.
NOTA: Per esempio; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (eGFP): 12%, Ch3 (Cy3): 100%, Ch4 (Cy5): 1%. Impostare l'offset per tutti i canali a 0.
- Riprendere immagini utilizzando un obiettivo 20X (200X di ingrandimento). Scansione una grande immagine costituito da immagini di piastrelle (es, 3 x 3).
- Nel software di imaging, andare a "acquisire" e scegliere "Scan grande immagine" dal menu a tendina. In "Area", scegliere "posizione attuale è superiore sinistro" dal menu a tendina e impostare "Numero di campi in X e Y" a 3 x 3. Fare clic su "Scan".
- Utilizzare un microscopio confocale per l'acquisizione delle immagini. Aprire il software di imaging. Aprire "Impostazioni A1plus" e selezionare le caselle per Ch1, Ch2 e Ch3. Impostare Ch1 a DAPI, Ch2 per eGFP, Ch3 a Cy3, e CH4 per Cy4 cliccando sul menu a tendina.
- analisi delle immagini
- Definire il numero di nuclei cardiomiociti contando segnali H2B-Ch e il numero di cardiomiociti contando segnali α-actinina.
- <li> Clicca su "Misura" e scegliere "Misurazione manuale" dal menu a tendina. Scegliere "conta" dal successivo menu a tendina. Clicca su nuclei con segnali H2B-MCH, segnando in tal modo e contarli. Fare lo stesso per le cellule α-actinina-positivi per ottenere il numero di cardiomiociti.
- Definire il numero di nuclei cardiomiociti contando segnali H2B-Ch e il numero di cardiomiociti contando segnali α-actinina.
- Conte S / cardiomiociti fase G2 con segnali eGFP-anillin nucleari (eGFP-anillin + / + H2BmCh nuclei). Clicca su "Misura" e scegliere "Misurazione manuale" dal menu a tendina. Scegliere "conta" dal successivo menu a tendina. Segna i nuclei con segnali eGFP-anillin e segnali H2B-MCH facendo clic su di essi.
- Contare i cardiomiociti con segnali specifici per mitosi eGFP-anillin (ad esempio, figura 1F e G), come ad esempio i segnali citoplasmatici, anelli contrattili, e midbodies. Clicca su "Misura" e scegliere "Misurazione manuale" dal menu a tendina. Scegliere "conta" dal prossimo PULmenù ldown. Mark cardiomiociti con segnali specifici per mitosi eGFP-anillin (ad esempio, figura 1F e G), segnali citoplasmatici, anelli contrattili, e midbodies cliccando su di essi.
2. Determinazione di nucleazione in cardiomiociti adulti da Langendorff Dissociazione e spesse tessuto Sezioni
- L'isolamento di cardiomiociti adulti da Langendorff dissociazione
- I preparativi prima della dissezione cuore
- Riempire una siringa da insulina (l'ago 30-gauge) con eparina (20 unità / g di peso corporeo). Afferrare il mouse per la collottola del collo. Sollevare e ruotare il mouse all'indietro per esporre l'addome per l'iniezione.
- Eseguire un'iniezione intraperitoneale. Mettere il mouse eparina nella gabbia e attendere almeno 15 minuti prima di iniziare la dissezione cuore. Risciacquare e ventilare l'apparato Langendorff con 5 - 10 ml di tampone perfusione (buffer perfusione: 135 mm NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,5 mM HEPES, 5 mM glucosio, e 25 mm BDM in DDH 2 O, regolare a pH 7,4 con NaOH).
- dissezione del cuore
- Preparare a 10 cm capsula di Petri con freddo (4 ° C) PBS e posizionarlo sul ghiaccio. Riempire e ventilare una siringa da 1 mL collegato ad un (calibro 20) cannula con PBS. Fissare la cannula con plastilina sul bordo della scatola di Petri. Posizionare la punta della cannula leggermente al di sotto della superficie PBS.
- Sacrificare il mouse per dislocazione cervicale. Pulire l'addome con una soluzione di etanolo al 70%. Fare un'incisione dalla metà addome allo sterno con le forbici chirurgiche. Rimuovere il diaframma e tagliare il torace bilateralmente con le forbici chirurgiche.
- Sollevare e fissare lo sterno con un ago calibro 20, aprire la cavità toracica, e afferrare delicatamente il cuore con una pinza anatomiche. Sollevare il cuore e rimuoverlo dai polmoni e vasi tagliando i vasi del tratto di efflusso.
NOTA: Per identificare l'aorta, posizionare il cuore conil suo lato ventrale. Questo diminuisce la distanza tra i due atri, così l'aorta con i suoi rami si trova tra gli atri. In base all'architettura cardiaca dell'individuo, i rami possono essere rimossi se il ramo principale della aorta è ancora abbastanza lungo. - Trasferire il cuore alla piastra di Petri di 10 cm contenente refrigerata PBS (vedi punto 2.1.2.1). Incannulare cuore tirando l'aorta ascendente su una cannula iniezione G20x1 ½, che è stato attenuato da un oscillante multi-utensile per evitare danni ai tessuti. Fissare l'aorta con una filettatura sulla cannula. lavare delicatamente il cuore con PBS per rimuovere il sangue in eccesso spingendo lo stantuffo della siringa. Un leggero allargamento del cuore deve essere visibile.
- cuore di dissociazione Langendorff
- Collegare il cuore cannulata rapidamente all'adattatore Luer lock alla dell'apparato perfusione Langendorff. Profumato cuore con 30 mL di tampone perfusione ossigenato a 37 ° C per 5 minuti con una portata di 1 goccia / s. thportata e può essere adattato regolando il flusso O 2 nell'apparato Langendorff utilizzando la valvola di riduzione della pressione (pressione tra 0 e 200 mbar).
- Preparare tampone di digestione immediatamente prima dell'uso: buffer di perfusione con 6 U Collagenasi B, 10.000 unità tripsina, e 50 micron CaCl 2. Rimuovere il buffer di perfusione e iniziare la digestione enzimatica aggiungendo 30 ml di acqua calda (37 ° C) e ossigenato tampone di digestione.
NOTA: La quantità di Collagenasi B deve essere titolato seconda dell'attività di diversi lotti. - Regolare il flusso ad una velocità di 1 goccia / s e digerire il cuore per 10 - 13 min. Per evitare la contaminazione, non utilizzare di nuovo l'efflusso. Trasferire il cuore ad un 10-cm capsula di Petri con 5 mL di tampone di digestione. Sezionare il tessuto manualmente con una pinza tenendo il cuore con un paio di pinze e con l'altra coppia di strappare il cuore in piccoli pezzi.
NOTA: A questo punto, gli atri può essere separato, tagliato in piccolipezzi (con le forbici iris), e digerito per 30 minuti in 750 ml di tampone di digestione in incubatore a 37 ° C per ottenere cellule atriali isolate. Per ottenere cardiomiociti atriali puri, pipetta su e giù più volte con una pipetta da 1 ml. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 750 ml di soluzione di stop. - Arrestare la digestione con l'aggiunta di 5 ml di soluzione di arresto (buffer di perfusione con il 5% FBS e 50 micron CaCl 2). Usando una pipetta sierologica, filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella 100 micron e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare filtrato a 80 xg per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Eliminare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 10 ml di soluzione di arresto con una pipetta sierologica 10 ml. Centrifugare la sospensione cellulare a 80 xg per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura (IMDM con il 20% FCS, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 50 pg / mL ciascuno di penicillina e streptomicina, e 0,1 mM β-mercaptoetanolo) per la coltura. In alternativa, procedere al punto 2.2, "immunofluorescenza," e fissare le cellule.
- Per il fissaggio su piastre da 24 pozzetti, piatto 10.000 delle cellule isolate per pozzetto 8 ug / mL coprioggetto laminina rivestite in piastre da 24 pozzetti con 500 ml di terreno di coltura a 37 ° C e 5% CO 2 per almeno 3 h .
- I preparativi prima della dissezione cuore
- Immunofluorescenza su cardiomiociti isolati Langendorff-in sospensione
- Fix cardiomiociti Langendorff isolate in 1 mL di 4% PFA in PBS, pH 7,4, per 15 min a temperatura ambiente. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente, rimuovere il fissativo e lavare le cellule due volte con PBS.
- Risospendere i cardiomiociti fisse in 1 ml di PBS e sia procedere con la colorazione di immunofluorescenza o memorizzarli in 500 ml di PBS per pozzetto suuna piastra da 24 pozzetti a 4 ° C. Trasferire una parte della sospensione cellulare (~ 100 - 200 l) in una provetta. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
- Permeabilize, blocco, e macchiare le cellule con anticorpo primario contro α-actinina aggiungendo 200 ml di anticorpo primario diluito 1: 400 in PBS con 0,2% Triton X-100 e 5% di siero asino per 1 ora a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Lavare il pellet di cellule con PBS e centrifugare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e incubare in 200 ml di Alexa-Fluor-coniugato anticorpo secondario (anti-topo IgG1) diluito 1: 400 in tinta Hoechst (soluzione di lavoro: 1 mg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Centrifugare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio. Proteggere il campione dalla luce. Resuspend le cellule nel 200 - 500 ml di PBS e trasferire 100 - 300 ml di sospensione cellulare in un pozzetto di una camera di microscopia. Chiudere il coperchio della camera e conservare le cellule a 4 ° C fino imaging. Proteggere dalla luce.
- Analisi della nuclearità di cardiomiociti Langendorff isolate
- Prendere immagini dal cardiomiociti α-actinina-tinto con un obiettivo 25X, corrispondente ad un ingrandimento 250X. Contare il numero di nuclei H2B-MCH + solo in quei cardiomiociti che sono regolarmente macchiati da α-actinina e mostrano tipica forma di bastoncello morfologia e sono quindi considerate intatte.
- Contare almeno 100 cardiomiociti da tre diversi cuori. Calcolare le percentuali di mononucleari, binuclear, e cardiomiociti trinuclear.
NOTA: in genere, le cellule binucleari dovrebbe costituiscono circa l'80 - 90%, mentre le cellule trinuclear e quelli con un maggior numero di nuclei sono rare (<1% in cardiomiociti Langendorff-isolate, <3% in fette spesse). cardiomiociti atriali sono significativamente più piccola di cardiomiociti ventricolari. Tipicamente, le cellule mononucleate costituiscono il 90% della popolazione totale.
- L'isolamento, la fissazione e la crioconservazione dei cuori adulti come preparazione per fette spesse
- Assemblare un apparato perfusione per il fissaggio collegando una siringa da 50 ml a un rubinetto a 3 vie con un tubo di estensione Heidelberger ed un secondo rubinetto a 3 vie. Fissare la siringa in una posizione in modo tale che il flusso-through viene abilitato per gravità. Riempire il sistema con 15 ml di PBS.
- Seguire i passaggi 2.1.2.1-2.1.2.4, "preparazione cuore". Collegare la cannula iniezione G20x1 ½ con il cuore per l'adattatore Luer lock dell'apparato perfusione-PBS-riempite senza bolle e profumato con PBS. Riempire il sistema con 10 - 15 mL di formaldeide al 4% in PBS, che viene poi perfusi attraverso il cuore. Immersione fissare il cuore in una soluzione di formaldeide al 4% durante la notte.
- Sostituire la formaldeide 4%soluzione con PBS e lavare cuore in PBS su un agitatore orizzontale a 150 rpm per 8 ore a temperatura ambiente. Sostituire il PBS con una soluzione di saccarosio al 20% per disidratare cuore notte a 4 ° C.
- Congelare il cuore in medio crio-embedding in un piccolo stampo.
- Impostare un bicchiere pieno di 2-metilbutano e metterlo in un contenitore con ghiaccio secco. Mettere il cuore in uno stampo di congelamento precedentemente riempito a metà con crio mezzo di inclusione e coprire completamente con crio mezzo di inclusione. Posizionare con cura lo stampo nel bicchiere freddo, evitando il contatto del mezzo di crio-embedding con il 2-metilbutano. Conservare il tessuto congelato a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparazione di fette spesse di cuore
- Utilizzare la seguente configurazione in un cryotome: una temperatura oggetto di -18 a -20 ° C, una temperatura della camera di -21 a -23 ° C, un angolo di compensazione sul porta-lama di 4 °, e le lame del microtomo Feather R35.
- Prendere la o crioconservatirgan dal contenitore congelamento e fissarlo sul disco dei campioni con il mezzo crio-embedding utilizzando lo scaffale di congelamento rapido. Posizionare cuore in modo tale che sezionamento inizia all'apice.
- Tagliare via fette di 50 micron fino a quando un piano di taglio uniforme è raggiunto e l'organo diventa visibile. Tagliare 50 micron fette di tessuto utilizzando la cryotome in modo manuale con una velocità lenta e con la piastra anti-rollio collocato sul coltello. fette di montaggio su vetrini da microscopio soluzione salina trattata. Lasciare le fette asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente e conservare i campioni a -80 ° C o macchia direttamente.
- La colorazione di fette di cuore di spessore (nuclei e membrane cellulari)
- Trattare fette cuore con RNasi A (20 mg / ml) in tampone di lavaggio (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5, e 50 mM EDTA) in una cuvetta per 1 ora a 37 ° C. Incubare le fette in 0,2% Triton-X in tampone di lavaggio per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le fette due volte per 5 minuti ciascuno in tampone di lavaggio in una cuvetta su unaagitatore orizzontale a temperatura ambiente.
- Stain notte con 1 pM TO-PRO3 ioduro (642/661) e fluoresceina accoppiato germe di grano agglutinina (WGA, 1: 100) in tampone di lavaggio a 4 ° C. Lavare le fette di tre volte per 5 minuti ciascuno con tampone di lavaggio in cuvette su un agitatore orizzontale e coprirli con alcol polivinilico mezzo di montaggio con un reagente anti-sbiadimento e un vetrino di vetro.
- Acquisizione dell'immagine
- Idealmente, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertito dotato di 40X / 1.15 NA obiettivo acqua-immersione. Ricerca per occhio per un'area all'interno della fetta che si compone di cardiomiociti longitudinalmente allineati; a tal fine, il canale fluoresceina-WGA (Es .: 488 nm) è più adatto.
NOTA: Questo passaggio è essenziale, come i limiti superiori e inferiori dei cardiomiociti dovrebbero essere visibili nel z-stack per successive analisi. Poiché la profondità di imaging è limitata a ~ 30 nm e lo spessore della fetta è 50 um, non è possibile imsezioni trasversali età di queste cellule (lunghezza delle cellule: ~ 120 micron). - Regolare la messa a punto all'interno del software di imaging. Aprire il software di imaging. Aperte A1plus Impostazioni e selezionare le caselle di CH2, CH3 e CH4. Impostare Ch2 per eGFP, Ch3 a Alx546, e CH4 per Alx647 cliccando sul menu a tendina.
- Per ogni canale, cliccare su HV e impostarlo su 80 utilizzando la barra di scorrimento. Impostare l'offset a 0 utilizzando le barre di scorrimento. Fare clic sul pulsante "Home" per impostare il foro stenopeico alla posizione iniziale. Impostare il formato di scansione di 1.024 x 1.024 cliccando sul menu a tendina e fare clic su Ottimizza per aprire la finestra "XYZ Size Setup". Selezionare la casella "perfetto Voxel" sotto "Passo suggerito (z)".
- Clicca su "live scan" e regolare l'intensità del laser, cliccando sulle barre di scorrimento sui singoli canali. Selezionare la casella "Serie Z" sulla finestra "ND Acquisition" e fare clic sulla casella "definito dal pulsante in alto". Definire la parte superiore ePulsante della z-stack facendo clic sui pulsanti appropriati dopo aver regolato la messa a fuoco sul microscopio. Impostare la larghezza Z-passo a 0,5 micron.
NOTA: La profondità della z-stack è limitata dalla penetrazione ottica all'interno del tessuto e il rapporto segnale-rumore. - Vai a "A1plus Impostazioni" e impostare la linea di media / integrale per 2-4 facendo clic sul menu a tendina. Mettere a punto le intensità del laser; il foro deve essere il più piccolo possibile per immagine con un piano focale.
- Idealmente, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertito dotato di 40X / 1.15 NA obiettivo acqua-immersione. Ricerca per occhio per un'area all'interno della fetta che si compone di cardiomiociti longitudinalmente allineati; a tal fine, il canale fluoresceina-WGA (Es .: 488 nm) è più adatto.
- Analisi di nucleazione
- Aprire il software di analisi di immagine e caricare lo z-pila di interessi.
- determinare manualmente nucleazione nelle z-stack scorrendo attraverso i diversi strati della pila per identificare le cellule che si trovano completamente all'interno della pila; questo è il caso quando la colorazione WGA è visibile in tutte le dimensioni. Contare il numero di nuclei (la maggior parte di loro sarà binuclear) e segnare la cellula analizzata da un'annotazione nel software. <li> Determinare il numero di nuclei cm (H2B-MCH +) e nuclei totali (TO-PRO3 +) in ricostruzioni 3D per i singoli canali (Figura 2D). Nel software di imaging, clicca su "binari" e scegliere "Definisci Soglia 3D" dal menu a tendina. Scegliere dal menu a tendina del canale sia Alx546 per il numero di nuclei CM o Alx647 per il numero di nuclei totali. Cliccando le frecce appropriate, impostare il programma per "4x Smooth", Clean 1x, e riempire i fori ON. Selezionare la casella "Dimensione" e impostarlo su 5 micron utilizzando la barra di scorrimento. Impostare la soglia utilizzando la barra di scorrimento fino a quando compaiono oggetti separati.
NOTA: Dopo aver applicato la frammentazione, la finestra dei risultati mostra una tabella di eventi quantificati e una frammentazione di colore dell'immagine. Come alcuni nuclei contatti direttamente tra loro, correggere manualmente il risultato della misurazione automatica per doppietti, che potrebbero non essere separati correttamente dal software.
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Representative Results
Al fine di analizzare gli effetti di siRNA / miRNA sull'attività ciclo cellulare di cardiomiociti post-natale in vitro, cardiomiociti di topi Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doppio transgenici sono stati isolati in postnatale giorno 3 (P3) e transfettate con ciclo cellulare attività che inducono miR199 5, siRNA p27, e siRNA Fzr1. Rispetto al controllo negativo (Figura 1A), le immagini di miR199- (Figura 1B) e siRNA p27- (Figura 1C) transfettate cardiomiociti mostrano una induzione dell'attività ciclo cellulare. Nel modello murino eGFP-anillin, siRNAs contro Fzr1 possono essere utilizzati come controlli trasfezione, come l'inibizione della Fzr1 porta all'accumulo di proteina di fusione eGFP-anillin nei nuclei delle cellule transfettate e una perdita di Fzr1 porta alla inibizione della APC Fzr1. Fzr1 è un cofattore del complesso ligasi E3 anaphase di promozione, che si rivolge anillin per proteasdegrado OMAL. Figura 1D mostra una foto panoramica confocale dei cardiomiociti siRNA Fzr1 transfettate 3 giorni dopo la trasfezione, che indicano una efficienza di trasfezione del ~ 45%. Cardiomiociti che eseguono endoreduplicazione (ad esempio, dopo l'atterramento di p27 6) mostrano espressione eGFP-anillin esclusivamente nucleare (Figura 1E) o sono eGFP-anillin negativo (vedi la discussione). Essi non esprimono eGFP-anillin in fase M-tipica localizzazioni (Figura 1F e G), come endoreduplicazione consiste solo in una fase di endo-S (eGFP-anillin-positivo) e una fase endo-G (eGFP-anillin-negative ). Nella fase di endo-G, l'APC è attiva, con conseguente ubiquitinazione e la degradazione di eGFP-anillin nel proteasoma.
La quantificazione di porzioni cardiomiociti mono- e binucleate allo stadio adulto può essere effettuata sia a livello di singola cellula dopo la Landissociazione gendorff di Myh6-H2B-MCH cuori transgenici o in spessore cryoslices di cuori transgenici. Dopo la digestione enzimatica del tessuto cardiaco al Langendorff apparecchi, atri e ventricoli può essere separata meccanicamente e analizzato indipendentemente l'uno dall'altro. La figura 2A mostra un quadro rappresentativo dei cardiomiociti ventricolari transgenici H2B-MCH non fissi dopo l'isolamento Langendorff con un alto grado di cardiomiociti binucleate, come indicato dall'espressione H2B-MCH nucleare. Al contrario, la maggior parte dei cardiomiociti atriali sono mononucleate (Figura 2B). Come la digestione enzimatica non comporta singole cellule 100%, il modello di cross-striation rivelato da α-actinina colorazione facilita discriminazione tra cardiomiociti binucleate (modello continuo di cross-striatura, Figura 2C) e doppietti cellulari. La figura 2D mostra un esempio di identificazione di un cardiomiociti binucleate in allefetta Hick.
ricostruzioni 3D di spesse fette di adulti Myh6-H2B-MCH cuori transgenici possono essere utilizzati per determinare la percentuale di nuclei cardiomiociti in condizioni fisiologiche all'interno del tessuto. Con il modulo 3D di software di imaging, i nuclei Hoechst-macchiati e nuclei H2B-MCH-positivi possono essere rilevati e contati automaticamente, come illustrato nella figura 2E. Il risultato finale dovrebbe essere corretto manualmente per doppietti, cioè nuclei che toccano direttamente tra loro, in questo caso. Per analizzare l'indice di nucleazione dei cardiomiociti in fette spesse, è necessario scorrere manualmente attraverso lo stack, come i nuclei non si trovano necessario all'interno di un piano z. WGA colorazione consente la rilevazione dei margini delle celle.
Figura 1: Esempi di AVitro visualizzazione di Cell ciclo di attività in postnatali cardiomiociti dopo trasfezione con siRNA. (AD) cardiomiociti P3 da eGFP-anillin / cuori Myh6-H2B-MCH colorate per α-actinina (bianco). nuclei cardiomiociti sono identificati dal segnale H2B-MCH (rosso), l'attività del ciclo cellulare da segnali eGFP-anillin (verde), e dei nuclei con Hoechst colorante nucleare (blu). Cardiomiociti (A) P3 trasfettate con scramble siRNA servono come controllo negativo. Il bar è di 100 micron. Cardiomiociti (B) P3 trasfettate con miRNA-199 Display significativamente più segnali eGFP-anillin rispetto al controllo (A). Il bar è di 100 micron. (C) Esempio di segnali eGFP-anillin esclusivamente nucleare dopo trasfezione con siRNA p27, che indica endoreduplicazione. Il bar è di 80 micron. (D) trasfezione con siRNA contro Fzr1 per la determinazione dell'efficienza di trasfezione. Come eGFP-anillin accumula, il numero di eGFP-anillin + cardiomiociti indica l'efficienza di trasfezione. Il bar è di 80 micron. (EG) diverse localizzazioni di eGFP-anillin (verde) in cardiomiociti durante il ciclo cellulare: localizzazione nucleare (freccia in E), l'anello contrattile (frecce in F), e localizzazione corpo centrale (freccia G). La barra è di 20 micron di (E) e 10 micron di (F e G). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi per la valutazione della multinucleazione dall'isolamento Langendorff dei cardiomiociti da topi H2B-MCH e dall'analisi 3D di fette spesse. (A, B) ventricolare (A) e atriale (B) cardiomiociti da cuori da H2 adultiB-MCH topi transgenici dopo l'isolamento dalla Langendorff dissociazione. I bar sono 50 micron. (C) Cardiomyocytes dai cuori Myh6-H2B-MCH colorate per α-actinina (verde). nuclei cardiomiociti sono identificati dal segnale H2B-MCH (rosso). Il bar è 10 micron. Cardiomiociti (D) binucleate in una fetta spessa (frecce). nuclei cardiomiociti sono identificati dal segnale H2B-MCH (rosso), i bordi delle celle di WGA colorazione (verde), e dei nuclei di ToPro3 (bianco). Il bar è di 50 micron. (E) Flusso di lavoro per l'analisi 3D di binucleazione in tranci. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
C'è una polemica sul fatto cardiomiociti sono in grado di rientrare nel ciclo cellulare e dividere dopo l'infortunio e durante l'omeostasi dei tessuti. I valori per il fatturato base dei cardiomiociti hanno ricevuto nell'intervallo tra 1% e 80% 1 7. Anche dopo una lesione cardiaca, l'induzione dell'attività ciclo cellulare e la generazione di nuovi cardiomiociti è stata riportata nella zona di confine, con valori compresi tra 0,0083% 8 e 25 - 40% 7. Queste discrepanze possono essere spiegate in parte da diversi approcci sperimentali per identificare i nuclei cardiaci, un processo che è molto impegnativo su sezioni istologiche 9 e durante la divisione cellulare. Come cardiomiociti sono inclini a variazioni del ciclo cellulare, è di cruciale importanza per distinguere autentico divisione cellulare da endoreduplicazione e mitosi acytokinetic, che portano a cellule poliploidi e multinucleate. Perl'identificazione di divisione cellulare, è necessario visualizzare caratteristiche di divisione cellulare, quali anelli contrattili e midbodies, così da determinare la percentuale di cardiomiociti binucleate. Abbiamo sviluppato tecniche per analizzare l'attività del ciclo cellulare in cardiomiociti in dettaglio e per determinare il loro grado di nuclearità in cellule isolate o in sezioni spesse.
È importante notare che il sistema di eGFP-anillin fornisce prova diretta della divisione cellulare, attraverso la visualizzazione di un anello simmetrica contrattili (Figura 1F) e il corpo centrale (Figura 1G), e la prova indiretta endoreduplicazione e mitosi acytokinetic. Come precedentemente descritto, il verificarsi di un ingression unilaterale dell'anello contrattile è un indicatore di binucleazione 10, e questo può essere osservata con il sistema di eGFP-anillin.
Endoreduplicazione è suggerito a patto che nessun anello contrattile o midbody sono osservati, il che rende i calcoli delle probabilità di rilevare queste localizzazioni obbligatoria. Ipotizzando una durata del ciclo cellulare di 25 ore, una durata media di contrattile visibilità anello di 20 min, e una persistenza corpo centrale di 1 h, non ci dovrebbe essere 1 anello contrattile a 100 cellule in divisione eGFP-anillin-positivi e 4 midbodies. Statisticamente parlando, un minimo di celle 25 eGFP-anillin-positivi dovrebbe essere analizzata per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare. Questo numero cambia di conseguenza la durata del ciclo cellulare (che è spesso sconosciuta) aumenta o diminuisce. Ciò implica anche che la maggioranza dei segnali eGFP-anillin sarà nucleare (Figura 1E), come fase M, l'unica fase con localizzazioni non nucleari, dura solo circa 1 h.
Durante lo sviluppo postnatale, binucleazione avviene nei cuori del mouse e aumenta al 90% in cardiomiociti ventricolari (~ 25% negli uomini) 11. for l'analisi della rigenerazione nel cuore, è importante per determinare il grado di binucleazione. Descriviamo due metodi per affrontare questa importante caratteristica morfologica: vale a dire, Langendorff dissociazione e la creazione di grosse sezioni di tessuto cardiaco. Mentre isolamento Langendorff è più facile e veloce, la morfologia di sezioni spesse è più tempo ma anche più preciso. È interessante notare, abbiamo trovato che l'isolamento Langendorff sopravvaluta la percentuale di cardiomiociti binucleari. Questo potrebbe essere dovuto a diversi tassi di sopravvivenza dei mononucleari e le cellule binucleari durante questa procedura piuttosto rigida.
Come l'induzione della proliferazione in cardiomiociti post-natali è un approccio emergente nella rigenerazione cardiaca, questo protocollo descrive un sistema di screening mediante la combinazione di due linee di topi transgenici, Myh6-H2BmCh e CAG-eGFP-anillin. Cardiomiociti isolati dai cuori su postnatale giorni P1 - P6 può essere facilmente colto e trasfettate con miRNA osiRNA o trattati con librerie di piccole molecole. nuclei cardiomiociti possono essere manualmente o automaticamente rilevati da algoritmi software, e potenziali "colpi" possono essere determinati da un aumento del numero di nuclei MCH +. La discriminazione di divisione cellulare da endoreduplicazione e mitosi acytokinetic può essere fatto quantificazione delle differenti localizzazioni dei segnali eGFP-anillin. Questo sistema dovrebbe fare un po 'nuova luce sul meccanismi di regolazione sottostante la proliferazione dei cardiomiociti post-natale e può portare alla scoperta di nuovi agenti terapeutici per il trattamento di malattie cardiache.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 mL syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
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- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
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