Summary
このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。
Abstract
細胞遊走は免疫応答、成長、および創傷治癒の重要な一部です。細胞遊走は、細胞外マトリックス、および可溶性および非水溶性の化学的因子（ 例えば 、化学誘引物質）との間の相互作用が関与する複雑なプロセスです。このようなボイデンチャンバーアッセイ、分周器のいずれかの側に細胞を計数することにより、作業のような細胞の遊走を測定するための標準的な方法。これらの技術は、使いやすいです。しかし、彼らは、異なるアプリケーションのために少しの幾何学的修正を提供しています。対照的に、マイクロ流体デバイスは、可溶性因子1、2のカスタマイズ可能な濃度勾配を有する細胞遊走を観察するために使用することができます。しかし、マイクロ流体ベースのアッセイを作製するための方法は、学ぶことは困難な場合があります。
ここでは、化学物質の濃度勾配に応答して細胞遊走を測定するための細胞培養チャンバを作成するための容易な方法を記載します。私たちの細胞マイルグレーションチャンバー法は、様々な用途のための細胞移動を研究するために、別の直線濃度勾配を作成することができます。この方法は、使用が比較的容易であり、典型的には学部学生によって行われます。
マイクロチャンネル室はよくペトリ皿に、最終的なマイクロ流路室の形状のアクリルインサートを配置することによって作成されました。この後、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）は、インサートの上に注ぎました。 PDMSを硬化させ、次いで、インサートを除去しました。これは、任意の所望の形状や大きさのウェルの作成を可能にしました。細胞は続いてマイクロチャネルチャンバーに添加することができる、可溶性薬剤は、所望の薬剤にアガロースブロックを浸漬することによってウェルのいずれかに添加することができます。アガロースブロックをウェルのいずれかに添加し、タイムラプス画像は、細胞遊走を定量するために、マイクロチャネル室を撮影することができます。この方法のバリエーションは、このメソッドのHIGを作り、所与の用途のために作ることができますHLYカスタマイズ可能。
Protocol
1.濃度勾配を作成するためにマイクロチャンネル発生室
- アクリル成形型部品を切削
- 所望の幅のアクリルの一部を取得します。典型的には、1/16インチ厚のアクリルシートを使用。より厚いシートは、それらが処理中に破損したり、ワープさせ、必要な機械的強度を持っていないだけでなく、非常に薄いシートをカットすることは困難です。
- ポリジメチルシロキサン（PDMS）内に空洞を生成するためにアクリル片の所望の形状のCADファイルを作成します。個々の実験プロトコルに関連する目的の勾配を達成するために、チャネル幅と長さを調整します。
- 0.127センチメートル広いチャネル（0.254センチメートル長い）（ 図1）によって接続された2つの正方形（のx 0.254センチメートル0.254センチメートル）：ここでは、以下の寸法のアクリル作品を使用しています。
- レーザー切断装置にCADファイルをインポートし、マヌーに応じてレーザーカッターでアクリルピースを配置facturerのプロトコル。
注：別の方法として、CAD設計から作品を3D-印刷します。この方法の利点は、代替材料が金型に使用することができることです。しかしながら、分解能および再現性は、レーザー切断に比べて三次元印刷に減少させることができます。
図1：マイクロチャンネル商工会議所のコンピュータ支援設計（CAD）表現。この画像は、マイクロチャネルのチャンバを作成するために必要なアクリルインサートのCAD図面を示します。 1 A）CAD図面、1B）インチに寸法とCAD図面の側面図、 図1C）インチに寸法とCAD図面の上面図の上面図この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 計量ボートでは、商業用エラストマー硬化剤（ 例えば 、シルガード194）1重量部で商業エラストマーベース（ 例えば 、シルガード184）10重量部を混合します。一般的に、エラストマー硬化剤の1グラムにエラストマーベースの10グラムを混ぜます。
- 5分間、マイクロピペットを用いて塩基及び硬化剤を組み合わせることかき混ぜます。
- 真空ベルを設定し、閉じ込められた気泡を除去するために30分間真空中でPDMSと計量ボートを配置します。
- 真空の電源を切り、計量ボートを削除します。小さなペトリ皿にアクリルカットアウトの上にPDMSを注ぎます。 PDMSが完全に挿入をカバーしていることを確認してください。
- PDMSは、室温で一晩（少なくとも18時間）を硬化させます。
- PDMSからの挿入を削除します
- PDMSを硬化させた後、慎重にメスでアクリル作品の周りにPDMSを切断することにより、インサートを取り外します。
2.マイクロチャネルチャンバー内の細胞をプレーティング
- 細胞をプレーティングするためのチャンバを殺菌します。
注：PDMSは、エチレンオキシドまたは他の技術を用いて滅菌することができるが、迅速なUV処理は、迅速、安価、および細胞培養研究のために十分です。短いUV処理時間はPDMS片の構造又は機械的完全性を損ないませんでした。- 標準的な細胞培養キャビネット内に、完全に70％エタノールを用いてチャンバを覆います。
- 蓋をオフにして、層流フード内でペトリ皿を置きます。
- フードを終了し、UV光をオンにします。 1〜2時間UV光にさらします。
- 層流フードを開き、流れを再確立するために15分を待ちます。
- 70％エタノールを削除します。
- 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回チャンバを洗浄します。各洗浄のために1mLのPBSを使用してください。 PBSを削除し、室は蓋をオフにして一晩乾燥させます。
注：別の方法として、代わりに1が利用可能な場合、層流フードを使用しての、滅菌のためにUVチャンバーボックスを使用します。アルミホイルを敷いた段ボール箱の裏面にUV光源を配置することによって、UVボックスを作成します。アルミ箔は、サンプルの均一な照明を可能にするために光を反射します。
- チャンバー内の細胞をプレーティング
- トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 0.4％トリパンブルーの400μLに100μLの細胞懸濁液を加え、穏やかに混合。静かにカバーガラスの下で両室を充填することにより、血球計数器に、この溶液100μLを適用します。
- 血球計数器上のグリッドに注力して10X対物レンズで顕微鏡を使用してください。血球計数器上の16の正方形の1セット内生非染色細胞をカウントするために手の数取器を使用してください。
- 16の正方形のすべての4組のセルをカウントします。 16の正方形の4セットからの平均細胞数を取り、5×10 4を掛け。この最後の番号はnumbeです細胞懸濁液中の細胞/ mLのR。
- 各チャンバ内の1つのウェルに2,500細胞を追加します。これは〜3万/ cm 2の近コンフルエント細胞密度に変換されます。
- 細胞は培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）を加える前に、60分間室内に座ってできるようにします。
- トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を数えます。
3.デキストラン浸しアガロースブロック
- アガロースブロックを作成します
- 3Dプリントモールド（2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートル）にアガロース3％を注ぎます。
- アガロースは、任意の気泡を除去するために30分間、真空チャンバー内に固化することができます。
- 金型からアガロースブロックを削除します。
注：別の方法として、2ミリメートルの厚さで小さなペトリ皿にアガロース3％を注ぎます。メスまたは他の切削工具を使用して、2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートルのブロックをカット。これは、金型システムのように正確ではありませんが、それを行うのは少し楽にすることができます。
- 完全submerg走化性因子の所望の濃度の溶液中での電子アガロースブロック。濃度勾配の形成を評価するために、蛍光デキストランで第一室をフラッシュします。デキストランの濃度および分子量は、目的の可溶性因子または薬物のそれと一致する必要があります。
- アガロースブロック一夜を浸します。
可溶性因子の濃度勾配を評価するために、デキストラン拡散の4タイムラプス
- マイクロチャネル室の小さな正方形のウェルにデキストラン浸したアガロースブロックを配置します。
- セルイメージングシステム内のマイクロチャネル室を配置したり、タイムラプス機能を備えた別の蛍光顕微鏡を使用しています。製造元の指示に従ってタイムラプスを開始します。
注：示された結果は、GFPフィルター、50％の光、4月10日のpH、および4倍の倍率で撮影されています。
細胞増殖の5タイムラプス
- の一端にマイクロチャネルチャンバー内板細胞チャンバー。ここでは、3T3線維芽細胞を使用しています。マイクロチャネルチャンバー内で1つのウェルに2,500細胞を追加します。 2.2.1で説明したように、細胞をカウントします。
- 細胞は培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）を加える前に、60分間室内に座ってできるようにします。 5％CO 2中37℃で播種した細胞とマイクロチャンネル室を保管してください。チャネルを介して細胞遊走を顕微鏡で見ることができます。
- マーカーを追加または距離セルフロントの動きを定量化するための出発点として機能するために、マーカーとしてチャンバ内の微小欠陥を使用します。
- マイクロチャネルの一方の端部に集中し、成長因子、化学誘引物質、薬物、または他の因子が試験される（ここで、40％FBSを例として使用されている）を含むアガロースゲル（8 mm 3でブロック）を配置することによって勾配を確立しますチャンバー。
- 移動セルフロントのタイムラプス画像を撮影します。ここでは、結果があちこちセルの画像を表示しますNTイメージングシステムを用いて12時間ごとに採取したもの。
- 細胞増殖速度を定量化するために、セルの前面の写真を使用してください。最初のセルのフロント、チャネル壁、及び基準マーカによって定義される多角形のマスクを作成する（roipoly）MATLABの関数polyfitを使用して、増殖速度を計算します。このマスクの寸法は、平均セルフロント速度が算出されたフロントの移動距離をもたらします。他の研究では、同様の方法8を利用しています。
注：同じ距離で可溶性因子の濃度になるように、各フレーム上の細胞増殖前面の縁を比較してください。可溶性因子の濃度勾配は、1次元拡散モデルの近似を用いて計算されます。 - ファロイジンおよびDAPI染色を用いて細胞の蛍光画像を撮ります。
- ファロイジンで染色する前に細胞を固定。
- 37℃で温め、4％パラホルムアルデヒド。
- セルをカバーするのに十分な4％パラホルムアルデヒドを加えます。で細胞を保ちます10分間パラホルムアルデヒド。
- 15分間、PBSで2回、それぞれの時間をすすぎます。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。
- 細胞からPBSを除去し、細胞をカバーするのに十分な透過化溶液（PBS中0.1％トリトンX-100）を追加します。 10分間この溶液を残します。
- 毎回5分間、PBSで2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。
- 細胞からPBSを除去し、20分間溶液（PBS中の1％ウシ血清アルブミン）でブロッキング加えます。
- ブロッキング溶液を除去し、5分間PBSで各回2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。
- 使用されていない場合、この時点から、アルミニウム箔で光から細胞を保護します。細胞からPBSを削除し、1時間、PBSで希釈したファロイジン488 1:50に追加します。
- 各洗浄のための5分間、PBS中で2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。次に、細胞からPBSを削除します。
- 15分間、細胞をPBS 1,000：DAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を追加し、1に希釈しました。
- DAPIを削除し、各洗浄のための5分間PBSで2回細胞を洗浄します。
- 最後の洗浄を削除し、セルをカバーするのに十分なPBSを追加します。細胞は、現在、蛍光顕微鏡で画像化することができます。
- ファロイジンで染色する前に細胞を固定。
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Representative Results
図2は、細胞がメッキされているところから、チャネルの反対側の端部に配置されたウシ胎児血清の勾配に応じて、チャネル全体のセルフロントの動きを示しています。細胞フロント48時間（ 図2A）、72時間（ 図2B）、96時間（ 図2C）、および120時間（ 図2D）ポストプレーティングで示されています。セルフロントの移動は、これらのタイムラプス画像で追跡し、移動距離と成長率は、MATLABの関数polyfitによって計算しました。このことから、平均セルフロント速度が13.4ミクロン/時（ 図3）であることが見出されました。 図4は、チャネルの一端にデキストラン浸したアガロースブロックを配置し、デキストランは、12時間のためのチャネルを通って拡散することを可能にすることによって確立された蛍光勾配を示しています。タイムラプス画像は、毎時間で撮影した、との距離を横断蛍光ました 図4に示されており、1次元拡散モデルと比較してチャネルを測定し、プロットしました。
図2：細胞フロントムーブメント。チャネルを通って移動するマイクロチャネルチャンバー内の細胞フロントのタイムラプス画像。セルの前面には、オレンジ色の線でマークし、移動距離は含まれています。示すように、この移動距離は、プレート上のマークからの細胞前部の前面に測定しました。 、1mmのスケールバーは白色で示されています。 A）48時間後メッキ、B）72時間後メッキ、C）96時間後メッキ、D）120時間後のめっき。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3：成長率の計算。タイムラプス画像で追跡セルフロントの動き。成長速度が13.4ミクロン/時間の平均セルフロント速度を得るためにMATLABの関数polyfitを（roipoly）を用いて計算しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：デキストランと蛍光グラデーション。蛍光強度は、各行が特定の時間での勾配を表し、チャネルの距離を横断して測定します。 ImageJの蛍光強度を算出しました。これは、分析使用して行うことができます|ものさしツール。まず、分析し、選択強度の下にセット測定を選択します。そして、AVE取得するために、分析の下でメジャーを選択怒りの画素強度。この図に示すように、これは、ミクロン単位での距離に対してプロットすることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々のマイクロチャネル室は、成長因子及び化学誘引物質に応答した細胞遊走の速度を決定し、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することを含む、目的の多数のために使用することができます。細胞を増殖し、チャンバの一端に化学誘引物質を配置するために我々のマイクロチャネル室を利用することが可能です。細胞は、化学誘引物質に応答して成長し、細胞遊走、細胞移動速度を決定するために分析することができるタイムラプス画像を撮影することによって定量することができます。この方法の代表的な結果は、成長速度は、MATLAB関数polyfitを使用して13.4ミクロン/時間であると決定された、図3に示されています。
我々のマイクロチャネル室の別の使用は、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することです。関心対象の薬剤と同様の分子量の蛍光タグ付けされたデキストランはDRUの拡散をモデル化するために使用することができます興味のあるグラム。サンプルは、勾配を崩壊させるだろう対流の大量として慎重に取り扱わなければならないことに留意することが重要です。この方法の代表的な結果を図4に示します。ボイデンチャンバーアッセイと比較してこのモデルの利点は、それがために平らな表面の付着細胞型に対してより適用可能であることです。一方、細胞が接着する前に、Boydenチャンバー内の小さな管を通って落下する必要があります。ボイデンチャンバーアッセイの別の制限は、エンドポイントアッセイであることです。従って、走化性を目視で観察することができません。これとは対照的に、我々の方法では、走化性は、タイムラプス画像9を通して観察されます。化学誘引物質を含有するマイクロピペットの使用は、細胞遊走を観察する方法が用いられてきました。しかし、この方法の主な欠点は、低いスループット10です。ダンの走化性チャンバーは番目のようなタイムラプスイメージングと組み合わせて使用されている別のアッセイでありますE法は、ここで図11、 図12を詳述します。チャンバは、内側と外側のウェルを作成するために、スライドガラスの表面に刻まれた2つの同心円からなり、ブリッジが2つのウェルを分離します。化学誘引物質は、外側のウェル内に配置され、細胞は、外側のウェルに内側のウェルから移行することを許可されています。この移行は、画像解析ソフトウェアを用いて分析されたタイムラプス画像を用いて定量します。ボイデンアッセイと同様に、ダンチャンバーアッセイの限界の一つは、容易にカスタム可溶性因子の濃度勾配を作成するように変更することができないことです。
細胞移動を評価するための別の簡単な技術は、インビトロ 13スクラッチです。それだけで以前に作成したスクラッチに近い細胞移動のタイムラプス画像の細胞単層およびキャプチャでスクラッチを作成する必要があり、この方法は、高速かつ安価です。 HowevER、この方法の主な欠点は、化学的因子の濃度勾配に応答を測定するのに適していないということです。私たちの方法は、化学勾配を作成し、化学的勾配に細胞遊走を相対定量化する可能性を提供しています。走化性因子は、マイクロチャネルチャンバーのウェルの中に存在している間我々の方法は、細胞単層に作成することができるスクラッチなどの傷の方法と組み合わせることができます。これは、創傷治癒の定量化とモデリングを可能にします。我々の装置の別の潜在的な適用は、細胞増殖を阻害する薬剤に対する癌細胞の応答を決定することです。
他のマイクロ流体ベースのシステムはまた、細胞遊走実験14、15のために使用されています。これらの研究は、シリコンウェーハ内のマイクロ流体チャネルを作成するために、シリコンおよび/またはレーザー加工でマスターモールドを作成するためにクリーンルームでリソグラフィ技術を利用します。シリコンwafeRマイクロ加工は、マイクロチャネルのチャンバを製造する安価な材料（PDMS及びアクリル）を利用する手法と比較して高価であることができます。我々のデバイスは、小型の3次元チャネル15を作成することは不可能であった他のPDMSベースのマイクロ流体デバイスの限界を克服します。我々の方法では、我々が正常に小径チャンネルをPDMSベースのデバイスを作成しました。他の研究では、マイクロチャネルの二つの層を有するPDMSベースのマイクロ流体デバイスおよび酸素16の異なる勾配で細胞の遊走を研究するために、酸素の任意の勾配を作成するために、コンピュータ制御されたマルチチャンネルガス混合器を使用しています。我々のデバイスは、マイクロチャネルのチャンバの一端にガス混合室を添加して同様の方法で使用するための可能性があります。
マイクロ流体デバイスは、多くの場合、ソフトリソグラフィ技術を用いて作製されます。これらは、細胞遊走chambeを生成するように構成することができますRS。これらの方法は、コンピュータ支援設計（CAD）を有するチャネルパターンを有するマスクを印刷することを含みます。これらのマスクは、その後、光リソグラフィを介して感光性レジストで被覆されたマスターモールド上に投影されています。マスターモールドが行われた後、PDMSをマスタに注ぎ、マイクロ流体研究17、18、19のために使用することができるPDMS金型を作成するために硬化させます。化学誘引物質または化学反発化合物は、勾配17を作成するために、リザーバのいずれかに高濃度でチャンバー内に配置されています。これらの技術は私たちのセットアップに似ていますが、それらは、システムおよびクリーンルームの使用のためのマスターモールドを作成する高コストのために高価になることができます。学生はクラスベースの設定で学習するために加えて、これらの方法は、困難であり得ます。チャネルを作成するために私たちのセットアップに使用されるインサートは、3D広報を含む種々の方法で作成することができますintingとレーザー切断。したがって、我々のシステムは、3Dプリントは、より手頃な価格で広く利用可能になり、特に、比較的低コストのための金型の多種多様を作成できます。
細胞遊走および増殖を測定するためのマイクロ流体デバイスをベースPDMSは、広範囲の用途に使用されています。例えば、神経科学の研究は、デバイスは、PDMS成分を可能にするために、ミクロンサイズの溝に物理的バリアによって分離された2つの区画を形成するために、組織培養皿またはガラス上に載置されたソフトリソグラフィー技術を用いて製造した、20研究します区画全体で成長するニューロン。タイムラプス画像は、関門を通過するニューロンを示すために取られました。我々のデバイスの製造方法が簡単であり、すべてのレベルの研究者によって使用することができるが、このデバイスを製造するために使用される微細の方法は、複雑です。別の研究ではまた、SIを製造するための簡単な低コストの方法を使用しマイクロチャネルを生成するために、PDMSで印象を作成するために、スコッチテープから作成されたマスターモールドを使用してmilar PDMSマイクロ流体デバイス。この方法で説明した1以上の我々のアプローチの利点は、このプロトコルは、細胞21への媒体流の問題を作成する2 PDMS層の間の接着性を必要とする私たちの方法でチャネルは、1工程で作製されていることです。
結論として、我々のマイクロチャネルチャンバー法はカスタマイズ可能であり、異なる結果を得るために使用することができます。メソッドは、ユーザーのニーズに合うために濃度勾配を作成できます。さらに、我々のデバイスは、その比較的低いコストとあらゆるレベルの研究者のための使いやすさに、既存のデバイスに勝る利点を提供しています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、このプロジェクトのための資金を提供するためのクレムソン大学のクリエイティブ照会プログラムとNSF CBET1254609を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
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