Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

मापने सेल प्रवास के लिए एक अनुकूलन चैंबर

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Clemson University

Summary

इस प्रोटोकॉल chemoattractants है कि यह भी एक बहुलक मैट्रिक्स के बाहर एक दवा के प्रसार की दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के जवाब में सेल प्रवास को मापने के लिए एक अनुकूलन विधि का विवरण।

Abstract

सेल प्रवास प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, विकास, और घाव भरने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। सेल प्रवास एक जटिल प्रक्रिया है कि कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स, और घुलनशील और गैर-घुलनशील रासायनिक कारकों (जैसे, chemoattractants) के बीच बातचीत शामिल है। ऐसे Boyden चैम्बर परख, एक विभक्त के दोनों तरफ कोशिकाओं की गिनती से काम के रूप में कोशिकाओं, के पलायन को मापने के लिए मानक तरीकों। इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं; हालांकि, वे विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए थोड़ा ज्यामितीय संशोधन की पेशकश करते हैं। इसके विपरीत, microfluidic उपकरणों घुलनशील कारकों 1, 2 की अनुकूलन एकाग्रता ढ़ाल के साथ सेल प्रवास निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, microfluidics आधारित assays बनाने के लिए तरीके जानने के लिए मुश्किल हो सकता है।

यहाँ, हम रासायनिक एकाग्रता ढ़ाल के जवाब में सेल प्रवास को मापने के लिए सेल संस्कृति कक्षों के निर्माण के लिए एक आसान विधि का वर्णन है। हमारे सेल MiGration चैम्बर विधि आवेदनों की एक किस्म के लिए सेल प्रवास का अध्ययन करने के क्रम में विभिन्न रेखीय एकाग्रता ढ़ाल बना सकते हैं। इस विधि का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और आम तौर पर स्नातक छात्रों द्वारा किया जाता है।

microchannel चैम्बर में अच्छी तरह से एक पेट्री डिश में अंतिम microchannel कक्ष के आकार में एक एक्रिलिक डालने रखकर बनाया गया था। इस के बाद, पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) डालने के शीर्ष पर डाल दिया गया था। PDMS कड़ा करने के लिए अनुमति दी गई थी और तब सम्मिलित हटा दिया गया था। यह किसी भी वांछित आकार या आकार में कुओं के निर्माण के लिए अनुमति दी। कोशिकाओं बाद microchannel चैम्बर के लिए जोड़ा जा सकता है, और घुलनशील एजेंटों वांछित एजेंट में एक agarose ब्लॉक भिगोने से कुओं में से एक को जोड़ा जा सकता है। agarose ब्लॉक कुओं में से एक को जोड़ा गया है, और समय चूक छवियों आदेश सेल प्रवास यों तो में microchannel चैम्बर के लिए ले जाया जा सकता है। इस विधि के लिए बदलाव किसी दिए गए आवेदन के लिए बनाया जा सकता है, इस विधि hig बनानेhly अनुकूलन।

Protocol

1. एक microchannel चैंबर निर्माण करना एक एकाग्रता ढाल बनाने के लिए

  1. एक एक्रिलिक ढालना टुकड़ा काट
    1. इच्छित चौड़ाई के एक्रिलिक का एक टुकड़ा प्राप्त करते हैं। आम तौर पर 1/16-इंच मोटी एक्रिलिक शीट का उपयोग करें। मोटा शीट अच्छी तरह से और बहुत पतली शीट में कटौती करने के लिए अपेक्षित यांत्रिक शक्ति की जरूरत नहीं है मुश्किल कर रहे हैं, उन्हें इस प्रक्रिया के दौरान तोड़ने या ताना के कारण।
    2. एक्रिलिक टुकड़ा के वांछित आकार के साथ एक सीएडी फ़ाइल बनाएं polydimethylsiloxane (PDMS) के भीतर एक गुहा का उत्पादन। व्यक्तिगत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक वांछित ढाल प्राप्त करने के लिए चैनल चौड़ाई और लंबाई को समायोजित करें।
      1. दो चौकों (0.254 सेमी x 0.254 सेमी) (0.254 सेमी लंबे) एक 0.127 सेमी चौड़ा चैनल से जुड़े हुए (चित्रा 1): यहाँ, निम्नलिखित आयामों की एक एक्रिलिक टुकड़े का उपयोग करें।
    3. मनु के अनुसार एक लेजर कटर में लेजर काटने तंत्र में सीएडी फ़ाइल आयात और एक्रिलिक टुकड़ा जगहfacturer प्रोटोकॉल।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, सीएडी डिजाइन से टुकड़ा 3 डी-मुद्रित। इस पद्धति का लाभ यह है कि वैकल्पिक सामग्री मोल्ड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, संकल्प और reproducibility लेजर काटने की तुलना में 3 डी मुद्रण के साथ कम किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) Microchannel चैंबर के प्रतिनिधित्व। इस छवि को microchannel चैम्बर बनाने की जरूरत एक्रिलिक डालने के सीएडी ड्राइंग दर्शाया गया है। 1 ए) सीएडी ड्राइंग, 1 बी) सीएडी के साइड देखें इंच में आयामों के साथ ड्राइंग, 1 सी) इंच में आयामों के साथ ड्राइंग सीएडी के शीर्ष दृश्य के शीर्ष दृश्य यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    polydimethylsiloxane घनघोर (PDMS)
    1. एक नाव का वजन में, वाणिज्यिक Elastomer इलाज एजेंट (जैसे Sylgard 194) के वजन से 1 भाग के साथ वाणिज्यिक Elastomer बेस के वजन (जैसे Sylgard 184) द्वारा 10 भागों मिश्रण। आमतौर पर, Elastomer इलाज के एजेंट के 1 ग्राम के लिए Elastomer बेस के 10 ग्राम मिश्रण।
    2. 5 मिनट के लिए एक micropipette के साथ बेस और इलाज एजेंट गठबंधन करने के लिए हलचल।
    3. एक वैक्यूम घंटी सेट अप और फंस हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 30 मिनट के लिए शून्य में PDMS साथ तौलना नाव जगह है।
    4. वैक्यूम बंद करें और नाव तौलना को हटा दें। एक छोटा सा पेट्री डिश में एक्रिलिक कट आउट के शीर्ष पर PDMS डालो। सुनिश्चित करें कि PDMS पूरी तरह से शामिल किया गया सम्मिलित करें।
    5. PDMS रातोंरात (कम से कम 18 घंटे) कमरे के तापमान पर इलाज करने की अनुमति दें।
  1. PDMS से डालने हटाना
    1. PDMS इलाज करने के बाद, ध्यान से एक छुरी के साथ एक्रिलिक टुकड़ा आसपास PDMS काटने से डालने को हटा दें।

    2. एक microchannel चैंबर में कोशिकाओं चढ़ाना

    1. चढ़ाना कोशिकाओं के लिए चैम्बर स्टरलाइज़।
      नोट: PDMS एथिलीन ऑक्साइड या अन्य तकनीकों का उपयोग करते हुए निष्फल किया जा सकता है, एक त्वरित उपचार यूवी, तेजी से सस्ती है, और सेल संस्कृति के अध्ययन के लिए पर्याप्त है। लघु यूवी इलाज की अवधि PDMS टुकड़ा की संरचना या यांत्रिक अखंडता ख़राब नहीं था।
      1. एक मानक सेल संस्कृति कैबिनेट में, पूरी तरह से 70% इथेनॉल के साथ चैम्बर कवर।
      2. पलकों के साथ बंद लामिना का प्रवाह हुड में पेट्री डिश में डाल दिया।
      3. हुड रहो और पराबैंगनी प्रकाश पर बारी। 1-2 घंटे के लिए यूवी प्रकाश को बेनकाब।
      4. लामिना का प्रवाह हुड खोलने और 15 मिनट के इंतजार के प्रवाह पैर जमाने के लिए।
      5. 70% इथेनॉल निकालें।
      6. कक्षों बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार धोएं। प्रत्येक धोने के लिए पीबीएस के 1 एमएल का प्रयोग करें। पीबीएस निकालें और कक्षों पलकों के साथ बंद रातोंरात सूखे की अनुमति देते हैं।
        नोट: वैकल्पिक, बजायएक लामिना का प्रवाह हुड का उपयोग कर के, नसबंदी के लिए एक यूवी चैम्बर बॉक्स का उपयोग करता है, तो एक ही उपलब्ध है। एक गत्ता बॉक्स एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लाइन में खड़ा के पीछे एक यूवी प्रकाश स्रोत रखकर एक यूवी बॉक्स बनाओ। एल्यूमीनियम पन्नी नमूने की भी रोशनी के लिए अनुमति देने के लिए प्रकाश को दर्शाता है।
    2. चैंबर में कोशिकाओं चढ़ाना
      1. Trypan नीले और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
        1. 0.4% Trypan नीले रंग के 400 μL सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें और धीरे मिश्रण। धीरे गिलास coverslip के तहत दोनों कक्षों भरने के द्वारा hemocytometer को यह समाधान के 100 μL लागू करें।
        2. एक 10x उद्देश्य के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग hemocytometer पर ग्रिड पर ध्यान केंद्रित करने के लिए। hemocytometer पर 16 चौकों में से एक सेट के भीतर रहते बेदाग कोशिकाओं की गिनती के लिए एक हाथ मिलान काउंटर का प्रयोग करें।
        3. 16 चौकों की सभी 4 सेट में कोशिकाओं की गणना। 16 चौकों के 4 सेट से औसत कोशिका गिनती लो और 5x10 4 से गुणा करें। यह अंतिम संख्या कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा हैकोशिकाओं सेल निलंबन में / एमएल के आर।
      2. प्रत्येक कक्ष में एक अच्छी तरह से करने के लिए 2,500 कोशिकाओं जोड़ें। यह ~ 30,000 / 2 सेमी की एक के पास मिला हुआ सेल घनत्व के लिए अनुवाद।
      3. कोशिकाओं मीडिया जोड़ने से पहले 60 मिनट के लिए कक्ष में बैठने की अनुमति दें (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन)।

    3. Dextran लथपथ agarose ब्लॉक

    1. एक agarose ब्लॉक बनाने
      1. 3 डी मुद्रित मोल्ड (2 मिमी x 2 मिमी x 2 मिमी) में 3% agarose डालो।
      2. agarose एक निर्वात चैम्बर में जमना 30 मिनट के लिए किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए अनुमति दें।
      3. मोल्ड से agarose ब्लॉक निकालें।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, 3% agarose छोटे पेट्री डिश में 2 मिमी की मोटाई में डालना। एक 2 मिमी x 2 मिमी x 2 मिमी एक छुरी या अन्य काटने के उपकरण का उपयोग कर ब्लॉक में कटौती। यह मोल्ड प्रणाली के रूप में के रूप में सटीक नहीं है, लेकिन यह करने के लिए एक आसान सा हो सकता है।
    2. पूरी तरह से submergई कीमोटैक्टिक कारक के वांछित एकाग्रता की एक समाधान में agarose ब्लॉक। एकाग्रता ढाल गठन का आकलन करने के लिए, फ्लोरोसेंट dextran के साथ पहली बार चैम्बर फ्लश। एकाग्रता और dextran की आणविक वजन एक घुलनशील कारक या ब्याज की दवा की कि मैच चाहिए।
    3. agarose ब्लॉक रात भर लेना।

    Dextran प्रसार की 4. समय चूक घुलनशील फैक्टर एकाग्रता ढाल का आकलन करने के लिए

    1. microchannel चैंबर के एक छोटे से वर्ग में अच्छी तरह से dextran लथपथ agarose ब्लॉक रखें।
    2. एक सेल इमेजिंग प्रणाली में microchannel कक्ष रखें या एक समय चूक की क्षमता के साथ एक और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार समय चूक शुरू करो।
      नोट: दिखाए गए परिणाम GFP फिल्टर, 50% प्रकाश, 4/10 पीएच, और 4X बढ़ाई साथ लिया जाता है।

    सेल के विकास के 5. समय चूक

    1. के एक छोर पर microchannel कक्ष में प्लेट कोशिकाओंचैंबर। इधर, 3T3 fibroblasts का उपयोग करें। microchannel कक्ष में एक अच्छी तरह से करने के लिए 2,500 कोशिकाओं जोड़ें। 2.2.1 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं की गणना।
      1. कोशिकाओं मीडिया जोड़ने से पहले 60 मिनट के लिए कक्ष में बैठने की अनुमति दें (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन)। 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर चढ़ाया कोशिकाओं के साथ microchannel चैम्बर रखें। चैनल के माध्यम से सेल प्रवास एक खुर्दबीन के साथ देखा जा सकता है।
      2. एक मार्कर जोड़ें या क्रम में एक मार्कर के रूप में चैम्बर में एक सूक्ष्म दोष का प्रयोग कर एक मूल्य उस जगह के रूप में सेवा करने के लिए दूरी सेल सामने चाल यों की।
    2. एक agarose जेल (8 मिमी 3 ब्लॉक) युक्त रखकर एक ढाल स्थापित केंद्रित वृद्धि कारक, केमो-attractant, दवा या अन्य कारक परीक्षण किया जा रहा microchannel के एक छोर पर (यहाँ, 40% FBS के एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है) चैंबर।
    3. चलती सेल सामने के समय चूक छवियों ले लो। इधर, परिणाम इधर-उधर सेल की छवियों को दिखानेNT है कि हर 12 घंटे एक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर लिया गया था।
    4. सेल के विकास दर यों तो सेल सामने के चित्रों का प्रयोग करें। पहली बार एक बहुभुज मुखौटा सेल सामने, चैनल दीवारों, और संदर्भ मार्कर द्वारा परिभाषित बनाने के लिए MATLAB polyfit समारोह (roipoly) का उपयोग करके विकास दर की गणना। यह मुखौटा के आयामों के सामने से जो औसत सेल सामने वेग गणना की जाती है के पलायन दूरी निकलेगा। अन्य अध्ययनों से एक समान विधि 8 का उपयोग किया है।
      नोट: यह एक ही दूरी पर घुलनशील कारक की एकाग्रता के लिए हर फ्रेम पर सेल के विकास के मोर्चे के किनारे की तुलना करें। घुलनशील कारक एकाग्रता ढाल एक -1 डी प्रसार मॉडल सन्निकटन उपयोग कर की गणना की जाती है।
    5. Phalloidin और DAPI धुंधला का उपयोग कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट छवियों ले लो।
      1. Phalloidin साथ धुंधला पहले कोशिकाओं को ठीक करें।
        1. 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म 4% paraformaldehyde।
        2. कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त 4% paraformaldehyde जोड़ें। में कोशिकाओं रखें10 मिनट के लिए paraformaldehyde।
        3. 15 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला। कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस का प्रयोग करें।
      2. कोशिकाओं से पीबीएस निकालें और पर्याप्त permeabilizing समाधान (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100) कोशिकाओं को कवर करने के लिए जोड़ें। 10 मिनट के लिए समाधान छोड़ दें।
      3. 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस के साथ दो बार धोएं। कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस का प्रयोग करें।
      4. कोशिकाओं से पीबीएस निकालें और 20 मिनट के लिए समाधान (1% पीबीएस में गोजातीय सीरम albumin) अवरुद्ध जोड़ें।
      5. अवरुद्ध समाधान निकालें और 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए पीबीएस के साथ 2 बार धो लें। कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस का प्रयोग करें।
      6. इस बिंदु से, जब इस्तेमाल नहीं किया जा रहा एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा। कोशिकाओं से पीबीएस निकालें और Phalloidin 488 पतला 1 घंटे के लिए पीबीएस 1:50 जोड़ें।
      7. प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएस में 2 बार धोएं। कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस का प्रयोग करें। तब कोशिकाओं से पीबीएस को हटा दें।
      8. 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को पीबीएस में 1,000: DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) जोड़ें 1 पतला।
      9. हटाये DAPI औरप्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
      10. पिछले धोने निकालें और कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस जोड़ें। कोशिकाओं को अब एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ imaged किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 2 भ्रूण गोजातीय सीरम की एक ढाल जहां कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है से चैनल के विपरीत छोर पर रखा के जवाब में चैनल पार सेल सामने के आंदोलन से पता चलता है। सेल सामने 48 घंटे (2A चित्रा), 72 एच (चित्रा 2 बी), 96 एच (चित्रा -2), और 120 एच (चित्रा 2 डी) के बाद चढ़ाना पर दिखाया गया है। सेल सामने की आवाजाही इन समय चूक छवियों के साथ लगाया गया था, और प्रवास दूरी और विकास दर MATLAB polyfit समारोह से गणना की गई। इस से, औसत सेल सामने वेग 13.4 माइक्रोन / घंटा (चित्रा 3) होना पाया गया। चित्रा 4 फ्लोरोसेंट ढाल चैनल के एक छोर पर एक dextran लथपथ agarose ब्लॉक रखने और dextran 12 घंटे के लिए चैनल के माध्यम से फैलाना करने की अनुमति देकर स्थापित चलता। एक समय चूक छवि हर घंटे में लिया गया था, और की दूरी पार प्रतिदीप्ति चैनल मापा और साजिश रची गई थी के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है और एक -1 डी प्रसार मॉडल की तुलना में।

चित्र 2
चित्रा 2: सेल मोर्चा आंदोलन। microchannel चैम्बर चैनल के माध्यम से जाने में सेल सामने के समय चूक छवियों। सेल सामने नारंगी लाइनों में चिह्नित है, और प्रवास दूरी शामिल है। इस माइग्रेशन दूरी सेल सामने के सामने से थाली पर अंकन के रूप में दिखाया से मापा गया था। एक 1 मिमी पैमाने पर पट्टी सफेद में दिखाया गया है। ए) 48 घंटे के बाद चढ़ाना, बी) के 72 घंटे के बाद चढ़ाना, सी) 96 घंटे के बाद चढ़ाना, डी) 120 घंटे के बाद चढ़ाना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ई 3 "src =" / files / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg "/>
चित्रा 3: विकास दर गणना। सामने आंदोलन समय व्यतीत हो जाने के चित्रों के साथ नज़र रखी सेल। विकास दर 13.4 माइक्रोन / घंटा की औसत सेल सामने वेग उपज के लिए MATLAB polyfit समारोह (roipoly) का उपयोग कर की गणना की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: dextran के साथ फ्लोरोसेंट ढाल। फ्लोरोसेंट तीव्रता चैनल जहां प्रत्येक पंक्ति एक विशेष घंटे में ढाल प्रतिनिधित्व की दूरी भर में मापा जाता है। ImageJ प्रतिदीप्ति तीव्रता गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विश्लेषण का उपयोग किया जा सकता है | माप उपकरण। सबसे पहले, विश्लेषण और चयन तीव्रता के अंतर्गत निर्धारित माप चुनें। फिर, के तहत मापने के आदेश एवेन्यू पाने के लिए विश्लेषण का चयनक्रोध पिक्सेल तीव्रता। इस माइक्रोन में दूरी बनाम साजिश रची जा सकता है, क्योंकि इस आंकड़े में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हमारे microchannel चैम्बर वृद्धि कारक है और chemoattractants के जवाब में सेल प्रवास दर का निर्धारण करने और एक बहुलक मैट्रिक्स से एक दवा के प्रसार की दर को मापने सहित प्रयोजनों के एक भीड़ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह कोशिकाओं के विकास और चैम्बर के एक छोर पर एक chemoattractant जगह के लिए हमारे microchannel कक्ष का उपयोग करने के लिए संभव है। कोशिकाओं chemoattractant के जवाब में बड़े होते हैं, और सेल प्रवास समय चूक छवियों है कि आदेश में सेल प्रवास दर निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता लेने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस विधि के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3, जहां विकास दर 13.4 माइक्रोन / एच MATLAB polyfit समारोह का उपयोग किया जाना निर्धारित किया गया था में दिखाया जाता है।

हमारे microchannel चैम्बर के एक और उपयोग एक बहुलक मैट्रिक्स के बाहर एक दवा के प्रसार की दर को मापने के लिए है। ब्याज की दवा के लिए एक समान आणविक वजन का एक fluorescently टैग dextran DRU के प्रसार मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैब्याज की जी। यह ध्यान रखें कि नमूने संवहन की एक बड़ी राशि ढाल के रूप में बाधित करेगा सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए महत्वपूर्ण है। इस विधि के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4 में दिखाया जाता है। Boyden चैम्बर परख की तुलना में इस मॉडल का एक लाभ यह है कि यह सपाट सतह की वजह से पक्षपाती प्रकार की कोशिकाओं के लिए और अधिक लागू होता है; जबकि, कोशिकाओं पालन करने से पहले Boyden कक्ष में एक छोटी ट्यूब के माध्यम से गिर चाहिए। Boyden चैम्बर परख की एक और सीमा यह है कि यह एक समापन बिंदु परख है; इस प्रकार, chemotaxis नेत्रहीन देखा नहीं जा सकता। इसके विपरीत, हमारे विधि के साथ, chemotaxis समय चूक छवियों के माध्यम से 9 मनाया जाता है। chemoattractants युक्त micropipettes का उपयोग भी सेल प्रवास के अवलोकन की एक विधि का इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इस पद्धति के मुख्य दोष कम throughput 10 है। डन chemotaxis चैम्बर एक और परख है कि वें तरह समय चूक इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाता हैई विधि यहाँ विस्तृत 11, 12। चैम्बर दो गाढ़ा आदेश एक आंतरिक और बाहरी अच्छी तरह से बनाने के लिए गिलास स्लाइड के चेहरे पर खुदी हलकों के होते हैं, और एक पुल दो कुओं अलग करती है। chemoattractant बाहरी कुएं में रखा गया है, और कोशिकाओं भीतरी अच्छी तरह से बाहरी अच्छी तरह से करने के लिए विस्थापित करने की अनुमति दी जाती है। इस माइग्रेशन समय चूक छवियों है कि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं का उपयोग कर मात्रा निर्धारित है। Boyden परख करने के लिए भी इसी तरह, डन चैम्बर परख की सीमाओं में से एक यह है कि यह आसानी से कस्टम घुलनशील कारक एकाग्रता ढ़ाल बनाने के लिए संशोधित नहीं किया जा सकता है।

सेल प्रवास का आकलन करने के लिए एक और सरल तकनीक इन विट्रो खरोंच 13 है। के रूप में यह केवल सेल monolayer और पहले बनाया खरोंच के करीब सेल प्रवास के समय चूक छवियों के कब्जा करने में एक खरोंच बनाने की आवश्यकता है इस विधि को तेजी से और सस्ती है। Howevएर, इस विधि का बड़ा नुकसान यह है कि यह एक रासायनिक कारक एकाग्रता ढाल करने के लिए प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए उपयुक्त नहीं है। हमारे विधि संभावित एक रासायनिक ढाल बनाने के लिए और यों तो रासायनिक ढाल करने के लिए सेल प्रवास के सापेक्ष प्रदान करता है। हमारे विधि, एक खरोंच सेल monolayer में बनाया जा सकता है के रूप में खरोंच विधि के साथ जोड़ा जा सकता है, जबकि एक कीमोटैक्टिक कारक microchannel कक्ष में कुओं में से एक में मौजूद है। इस मात्रा का ठहराव और घाव भरने की मॉडलिंग के लिए अनुमति देता है। हमारे डिवाइस का एक अन्य संभावित आवेदन एजेंट है कि सेल के विकास को बाधित करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का निर्धारण करने के लिए है।

अन्य microfluidics आधारित सिस्टम भी सेल प्रवास के अध्ययन के 14, 15 के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन अध्ययनों से सिलिकॉन वेफर्स में microfluidic चैनलों बनाने के लिए सिलिकॉन और / या लेजर मशीनिंग में मास्टर बनाने के लिए नए नए साँचे साफ कमरे के साथ lithographic तकनीक का उपयोग। सिलिकॉन Wafeआर माइक्रो मशीनिंग हमारे विधि की तुलना कि सस्ता माल (PDMS और एक्रिलिक) का इस्तेमाल करता है एक microchannel चैम्बर का निर्माण करने में महंगा हो सकता है। हमारे उपकरण है जिसमें यह छोटा 3 डी चैनल 15 बनाने के लिए संभव नहीं था microfluidic उपकरणों आधारित अन्य PDMS की सीमा पर काबू। हमारे विधि के साथ, हम सफलतापूर्वक छोटे व्यास चैनल के साथ PDMS आधारित डिवाइस बनाया है। अन्य अध्ययनों microchannels की दो परतों और एक मल्टी चैनल गैस मिक्सर कि कंप्यूटर आदेश ऑक्सीजन 16 के विभिन्न ढ़ाल के तहत कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन की मनमानी ढ़ाल बनाने के लिए नियंत्रित किया जाता है के साथ एक PDMS आधारित microfluidic युक्ति का इस्तेमाल किया है। वहाँ संभावित है हमारे डिवाइस microchannel चैम्बर के एक छोर पर एक गैस मिश्रण कक्ष के अलावा के साथ एक समान फैशन में इस्तेमाल किया जा करने के लिए।

Microfluidic उपकरणों अक्सर नरम lithographic तकनीक का उपयोग किया जाता है; इन सेल प्रवास chambe बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकतारुपये। इन तरीकों में कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) के साथ चैनल पैटर्न के साथ एक मुखौटा मुद्रण शामिल है। ये मुखौटे फिर एक मास्टर मोल्ड एक सहज के साथ लेपित ऑप्टिकल लिथोग्राफी के माध्यम से विरोध पर पेश कर रहे हैं। बाद मास्टर मोल्ड बना है, PDMS मास्टर पर डाल दिया है और आदेश में एक PDMS मोल्ड कि microfluidic अध्ययनों से 17, 18, 19 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता बनाने के लिए कड़ा करने के लिए अनुमति दी है। Chemoattractant या chemorepulsive यौगिकों ढ़ाल बनाने के लिए 17 जलाशयों में से एक में उच्च एकाग्रता में चैम्बर में रखा जाता है। इन तकनीकों के हमारे सेट अप करने के लिए इसी तरह की हैं, वे सिस्टम के लिए मास्टर मोल्ड और साफ-सुथरे कमरे के उपयोग को बनाने की उच्च लागत के कारण महंगा हो सकता है। इसके अलावा, इन तरीकों में छात्रों के एक वर्ग आधारित स्थापना में जानने के लिए मुश्किल हो सकता है। हमारे सेट-अप चैनल बनाने के लिए इस्तेमाल किया सम्मिलित करता है 3 डी जनसंपर्क सहित तरीकों की एक किस्म के साथ बनाया जा सकता हैinting और लेजर काटने की। इस प्रकार, हमारी प्रणाली अपेक्षाकृत कम लागत 3 डी प्रिंटिंग और अधिक किफायती और व्यापक रूप से उपलब्ध हो जाता है, खासकर के रूप के लिए नए नए साँचे की एक विस्तृत विविधता के निर्माण के लिए अनुमति देता है।

सेल प्रवास और विकास को मापने के लिए microfluidic उपकरणों आधारित PDMS आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, तंत्रिका विज्ञान में अनुसंधान 20 अध्ययनों, उपकरणों नरम लिथोग्राफी तकनीक है जिसमें PDMS घटक क्रम में दो डिब्बों कि माइक्रोन आकार खांचे के साथ एक शारीरिक बाधा से अलग हो गए थे की अनुमति देने के लिए फार्म में एक टिशू कल्चर पकवान या कांच पर रखा गया था का उपयोग कर गढ़े गए थे न्यूरॉन्स डिब्बों भर में विकसित करने के लिए। समय चूक छवियों बाधा पार न्यूरॉन्स को दिखाने के लिए ले जाया गया। इस उपकरण का उत्पादन किया जाता micropatterning की विधि, जटिल है, जबकि हमारे डिवाइस के लिए उत्पादन पद्धति सरल है और सभी स्तरों पर शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है। एक अन्य अध्ययन में यह भी एक सी के उत्पादन के लिए एक आसान कम लागत वाली विधि का इस्तेमाल कियाMilar PDMS microfluidic युक्ति एक मास्टर मोल्ड आदेश PDMS में एक धारणा microchannels उत्पादन करने के लिए बनाने के लिए स्कॉच टेप से बनाया का उपयोग कर। इस विधि में वर्णित एक पर हमारे दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि हमारे विधि में चैनल, एक कदम में निर्मित कर रहे हैं, जबकि इस प्रोटोकॉल दो PDMS परतों जो कोशिकाओं से 21 मध्यम प्रवाह के साथ समस्याएं पैदा बीच आसंजन की आवश्यकता है।

अंत में, हमारे microchannel चैम्बर विधि अनुकूलन योग्य है और अलग-अलग परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विधि क्रम में उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप करने के लिए एक एकाग्रता ढाल के निर्माण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हमारे डिवाइस अपने अपेक्षाकृत कम लागत और सभी स्तरों पर शोधकर्ताओं के लिए उपयोग में आसानी के कारण मौजूदा उपकरणों पर एक लाभ प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस परियोजना के लिए धन उपलब्ध कराने के लिए Clemson विश्वविद्यालय के क्रिएटिव जांच कार्यक्रम और NSF CBET1254609 स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Sigma-Aldrich 761036 poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent
Acrylic Sheets US Plastic 44200
Disposable Petri Dishes  Falcon  25373-041
Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich FD20s-100MG
Agarose, Type I, Low EEO Sigma-Aldrich A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Fisher Scientific 11965092 Cell media components
Fetal Bovine Serium Fisher Scientific 16000036 Cell media components
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15140148 Cell media components
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP24384
EVOS XL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific AME3300 Instrument used for taking time-lapse images
Versa Laser Universal Laser Systems, Inc.  Model number VLS2.30 Laser cutter used for cutting plastic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  2. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
  3. Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
  4. Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
  5. Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
  6. Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
  7. Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
  8. Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
  9. Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
  10. Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
  11. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
  12. Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
  13. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  14. Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
  15. Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
  16. Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
  17. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
  18. Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
  19. Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).
  20. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
  21. Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 121 सेल प्रवास chemoattractants एकाग्रता ढाल प्रसार Boyden चैम्बर परख microchannel
मापने सेल प्रवास के लिए एक अनुकूलन चैंबर
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chowdhury, A. N., Vo, H. T., Olang,… More

Chowdhury, A. N., Vo, H. T., Olang, S., Mappus, E., Peterson, B., Hlavac, N., Harvey, T., Dean, D. A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration. J. Vis. Exp. (121), e55264, doi:10.3791/55264 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter