Summary
Denne protokollen detaljer en tilpassbar fremgangsmåte for å måle cellemigrering som reaksjon på kjemoattraktanter som også kan brukes til å bestemme diffusjonshastigheten av et medikament ut av en polymermatrise.
Abstract
Cell migrasjon er en viktig del av immunresponser, vekst og sårheling. Cellemigrering er en kompleks prosess som involverer interaksjoner mellom celler, ekstracellulær matriks, og oppløselige og ikke-oppløselige kjemiske faktorer (f.eks chemoattractants). Standardmetoder for måling av migrasjon av celler, slik som den Boyden kammer analysen, arbeid ved å telle cellene på hver side av en skillelinje. Disse teknikkene er enkle å bruke; Men de tilbyr litt geometrisk modifikasjon for ulike bruksområder. I kontrast, kan microfluidic enheter brukes til å observere cellemigrasjon med tilpasskonsentrasjons graderinger av løselige faktorer 1, 2. Imidlertid kan fremgangsmåter for fremstilling MicroFluidics baserte analyser være vanskelig å lære.
Her beskriver vi en enkel metode for å lage cellekulturkamre for å måle cellemigrering som reaksjon på kjemiske konsentrasjonsgradienter. Våre celle miringskammermetode kan opprette forskjellige lineær konsentrasjonsgradient for å studere cellemigrasjon for en rekke bruksområder. Denne fremgangsmåten er forholdsvis enkel å bruke og er vanligvis utført av studentene.
Microchannel kammeret ble laget ved å anbringe en akrylinnsats i form av den endelige microchannel kammeret godt inn i en petriskål. Etter dette ble poly (dimetylsiloksan) (PDMS) helles på toppen av innsatsen. PDMS ble tillatt å stivne og deretter innsatsen ble fjernet. Dette tillot etablering av brønner i en hvilken som helst ønsket form eller størrelse. Cellene kan deretter bli tilsatt til microchannel kammeret, og oppløselige stoffer kan tilsettes til en av brønnene ved å dynke en agarose blokk i det ønskede middel. Agarose blokken blir tilsatt til en av brønnene og time-lapse bilder kan tas av microchannel kammeret for å kvantifisere cellemigrering. Variasjoner i denne metoden kan gjøres for en gitt applikasjon, noe som gjør denne metoden highly tilpasses.
Protocol
1. Å produsere en Mikro Chamber å lage en konsentrasjonsgradient
- Cutting en akryl støpestykke
- Skaff et stykke akryl av ønsket bredde. Vanligvis bruker 1/16-tommers tykk akrylplater. Tykkere plater er vanskelige å skjære brønn og meget tynne ark ikke har den nødvendige mekaniske styrke, noe som får dem til å bryte eller renning under prosessen.
- Skape en CAD-fil med den ønskede form av akryl stykket for å frembringe et hulrom innenfor den polydimetylsiloksan (PDMS). Juster kanal bredde og lengde for å oppnå den ønskede gradient som er relevant for de enkelte eksperimentelle protokoller.
- Her bruker en akryl stykke følgende dimensjoner: to ruter (0,254 cm x 0,254 cm) forbundet med en 0,127 cm bred kanal (0,254 cm lang) (figur 1).
- Importere CAD-filen inn i laserskjæring apparater og plassere akryl brikke i en laser cutter i henhold til manufacturer protokoll.
MERK: Du kan også 3D-utskrift stykke fra CAD design. Fordelen med denne metoden er at alternative materialer kan anvendes for støpeformen; kan imidlertid oppløsningen og reproduserbarhet reduseres med 3D-utskrift i forhold til laserskjæring.
Figur 1: Computer-Aided Design (CAD) Representasjon av Mikro Chamber. Dette bildet viser CAD tegning av akryl innsatsen er nødvendig for å skape den microchannel kammeret. 1 A) ovenfra DAK-tegning, 1B) fra siden av CAD tegning med dimensjoner i inches, 1C) ovenfra CAD tegning med dimensjoner i inches Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- I en veie båt, blandes 10 vektdeler av kommersielt Elastomer base (f.eks Sylgard 184) med en vektdel kommersiell Elastomer Curing Agent (f.eks Sylgard 194). Typisk blandes 10 g av elastomer base til 1 g av Elastomer herdemiddel.
- Rør å kombinere base og herder med en mikropipette i 5 minutter.
- Sett opp et vakuum bjelle og plasser veie båt med PDMS i vakuum i 30 minutter for å fjerne luftbobler.
- Slå av vakuum og fjern veie båten. Hell PDMS på toppen av akryl cut-out i en liten petriskål. Kontroller at PDMS dekker helt innsatsen.
- La PDMS for å herde natten over (minst 18 timer) ved romtemperatur.
- Fjerne innsatsen fra PDMS
- Etter herding av PDMS, fjerne innsatsen av nøye kutte PDMS rundt akryl stykke med en skalpell.
2. Plating cellene i en Mikro Chamber
- Sterilisering kammeret for plating celler.
MERK: Mens PDMS kan steriliseres med etylenoksid eller andre teknikker, er en rask UV-behandling raskt, billig og tilstrekkelig for cellekulturstudier. Den korte UV-behandlingsvarighet svekket ikke strukturen eller mekaniske integritet av PDMS stykke.- I et standard cellekulturskapet, fullstendig dekke kammer med 70% etanol.
- Sett petriskål i laminær hette med lokkene av.
- Slå panseret og slå på UV-lys. Utsettes for UV-lys i 1-2 timer.
- Åpne laminær hette og vente i 15 minutter for å gjenopprette flyt.
- Fjern det 70% etanol.
- Vask kamrene to ganger med steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Bruker 1 ml PBS for hver vask. Fjern PBS og tillate kamre for å tørke over natten med lokkene off.
MERK: Du kan i stedetfor å bruke en laminær hette, bruke en UV kammer boks for sterilisering hvis det er tilgjengelig. Foreta en UV-boks ved å plassere en UV-lyskilde på baksiden av en pappeske foret med aluminiumfolie. Aluminiumsfolien reflekterer lyset for å tillate jevn belysning av prøven.
- Plating celler i Chamber
- Telle celler ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer.
- Tilsett 100 ul av cellesuspensjonen til 400 mL av 0,4% trypanblått og bland forsiktig. Anvende 100 pl av denne oppløsning til den hemocytometer ved forsiktig å fylle begge kamre under dekkglass.
- Bruk et mikroskop med en 10X objektiv til å fokusere på rutenettet på hemocytometer. Bruk en hånd tally teller for å telle levende ufargede celler i ett sett med 16 rutene på hemocytometer.
- Telle celler i alle 4 sett med 16 ruter. Ta gjennomsnittlig celletall fra 4 sett med 16 ruter og multipliser med 5x10 4. Dette siste tallet er number av celler / ml i cellesuspensjonen.
- Legg 2500 celler i en brønn i hvert kammer. Dette betyr en nesten sammenflytende celletetthet på ~ 30.000 / cm2.
- Tillate celler å sitte i kammeret i 60 min før tilsetning av medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium, 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin).
- Telle celler ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer.
3. Dextran Soaked Agarose Blocks
- Opprette en agarose blokk
- Hell 3% agarose på 3D trykte formen (2 mm x 2 mm x 2 mm).
- Tillat agarose for å størkne i et vakuumkammer i 30 min for å fjerne eventuelle bobler.
- Fjern det agarose blokken fra formen.
MERK: Du kan også helle 3% agarose i små petriskål med en tykkelse på 2 mm. Skjær en 2 mm x 2 mm x 2 mm blokk ved hjelp av en skalpell eller annet skjærende verktøy. Dette er ikke så presis som formen systemet, men det kan være litt enklere å gjøre.
- helt submerge agarose blokk i en oppløsning av den ønskede konsentrasjon av den kjemotaktisk faktor. For å vurdere konsentrasjonsgradient formasjon, skylle kammeret først med fluorescerende dekstran. Konsentrasjonen og molekylvekt dekstran bør matche det av en løselig faktor eller stoff av interesse.
- Bløt agarose blokken over natten.
4. Time-lapse av Dextran Diffusion å Vurdere Løselig Factor konsentrasjonsgradient
- Plasser dekstran dynket agarose blokk i en liten firkant godt av microchannel kammeret.
- Plasser microchannel kammer i en celle imaging system eller bruk en annen fluorescerende mikroskop med en time-lapse evne. Begynn time-lapse i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Resultatene som vises er tatt med GFP filter, 50% lys, 4/10 pH, og 4X forstørrelse.
5. Time-lapse av cellevekst
- Plate celler i microchannel kammeret ved den ene enden avkammeret. Her bruker 3T3 fibroblaster. Legg 2500 celler i en brønn i microchannel kammeret. Telle celler som beskrevet i 2.2.1.
- Tillate celler å sitte i kammeret i 60 min før tilsetning av medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium, 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin). Hold microchannel kammer med belagt celler ved 37 ° C i 5% CO 2. Cellemigrering gjennom kanalen kan sees med et mikroskop.
- Legg en markør eller bruke en mikroskopisk feil i kammeret som en markør for å tjene som et utgangspunkt for å kvantifisere avstand mobilfronten beveger seg.
- Etablere en gradient ved å plassere en agarosegel (8 mm tre-blokk) inneholdende den konsentrerte vekstfaktor, kjemoterapi-tiltrekkende, medikament eller en annen faktor som testes (her, 40% FBS blir brukt som et eksempel) ved den ene enden av microchannel kammeret.
- Ta deg tid-lapse bilder av bevegelige celle foran. Her viser resultatene bilder av cellen front som ble tatt hver 12. time ved hjelp av et bildebehandlingssystem.
- Bruk bilder av cellen foran å kvantifisere celle vekst. Beregn vekst ved først å bruke MATLAB polyfit funksjon (roipoly) for å lage en mangekantet maske definert av cellen front, kanalveggene, og referanse markør. Dimensjonene av denne masken, hvilket ga migrering avstand fra den fremre hvorfra gjennomsnittlig celleinngangshastigheten blir beregnet. Andre undersøkelser har anvendt en lignende metode 8.
MERK: Sammenlign kanten av cellevekst foran på hver ramme til konsentrasjonen av den oppløselige faktor ved den samme avstand. Den løselige faktor konsentrasjonsgradient beregnes ved hjelp av en 1D diffusjon modell tilnærming. - Ta fluorescerende bilder av celler ved hjelp Phalloidin og DAPI farging.
- Fix celler før farging med Phalloidin.
- Varm 4% paraformaldehyde ved 37 ° C.
- Legg nok 4% paraformaldehyde å dekke cellene. Hold celler iparaformaldehyd i 10 min.
- Skyll to ganger med PBS i 15 min hver gang. Bruk nok PBS for å dekke cellene.
- Fjern PBS fra celler og legger nok permeabilizing-oppløsning (0,1% Triton X-100 i PBS) for å dekke cellene. La løsningen i 10 min.
- Vask to ganger med PBS i 5 min hver gang. Bruk nok PBS for å dekke cellene.
- Fjern PBS fra celler og tilsett blokkeringsløsning (1% bovint serumalbumin i PBS) i 20 min.
- Fjern blokkeringsløsning og vask 2 ganger med PBS i 5 min hver gang. Bruk nok PBS for å dekke cellene.
- Fra dette punkt, beskytte cellene mot lys med aluminiumfolie når den ikke brukes. Fjern PBS fra celler og legge Phalloidin 488 fortynnet 1:50 i PBS i 1 time.
- Vask 2 ganger i PBS i 5 minutter for hver vask. Bruk nok PBS for å dekke cellene. Deretter fjerner PBS fra celler.
- Legg DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) fortynnet 1: 1000 i PBS til cellene i 15 min.
- Fjern DAPI ogVask cellene to ganger med PBS i 5 minutter for hver vask.
- Fjern siste vask og legger nok PBS å dekke cellene. Celler kan nå avbildes med et fluorescens mikroskop.
- Fix celler før farging med Phalloidin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser bevegelsen av cellen fremre tvers over kanalen i respons til en gradient av føtalt bovint serum plassert ved den motsatte ende av kanalen fra hvor cellene blir sådd ut. Cellen foran er vist på 48 timer (Figur 2A), 72 timer (figur 2B), 96 h (Figur 2C), og 120 h (figur 2D) innlegg plating. Bevegelsen av cellen fremre ble sporet med disse tidsintervall bilder og migrering avstand og veksthastigheten ble beregnet ved MATLAB polyfit funksjon. Fra denne ble den midlere celle fremre hastighet funnet å være 13,4 um / h (figur 3). Figur 4 viser den fluorescerende gradient etablert ved å plassere et dekstran gjennomvåt agarose blokken i den ene ende av kanalen og tillate dekstran til å diffundere gjennom kanalen i 12 timer. En time-lapse Bildet ble tatt hver time, og fluorescensen på tvers av avstanden kanalen ble målt og plottet som vist i figur 4, og sammenlignet med en 1D diffusjonsmodell.
Figur 2: Cell Front Movement. Time-lapse bilder av cellen fronten i microchannel kammeret beveger seg gjennom kanalen. Cellen foran markert i oransje linjer, og migrasjon avstanden er inkludert. Denne migrering ble målt avstand fra merke på plate på forsiden av cellen fronten som vist. En 1 mm skala bar er vist i hvitt. A) 48 timer etter plating, B) 72 timer etter plating, C) 96 timer etter plating, D) 120 timer etter plating. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
e 3 "src =" / files / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg "/>
Figur 3: Vekst Rate Beregning. Cell foran bevegelse spores med intervallbilder. Vekstraten ble beregnet ved hjelp av MATLAB polyfit funksjon (roipoly) for å gi gjennomsnittlig celle foran hastighet på 13,4 mikrometer / t. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Fluorescent Gradient med dekstran. Fluorescerende intensitet målt over avstanden av kanalen, hvor hver linje representerer gradienten ved en bestemt time. ImageJ ble brukt til å beregne fluorescensintensiteten. Dette kan gjøres ved hjelp Analyser | Måleverktøyet. Først velger Set måle under Analysere og velge intensitet. Deretter velger måling under Analyser for å få averaseri piksel intensitet. Dette kan plottes i forhold til avstanden i mikrometer som er vist i denne figuren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår mikrokanalkammer kan benyttes for en rekke formål, inkludert bestemmelse av cellemigrering hastigheten som respons på vekstfaktorer og kjemoattraktanter og måling av diffusjonshastigheten av et medikament fra en polymermatrise. Det er mulig å anvende vår microchannel kammeret for å dyrke celler og plassere en kjemoattraktant i den ene ende av kammeret. Cellene vokser i respons til den kjemotiltrekkende, og cellevandring kan kvantifiseres ved å ta time-lapse bilder som kan analyseres for å bestemme den cellemigrering hastighet. Representative resultater av denne fremgangsmåte er vist i figur 3, hvor veksthastigheten ble bestemt til å være 13,4 um / h ved hjelp av MATLAB polyfit funksjon.
En annen bruk av vår microchannel kammeret er for å måle diffusjonshastigheten av et medikament ut av en polymermatrise. En fluorescens-merket dekstran av en tilsvarende molekylvekt til stoffet av interesse kan bli anvendt for å modellere diffusjon av Drug av interesse. Det er viktig å merke seg at prøvene må håndteres forsiktig som en stor mengde av konveksjon vil forstyrre gradient. De representative Resultatene av denne fremgangsmåte er vist i figur 4. En fordel med denne modellen i forhold til Boyden kammer analysen er at det er mer anvendelig for adherente celletyper på grunn av den flate overflate; mens, må cellene faller gjennom et lite rør i Boyden kammeret før man følger. En annen begrensning ved den Boyden kammer analysen er at det er et endepunkt assay; således, kjemotakse kan ikke observeres visuelt. I kontrast med vår metode, er chemotaxis observeres gjennom time-lapse bilder 9. Bruken av mikropipetter som inneholder kjemotiltrekkende midler er også blitt anvendt en metode for å observere celle migrasjon. Men den største ulempen med denne metoden er lav gjennomstrømming 10. Dunn-kjemotakse Kammeret er en annen metode som brukes i forbindelse med time-lapse imaging lignende the metoden beskrevet her 11, 12. Kammeret består av to konsentriske sirkler skåret på overflaten av objektglasset, for å skape en indre og ytre godt, og en bro som skiller de to brønner. Den kjemotiltrekkende er plassert i den ytre brønn, og cellene får lov til å vandre fra det indre brønn til den ytre brønnen. Denne vandringen er kvantifisert ved hjelp av time-lapse bilder som er analysert ved hjelp av bildeanalyse programvare. Ligner på Boyden analysen, er en av begrensningene til Dunn kammer analysen at det ikke kan enkelt endres til å opprette egendefinerte løselige faktor konsentrasjons gradienter.
En annen enkel teknikk for å vurdere cellemigrering er en in vitro-klø 13. Denne metoden er rask og billig som det krever bare lage en ripe i cellen monolayer og fangst av tid-lapse bilder av cellevandring nær den tidligere opprettede scratch. However, den store ulempe med denne metoden er at den er ikke egnet til å måle responser på en kjemisk faktor konsentrasjonsgradient. Vår metode gir mulighet for å skape et kjemisk gradient og å kvantifisere cellemigrering i forhold til den kjemiske gradient. Vår fremgangsmåte kan kombineres med grunnen Fremgangsmåte som en ripe kan bli dannet i cellemonolaget, mens en kjemotaktisk faktor er til stede i en av brønnene i microchannel kammeret. Dette gjør det mulig for kvantifisering og modellering av sårheling. En annen potensiell anvendelse av vårt anordning er for å bestemme responsen av kreftceller til midler som hemmer cellevekst.
Andre MicroFluidics baserte systemer er også blitt anvendt for cellemigrerings studier 14, 15. Disse studiene utnytte litografiske teknikker med rene rom til å skape mester muggsopp i silisium og / eller laser maskinering for å skape microfluidic kanaler i silisiumskiver. Silicon Wafer mikromaskinerings kan være dyrt i forhold til vår metode som benytter billigere materialer (PDMS og akryl) å produsere en microchannel kammer. Vår enhet overvinner begrensning av andre PDMS basert microfluidic enheter der det ikke var mulig å lage små 3D-kanaler 15. Med vår metode, har vi nå opprettet PDMS basert enhet med liten diameter kanaler. Andre studier har brukt en PDMS-baserte mikrofluid enhet med to lag av mikrokanaler og en flerkanals gass mikser som er datastyrt for å danne vilkårlige gradienter av oksygen for å studere migrering av celler under forskjellige gradienter av oksygen 16. Det er potensial for vår enhet for å bli brukt på en lignende måte med tilsetning av en gassblandekammer ved en ende av microchannel kammeret.
Microfluidic enheter er ofte laget ved hjelp av myke litografiske teknikker; disse kan tilpasses for å lage cellemigrering chambers. Disse metodene innebærer å skrive ut en maske med kanal mønstre med dataassistert konstruksjon (DAK). Disse maskene blir deretter projisert på en master-form belagt med en fotofølsom resist gjennom optisk litografi. Etter at hovedstøpeformen er gjort, er PDMS helles på master og tillatt å herde for å skape en PDMS form som kan brukes for microfluidic studier 17, 18, 19. Kjemotiltrekkende eller chemorepulsive forbindelser er plassert i kammeret i høy konsentrasjon i et av reservoarene for å skape gradienter 17. Mens disse teknikkene er lik vår satt opp, kan de være kostbare på grunn av de høye kostnadene ved å lage hovedform for systemet og bruken av rene rom. I tillegg kan disse metodene være vanskelig for elevene å lære i en klasse basert setting. Innsatsene som brukes i vår set-up for å skape kanalene kan lages med en rekke metoder, inkludert 3D printing og laserskjæring. Dermed gjør vårt system for etablering av et bredt spekter av former for relativt lav kostnad spesielt som 3D-utskrift blir mer overkommelig og allment tilgjengelig.
PDMS basert microfluidic enheter for måling av cellemigrasjon og vekst har blitt brukt i en rekke bruksområder. For eksempel, i Neuroscience forskningsstudier 20, enhetene ble fremstilt ved bruk av myke litografiske teknikker hvor PDMS komponenten ble plassert på en vevskulturskål eller glass for å danne to kamre som er adskilt med en fysisk barriere med mikrometer-størrelse spor for å tillate nerveceller til å vokse på tvers av avdelinger. Time-lapse bilder ble tatt for å vise nevroner krysser barrieren. Fremgangsmåten for micropatterning brukes til å produsere denne anordning er komplisert, samtidig som fremstillingsmetoden for vår anordning er enkel og kan benyttes av forskere på alle nivåer. En annen studie også brukes en enkel rimelig metode for fremstilling av en siMilar PDMS microfluidic enhet ved hjelp av en master mold laget av teip for å skape et inntrykk i PDMS å produsere mikro. En fordel ved vår tilnærming enn den som er beskrevet i denne metoden er at kanalene i vår metode er fremstille i ett trinn, mens denne protokollen krever adhesjon mellom to lag PDMS noe som skaper problemer med mediumstrømmen til cellene 21.
I konklusjonen, er vår microkammermetode tilpasses og kan brukes for å oppnå ulike resultater. Metoden åpner for etablering av en konsentrasjonsgradient for å passe til brukerens behov. Videre tilbyr vår enhet en fordel i forhold til eksisterende enheter på grunn av sin relativt lave kostnader og enkel bruk for forskere på alle nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner Clemson University Creative Inquiry program og NSF CBET1254609 for å gi støtte til dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa Laser | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
- Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
- Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
- Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
- Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
- Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
- Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
- Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
- Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
- Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
- Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
- Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
- Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).
