Summary
Fremgangsmåde til tørring-induceret selv-integration af megamolecular biopolymerer på luft-væske krystallinsk interface er tilvejebragt her. Denne metode vil være nyttigt ikke kun for at forstå de makroskopiske potentialer biopolymerer, men også som en evalueringsmetode til bløde materialer i biomedicinske og miljømæssige område.
Abstract
Levende organismer, der bruger vand er altid tilbøjelig til tørring i miljøet. Deres aktiviteter er drevet af biopolymer-baserede mikro- og makro-strukturer, som det ses i tilfælde af at flytte vand i vaskulære bundter og fugtgivende vand i hudlag. I denne undersøgelse har vi udviklet en metode til vurdering af virkningen af vandig væske krystallinske (LC) opløsninger af biopolymerer på tørring. Som LC biopolymerer har megamolecular vægt, valgte vi at studere polysaccharider, cytoskeletale proteiner og DNA. Observationen af biopolymer opløsninger under tørring under polariseret lys afslører milliscale selv-integration ud fra ustabile luft-LC grænseflade. Dynamikken i de vandige LC biopolymer opløsninger kan overvåges ved fordampning af vand fra en én-side-åbne celler. Ved at analysere billederne taget med cross-polariseret lys, er det muligt at genkende de spatio-temporale ændringer i orienteringsmæssige parameterordre. Det hermetode kan være anvendelig til karakterisering af ikke kun kunstige materialer i forskellige områder, men også naturlige levende væv. Vi mener, at det vil give en evalueringsmetode til bløde materialer i de biomedicinske og miljømæssige område.
Introduction
Ved at fokusere på de stive, stavformede strukturer af biopolymerer, har dynamiske bløde materialer været anvendt til forskellige anvendelser, herunder polysaccharid biofilm matricer 1, "aktive geler" sammensat af cytoskeletproteiner 2 og "DNA origami" af ønskede former 3. At klarlægge de strukturelle egenskaber, er mange strategier blevet udforsket, såsom transmissionselektronmikroskopi, scanningselektronmikroskopi, atomic force mikroskopi, og konfokal fluorescensmikroskopi. Men fordi disse metoder er for det meste foregår på en tørret eller statisk tilstand, er det vanskeligt at forklare de dynamiske adfærd i makroskopiske skalaer, som det ses i egentlige levende systemer. For nylig har vi med succes observeret dynamiske opførsel biopolymerer på den vandige luft-LC grænseflade gennem polariseret lys 4. Under visualisering af den orienterede struktur, medens tørring biopolymerenopløsning, de tidsmæssige ændringer indikerede selv-integration af biopolymerer på den ustabile luft-LC grænseflade.
Her beskriver vi en protokol til tørring af LC biopolymer opløsninger ved luft-LC interface ved hjælp polariserede instrumenter. I modsætning til andre analyser af LC fase, der ikke betragter tørring 5, 6 blev LC dynamik under tørringsprocessen undersøgt her ved at evaluere orienteringsmæssige ordensparameter i sidebillede af den flydende fase i en én-side-åbne celler . Kombinationen af cellen fordampning og anvendelse af polariserede instrumenter tilladt for makroskopisk overvågning med en kontrolleret fordampning retning. Desuden var det muligt at validere de tørrende records ved at fokusere på de krystallinske strukturer af de adsorberede mikrodomæner, der blev ramt af molekylvægt, koncentration, etc. For at vise effektiviteten af fremgangsmåden tørringen proprocesser af basiske biopolymerer med stiv stang former, såsom polysaccharider, mikrotubuli (MTS), og DNA, blev undersøgt. Vi valgte disse biopolymerer, fordi de er typiske eksempler på hierarkiske makromolekyler med megamolecular vægte, og deres intermolekylære vekselvirkninger sætte dem i stand til at danne LC stater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. instrumenter
- polariseringsapparat
- For at konstruere et polariseringsapparat, tilvejebringe en lyskilde med en halogenlampe, en lysleder, polarisatorer, et prøvebordet, en optisk skinne, stang stande, og en digital spejlreflekskamera (se figur 1C og Materialer List for polarisering enhedens dele).
2. Fremstilling af Biopolymer Løsning
- polysakkarid løsninger
- Opløs sacran 7 (0,5 g) i rent vand (100 ml) ved omrøring ved -80 ° C i mere end 12 timer. Under opløsningen, dække beholderen med plastfolie for at forhindre fordampning. Fremstille en vandig opløsning af xanthangummi på den samme måde.
- Afkøle opløsningerne ved ~ 25 ° C til opnåelse 0,5 vægt% vandige opløsninger.
- Centrifugeres sacran opløsning for at fjerne urenheder (48.400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 times).
- MT løsning
- Fremstille en 0,5 vægt-% tubulin-opløsning (1 ml) i en Britton-Robinson-buffer (80 mM piperazin-N, N'-bis (2-ethansulfonsyre) (PIPES), 1 mM ethylenglycol-bis (β-aminoethyl ether) - N, N, N 'N' -tetraeddikesyre (EGTA), og 5 mM MgCl2, pH 6,8) på is 8.
- Anvende 0,5 vægt% tubulin-opløsning (50 pi) og guanosin-5' - [(α, β) -methyleno] triphosphat (GpCpp) (5 pi) til fremstilling af en GpCpp-indeholdende tubulin (50 pi). Der inkuberes ved 37 ° C i 3 timer til opnåelse af en stabil MT kerne.
BEMÆRK: Hvilken rolle spiller GpCpp er at støtte MT dannelse og til helt at undertrykke depolymerisering af MT til tubulin. - Bland 0,5 vægt% tubulin-opløsning (950 pi) og GpCpp-indeholdende tubulin (50 pi) ved ~ 25 ° C i 1 dag til opnåelse af en stabil 0,5 vægt% MT opløsning.
- DNA-opløsning
- Fremstille en 0,5 vægt-% DNA-opløsning (1 ml) i Tris-EDTA-buffer-opløsning (10 mM Tris, pH 8,0, med 1 mM EDTA).
- Holde biopolymer prøveopløsninger 0,5 vægt% ved 25 ° C til tørring eksperiment.
3. Tørring Eksperimenter og observation under Cross-polariseret lys
- Opløsninger i en en-side-åbne celler (figur 1A)
- Skær en silicium ark (se Materialer List) i en passende form med en tykkelse på 1 mm (indre dimension på 5-15 mm, 1 mm, og ~ 20 mm, figur 1A).
- Samle en ene-side-åbne celler består af en silicium spacer med indre dimension på 5-15 mm, 1 mm, og ~ 20 mm og to ikke-modificerede objektglas (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fastsætte begge sider af cellen med dobbelt klip på forhånd at holde prøveopløsningen i at sive ud.
- Tilsæt langsomt hver af de 0,5 vægt% biopolymer opløsning (100-300 pi) under anvendelse af en ~ 1 mm porestørrelse pipettete spids til hver celle ved ~ 25 ° C. Fjerne luftbobler fra cellerne under anvendelse af en kanyle.
- Placere cellerne i en ovn med en luft cirkulationspumpe ved 60 ° C under atmosfærisk tryk til fordampning; fordampningen retning er modsat tyngdekraften.
- Skær en silicium ark (se Materialer List) i en passende form med en tykkelse på 1 mm (indre dimension på 5-15 mm, 1 mm, og ~ 20 mm, figur 1A).
- Observationer under krydspolariseret lys (figur 1B-1C)
- Tilvejebringe lige synligt lys via en 100 W halogenlampe med en flad flade lyskilde over et bredt område (80 mm x 80 mm). Juster polarisatorerne til 45 ° og 135 ° ved hjælp af holderne (figur 1C).
- Fastsætte positionerne af lyskilden, polarisatorer, prøveholderen, og kamera under anvendelse af et optisk skinne plejl stande (figur 1C). Anbring prøven fase mellem de to polarisatorer (afstanden mellem polarisatorerne bør være ~ 5 cm). Placer kameraet ~ 20 cm fra prøven scenen for at tillade fokusering.
- På givne tidspunkter, placere prøver fra trin 3.1.3 mellem polarizers på scenen parallelt med XZ-planet og dække anordningen med et sort gardin; den faktiske enhed er vist i figur 1C.
- Fotografere prøverne gennem lineære krydsede polarisatorer ved hjælp af en digital spejlreflekskamera med en standard zoomobjektiv (se Materialer List). Styr kameraets indstillinger, såsom brændvidde, ved hjælp af computer-software (se Materialer List).
- Spatio-temporal analyse af den transmitterede lysintensitet (figur 1C)
- At vurdere ændringen i den orienteringsmæssige ordensparameter i tørringsprocessen, indsamle fotografier hver time i 24 timer.
- Mål den transmitterede lysintensitet langs midterlinien i Z-retningen som en grå værdi ved anvendelse af et billedbehandlingsprogram (f.eks ImageJ).
- Plotte en graf af den grå værdi som en funktion af afstanden fra den øvre åbne side.
- Mikroskopiske observationer under cross-polariseret light (figur 1D)
- For at kontrollere de metoder, lave mikroskopiske observationer med en polarisering mikroskop udstyret med en CCD-kamera 9. Hold en første ordens retardering plade i strålegangen. Styr betingelserne for fotos ved hjælp af en pc-software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af anordningen som vist i figur 1, til den selv-integration fra mikrodomæne macrodomain på en tørreluften-LC-grænsefladen blev evalueret (figur 2A). Som den første demonstration af tørringen eksperiment, to slags megamolecular polysaccharider, sacran (M w = 1,9 x 10 7 g mol-1) og xanthangummi (4,7 x 10 6 g mol-1), blev sammenlignet. Figur 2B viser fotografier af opløsningerne i cellen under krydspolariseret lys. Før tørring, var det muligt at observere flere lyse områder med transmitteret lys i en spredt tilstand i begge løsninger. Efter tørring ved 60 ° C i 6 timer, regionen under luft-LC-grænsefladen i sacran opløsningen blev betydelig høj. Det betyder, at domænerne dannede en makroskopisk orienteret struktur ved grænsefladen, der ligner hudlag dannelse i en gel-krympningsproces"xref"> 10. På den anden side, intensiteten af xanthan opløsning faldt drastisk, når temperaturen var lige forøget fra 25 ° C til 60 ° C, og nogle små macrodomains blev observeret under grænsefladen. Dette skyldes, at mobiliteten af xanthan mikroområde er langt mere følsomme over for temperatur end den sacran mikroområde. De kritiske forskelle orienteringen på grænsefladen blev således detekteret ved hjælp polariseringsapparatet.
Figur 2C og Movie S1 viser resultaterne af spatio-temporal analyse for tørreprocessen i sacran opløsning. Den transmitterede lysintensitet angiver den orienteringsmæssige ordensparameter af mikrodomæne. Topintensiteten omkring luft-væske-grænsefladen steg betydeligt, og tykkelsen voksede til ~ 2 mm. Disse resultater viser tydeligt, at de mikrodomæner begynder at orientere fra luften-LC-interface etd vokse ind i en milliscale domæne parallelt med grænsefladen. Fra denne observation under polariseret lys, er det således muligt at visualisere strømningsforholdene i tørringsprocessen.
Forskellene mellem sacran og xanthangummi i form af macrodomain størrelse og orientering retning blev også bekræftet ved en polarisering mikroskop med en første ordens forsinkelsesplade (figur 2D). Den sacran flydende fase viste en blå område, hvilket betyder, at en enkelt macrodomain dannet ved grænsefladen. I modsætning hertil udviste den xanthangummi fluidfase blå, gul og pink regioner, hvilket betyder, at de multiple macrodomains dannet med vilkårlige orienteringer.
Denne fremgangsmåde blev også undersøgt til sammenligning tre typer af basiske stive biopolymerer med megamolecular vægte - polysaccharider (sacran: Mw = 1,9 x 10 7 g mol -1, mikrodomænelængde> 20 um), MT'er (Mw = 10 9 -10 10 g mol-1, mikrodomæne længde> 10 um), og DNA (Mw = 1,3 x 10 6 g mol-1, mikrodomæne længde <1 um) - i et fysiologisk miljø ved 37 ° C. Før tørring som vist i figur 3B den sacran opløsning, og MT opløsning, viste lignende LC stater, med spredte domæner i hele området. Under tørreprocessen, domænerne i MT opløsning undergik også selv-integration fra luften-LC interface, og de spredte domæner blev integreret i en enkelt macrodomain. På den anden side viste DNA-opløsningen ingen specifik orientering i væskefasen. I tilfælde af MT opløsning og DNA fremstillet med buffere, er det vigtigt at bemærke, at integrationen påvirkes af ændringer i saltkoncentration, pH og ionstyrke under tørringen.
(figur 3C). Den sacran tørring rekord udstillet betydelige dobbeltbrydning intensiteter på grund af den milliscale enkelt macrodomain dannelse. For MT tørring rekord, vi observerede bølgede bundter, hvor den lange akse var parallel med X-aksen. I modsætning hertil tørring registrering af DNA-opløsningen udviste korn-shape macrodomains <5 um i diameter og i vilkårlige retninger. Ud fra disse observationer, er det klart, at macrodomain størrelse påvirkes af længden af stangen-lignende mikrodomæner. Det var således muligt at evaluere den retningsbestemte orientering af biopolymer mikrodomæner ved at observere de tørrende optegnelser anvendelse af et polarisationsmikroskop.
Afslutningsvis blev metoder under anvendelse polariseret lys anvendesfor selvstændige integration af megamolecular biopolymerer på tørreluften-LC-interface. Dynamikken i de vandige LC opløsninger blev overvåget ved fordampning af vand fra en én-side-åbne celler. Ved at analysere billeder taget ved hjælp af cross-polariseret lys, var det muligt at genkende de spatio-temporale ændringer og den orienterende parameter rækkefølge. I betragtning af at den påviste tørringsprocessen ligner naturlige processer, ville denne fremgangsmåde være anvendelig til karakterisering af ikke kun kunstige materialer i forskellige områder, men også af naturlige levende væv. Vi mener, at dette kunne være et evalueringsmetode til bløde materialer i de biomedicinske og miljømæssige område.
Figur 1: Tørring eksperiment. (A) Skematisk illustration af opløsningerne i en en-side-åbne celler. (B)Skematisk illustration af den eksperimentelle anordning, der anvendes til observationer under krydspolariseret lys. Polarisatorerne blev normalt indstillet til 45 ° og 135 °. (C) Den faktiske enhed. Dette tal er blevet modificeret fra henvisningen 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tørring proces af vandige opløsninger af polysaccharider sacran og xanthangummi. (A) Skematisk illustration af selv-integration på tørreluften-LC grænseflade. (B) Side udsigt over to slags polysaccharid løsninger på deres oprindelige stater og efter6 timers tørring ved 60 ° C under krydspolariseret lys. De indledende polymerkoncentrationer var 0,5 vægt%. (C) Transmitterede lysintensitet gennem en krydsede Nicols på en linje i Z-retningen for hvert billede taget på et givet tidspunkt. (D) Polarisering mikroskopiske billeder af polymeropløsningerne i cellen efter 6 timers tørring ved 60 ° C. Røde pile: macrodomains på grænsefladen. Dette tal er blevet modificeret fra henvisningen 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tørring proces med biopolymer vandige opløsninger og de tørrende optegnelser. (A) Kilder til polysaccharides (cyanobakterier), MT'er (porcin hjerne) og DNA (laksetestikel). (B) Sidebilleder af sacran, MT, og DNA-opløsninger under tørring ved 37 ° C under krydspolariseret lys. De indledende polymerkoncentrationer var 0,5 vægt%. (C) Mikroskopiske billeder af de tørrede polymerfilm på glassubstratet gennem de givne retninger af de krydsede Nicols. Alle Skalabjælkeme er 50 um. Dette tal er blevet modificeret fra henvisningen 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klik her for at se en større version af dette tal.
Film S1: Tørring fremgangsmåden sacran opløsning under tørring ved 60 ° C, observeret under anvendelsekrydsede Nicols. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det var til tider vanskeligt for kameraet at fokusere på prøven på grund af det transmitterede lys intensitet være for lav. I sådanne tilfælde, at placere en udvidet gennemsigtig plastfilm på scenen var med til at arrangere i fokus. Begrænsningen af den observerbare beslutning var afhængig af kameralinsen, ~ 10 um i dette tilfælde. Det observerbare begrænsning af prøven tykkelse, Ay, var afhængig af den maksimale lysintensitet af lampen, ~ 10 mm i dette tilfælde.
Fordelen ved indretningen vist i figur 1B er at det giver side-view billeder af prøven, der skal tages under tørringsprocessen. Observationen kan udføres uden at forlade sig på det vandrette plan, som anvendes i typiske mikroskoper. Ved at stå one-side-åbne celler på tørrings- eksperimenter er fordampningen retning reguleret og i den modsatte retning af tyngdekraften. Overvågning af sidebillede også muliggør beregningen af tørringen rottee4.
I fremtiden, ved at placere temperatur og fugtighed regulatorer på prøven stadium af indretningen, vil det være muligt automatisk at overvåge tidsmæssige ændringer i orienteringsmæssige parameterordre. Desuden ville en balance i opsætningen at overvåge vægtændring hjælpe estimeringen af koncentrationen. Denne fremgangsmåde kunne også anvendes til at afklare den anisotrope kvældningsprocessen polysaccharid hydrogeler 11, 12. Det vil derfor være muligt at overvåge de strukturelle ændringer i bløde aktuatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-støtte til unge forskere (16K17956) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan, Kyoto tekniske videnskaber Center og The Mitani Foundation for forskning og udvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
- Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
- De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
- De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
- Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
- Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
- Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
- Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
- Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
- Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).
