Summary
Een werkwijze voor het drogen geïnduceerde zelfintegratie van megamolecular biopolymeren op de lucht-vloeistof grensvlak kristallijn is hier voorzien. Deze methodologie zal niet alleen nuttig zijn voor het begrijpen van de macroscopische mogelijkheden van biopolymeren, maar ook als een evaluatiemethode voor de zachte materialen in biomedische en milieugebied.
Abstract
Levende organismen die water gebruiken, zijn altijd gevoelig voor drogen in de omgeving. Hun activiteiten worden gedreven door-biopolymeer gebaseerde micro- en macro-structuren, zoals te zien is in het geval van het bewegen van water in vaatbundels en hydraterende water in de huidlagen. In deze studie hebben we een methode om het effect van water vloeibaar kristallijne (LC) oplossingen bestaande uit biopolymeren bij drogen. LC biopolymeren hebben megamolecular gewicht, kozen we polysacchariden, cytoskelet eiwitten en DNA bestuderen. De waarneming van biopolymeeroplossingen tijdens drogen onder gepolariseerd licht toont milliscale zelfintegratie vanaf de onstabiele lucht-LC interface. De dynamiek van de waterige LC biopolymeeroplossingen kan worden gevolgd door verdampen van water uit een aan één zijde open cellen. Door het analyseren van de beelden die met behulp van cross-gepolariseerd licht, is het mogelijk de ruimtelijke en temporele veranderingen in de oriëntatie ordeparameter herkennen. Dezemethode kan nuttig zijn voor de karakterisering van niet alleen kunstmatige materialen op verschillende terreinen, maar ook natuurlijke levende weefsels. Wij zijn van mening dat het een evaluatiemethode zal zorgen voor zachte materialen in de biomedische en milieugebied.
Introduction
Door zich op de stijve, staafvormige structuren van biopolymeren zijn dynamische zachte materialen gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder polysaccharide biofilm matrices 1, "GELS" bestaande uit cytoskeleteiwitten 2 en "DNA origami" van gewenste vormen 3. De structurele eigenschappen te verduidelijken, zijn vele strategieën onderzocht, zoals transmissie-elektronenmicroscopie, scanning elektronenmicroscopie, atomic force microscopie en confocale fluorescentiemicroscopie. Echter, omdat deze methoden meestal worden uitgevoerd in een droge of statische toestand, is het moeilijk om het dynamische gedrag in macroscopische schaal te leggen, zoals te zien is in de werkelijke levende systemen. Onlangs hebben we met succes gezien het dynamische gedrag van biopolymeren op het water air-LC-interface door middel van gepolariseerd licht 4. Bij de toelichting van de georiënteerde structuur tijdens het drogen het biopolymeeroplossing, de tijdelijke veranderingen aangegeven zelfintegratie van biopolymeren op onstabiele air-LC interface.
We beschrijven hier een protocol voor het drogen van LC biopolymeeroplossingen aan de lucht-interface met behulp van LC gepolariseerd instrumenten. In tegenstelling tot andere analyses van de LC fase die geen rekening drogen 5, 6, werden de LC dynamiek tijdens het droogproces hier onderzocht door het evalueren van de oriëntatie ordeparameter in het zijaanzicht van de vloeibare fase in een aan één zijde open cellen . De combinatie van de cel verdamping en het gebruik van gepolariseerde instrumenten toegestaan macroscopische toezicht gehouden gecontroleerde opdamprichting. Bovendien was het mogelijk om het drogen records zijn gevalideerd door zich op de kristalstructuren van de geadsorbeerde microdomeinen, die werden beïnvloed door het molecuulgewicht, concentratie, etc. Om de effectiviteit van de werkwijze te tonen, het drogen prosen basische biopolymeren met stijve stang vormen, zoals polysacchariden, microtubuli (MT), en DNA, onderzocht. We kozen voor deze biopolymeren, omdat ze zijn typische voorbeelden van hiërarchische macromoleculen met megamolecular gewichten, en hun intermoleculaire interacties hen in staat stellen LC staten te vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instrumenten
- polarisatie-inrichting
- Een polarisatie-inrichting te construeren, te lichtbron een halogeenlamp, een lichtgeleider, polarisatoren, een monstertafel een optisch spoor, staaf bevindt en een digitale spiegelreflexcamera (zie Figuur 1 C and Materials List voor de polarisatie apparaatonderdelen).
2. Voorbereiding van het biopolymeer Solution
- polysaccharide oplossingen
- Ontbinden sacran 7 (0,5 g) in zuiver water (100 ml) werd geroerd bij -80 ° C gedurende meer dan 12 uur. Tijdens het oplossen, bedek de container met plastic folie om verdamping te voorkomen. Bereid een waterige oplossing van xanthaangom op dezelfde wijze.
- Koel de oplossing bij -25 ° C tot 0,5 gew% waterige oplossing te verkrijgen.
- Centrifugeer de oplossing sacran onzuiverheden (48.400 x g, 4 ° C, 1 uur, 3 tim verwijderenes).
- MT oplossing
- Bereid een 0,5 gew% tubuline-oplossing (1 ml) in een Britton-Robinson-buffer (80 mM piperazine-N, N'-bis (2-ethaansulfonzuur) (PIPES), 1 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether) - N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA) en 5 mM MgCl2, pH 6,8) op ijs 8.
- Met 0,5 gew% tubuline-oplossing (50 pl) en guanosine-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfaat (GpCpp) (5 pl) van een GpCpp-tubuline bevattende oplossing (50 pl) werd bereid. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 h teneinde een stabiele MT kern te verkrijgen.
LET OP: De rol van GpCpp is om MT vorming te ondersteunen en de depolymerisatie van MT volledig te onderdrukken aan tubuline. - Meng 0,5 gew% tubuline-oplossing (950 pi) en de GpCpp-tubuline bevattende oplossing (50 pl) bij -25 ° C gedurende 1 dag om een stabiele 0,5 gew% MT oplossing.
- DNA-oplossing
- Bereid een 0,5 gew% DNA-oplossing (1 mL) in Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris, pH 8,0, met 1 mM EDTA).
- Houd de 0,5 gew% biopolymeer monsteroplossingen bij 25 ° C voor het drogen experiment.
3. Drogen experimenten en observatie onder Cross-gepolariseerd licht
- Oplossingen in een aan één zijde open cellen (Figuur 1A)
- Snijd een siliciumplaat (zie Materialen List) in een geschikte vorm met een dikte van 1 mm (binnenmaat van 5-15 mm, 1 mm en -20 mm; Figuur 1A).
- Monteer een aan één zijde open cellen bestaat uit een silicium afstandhouder met een binnenafmeting van 5-15 mm, 1 mm en -20 mm en twee niet-gemodificeerde glasplaatjes (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fix beide zijden van de cel met dubbele klemmen vooraf aan de monsteroplossing weglekt houden.
- Voeg langzaam elk 0,5 gew% biopolymeer oplossing (100-300 uL) met een ~ 1 mm poriegrootte pipette tip om elke cel bij -25 ° C. Verwijder luchtbellen uit de cellen met behulp van een injectienaald.
- Plaats de cellen in een oven met een lucht circulator bij 60 ° C onder atmosferische druk te verdampen; verdamping richting tegengesteld aan die van de zwaartekracht.
- Snijd een siliciumplaat (zie Materialen List) in een geschikte vorm met een dikte van 1 mm (binnenmaat van 5-15 mm, 1 mm en -20 mm; Figuur 1A).
- Waarnemingen onder dwars-gepolariseerd licht (Figuur 1B-1C)
- Verschaffen rechte zichtbaar licht via een 100 W halogeenlamp met een platte oppervlaktelichtbron een groot contactoppervlak (80 mm x 80 mm). Pas de polarisatoren 45 ° en 135 ° met de houders (figuur 1C).
- Bevestig de positie van de lichtbron, polarisatoren, monsterplateau en de camera met een optische spoor en stang staat (figuur 1C). Plaats de monstertafel tussen de beide polarisatoren (de afstand tussen de polarisatoren moet -5 cm). Zet de camera ~ 20 cm van het monster podium te laten scherpstellen.
- Op bepaalde tijdstippen, plaatst de monsters uit stap 3.1.3 tussen de polarizers op het podium evenwijdig aan het XZ-vlak en bedekken de inrichting met een zwart gordijn; het betreffende toestel wordt getoond in Figuur 1C.
- Fotografeer de monsters door middel van lineaire gekruiste polarisatoren met een digitale spiegelreflexcamera met een standaard zoomlens (zie Materials List). Controle over de camera-instellingen, zoals de brandpuntsafstand, met behulp van computer software (zie Materials List).
- Spatio-temporale analyse van de doorgestraalde lichtintensiteit (figuur 1C)
- De verandering van de oriëntatie ordeparameter het droogproces te evalueren, verzamelen foto uur gedurende 24 uur.
- Meet de doorgestraalde lichtintensiteit langs de hartlijn in de Z-richting als grijswaarde via een beeldbewerkingsprogramma (bijvoorbeeld ImageJ).
- Maak een grafiek van de grijswaarde als functie van de afstand vanaf de bovenkant open zijde.
- Microscopische waarneming onder gepolariseerd light (Figuur 1D)
- De werkwijzen te verifiëren, microscopische waarneming met een polarisatiemicroscoop uitgerust met een CCD camera 9. Houd een eerste-orde vertragingsplaat in het lichtpad. Controle van de voorwaarden voor de foto's met behulp van een pc-software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het toestel als getoond in figuur 1, de zelf-integratie van microdomein tot macrodomain een drooglucht-LC grensvlak werd geëvalueerd (figuur 2A). Aangezien de eerste demonstratie van het drogen experiment twee soorten megamolecular polysacchariden, sacran (Mw = 1,9 x 10 7 g mol -1) en xanthaangom (4,7 x 10 6 g mol-1), werden vergeleken. Figuur 2B toont foto's van de oplossingen in de cel onder kruis-gepolariseerd licht. Vóór het drogen, was het mogelijk om een aantal felle regio's met doorgelaten licht waarnemen in een verstrooide toestand in beide oplossingen. Na drogen bij 60 ° C gedurende 6 uur, het gebied onder de air-interface in de LC sacran oplossing werd hoog significant. Dit betekent dat de domeinen vormden een macroscopisch georiënteerde structuur aan het grensvlak, vergelijkbaar met de vorming huidlaag in een gel krimpproces"xref"> 10. Anderzijds, de intensiteit van de xanthaan oplossing drastisch af wanneer de temperatuur slechts verhoogd van 25 ° C tot 60 ° C en enkele kleine macrodomains waargenomen onder het scheidingsvlak. Dit komt omdat de mobiliteit van de xanthaan microdomein veel gevoeliger voor temperatuur dan die van de sacran microdomein. De kritische verschillen in de oriëntatie van het grensvlak werden dus gedetecteerd door de polarisatie-inrichting.
Figuur 2C en film S1 tonen de resultaten van spatio-temporale analyse van het droogproces in de sacran oplossing. De doorgestraalde lichtintensiteit geeft de oriëntatie van de ordeparameter microdomein. De piekintensiteit rond de lucht-vloeistof grensvlak aanzienlijk toegenomen, en de dikte steeg tot ~ 2 mm. Deze resultaten geven duidelijk aan dat de microdomeinen beginnen te oriënteren uit de lucht-LC-interface eend uitgroeien tot een milliscale domein evenwijdig aan het scheidingsvlak. Uit deze waarneming onder gepolariseerd licht, is het dus mogelijk om het fluïdum bewegingen zichtbaar bij het drogen.
De verschillen tussen sacran en xanthaangom qua formaat en macrodomain oriëntatierichting werden ook bevestigd door een polarisatiemicroscoop met een eerste-orde vertragingsplaat (Figuur 2D). Sacran de vloeibare fase liet men blauwe gebied, waardoor een macrodomain gevormd bij het grensvlak. In tegenstelling, de xanthaangom vloeibare fase bleek blauw, geel en roze gebieden, waardoor de meervoudige macrodomains gevormd met willekeurige oriëntaties.
Deze werkwijze werd ook onderzocht voor het vergelijken van drie soorten fundamentele stijve biopolymeren met megamolecular gewichten - polysacchariden (sacran: Mw = 1,9 x 10 7 gmol -1, microdomeinlength> 20 pm), MT (Mw = 10 9 -10 10 gmol -1, microdomein lengte> 10 pm) en DNA (Mw = 1,3 x 10 6 gmol -1, microdomein lengte <1 pm) - in een fysiologische omgeving bij 37 ° C. Voor het drogen zoals getoond in figuur 3B, de sacran oplossing en de MT oplossing toonde vergelijkbare LC staten, met verspreide gebieden in het hele gebied. Tijdens het droogproces, de domeinen in het MT oplossing onderging ook zelfintegratie uit de lucht-LC interface en de verstrooide domeinen geïntegreerd in één macrodomain. Anderzijds, de DNA-oplossing toonde geen specifieke oriëntatie in de vloeistoffase. Bij de MT oplossing en de DNA-oplossing bereid met buffers, is het belangrijk op te merken dat integratie wordt beïnvloed door de veranderingen in zoutconcentratie, pH en ionensterkte tijdens het drogen.
(Figuur 3C). De sacran drogende plaat vertoonde significante dubbele breking intensiteiten door de milliscale enkele montage macrodomain. Voor het drogen MT plaat, namen wij golvende bundels waarbij de lange as evenwijdig aan de X-as was. In tegenstelling, het drogen record van de DNA-oplossing toonde korrelvormige vorm macrodomains <5 urn in diameter en in willekeurige richtingen. Uit deze waarnemingen blijkt duidelijk dat de macrodomain grootte wordt beïnvloed door de lengte van het staafvormige microdomeinen. Het was derhalve mogelijk om de uitlijning van het biopolymeer microdomeinen geëvalueerd door het observeren van de platen drogen met behulp van een polarisatiemicroscoop.
Concluderend werkwijzen waarbij gepolariseerd licht gebruiktde zelfintegratie van megamolecular biopolymeren op de drooglucht LC-interface. De dynamiek van de waterige LC oplossingen werden gevolgd door verdamping van water uit een aan één zijde open cellen. Door het analyseren van de opnamen die zijn gemaakt met behulp van cross-gepolariseerd licht, was het mogelijk om ruimtelijke en temporele veranderingen en de oriënterende orde parameter herkennen. Aangezien de aangetoond droogproces lijkt op natuurlijke processen, zou deze werkwijze nuttig voor het karakteriseren van niet alleen kunstmatige materialen op verschillende gebieden, maar ook natuurlijke levende weefsels. Wij zijn van mening dat dit een evaluatiemethode zou kunnen bieden voor een zachte materialen in de biomedische en milieugebied.
Figuur 1: Drogen experiment. (A) Schematische weergave van oplossingen in een aan één zijde open cellen. (B)Schematische weergave van de experimentele inrichting voor observaties onder dwars-gepolariseerd licht. De polarisatoren waren normaal ingesteld op 45 ° en 135 °. (C) Het betreffende toestel. Dit cijfer is aangepast referentie 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Het droogproces waterige oplossingen van de polysachariden sacran en xanthaangom. (A) Schematische weergave van de zelfintegratie de drooglucht LC-interface. (B) Side uitzicht op twee soorten polysaccharide oplossingen bij hun oorspronkelijke toestanden en na6 h drogen bij 60 ° C onder dwars-gepolariseerd licht. De aanvankelijke polymeerconcentraties waren 0,5 gew%. (C) Doorgestraalde lichtintensiteit door een gekruiste Nicols op een lijn in de Z-richting voor elk beeld dat op een bepaald tijdstip. (D) Polarisatie microscopische beelden van de polymeeroplossingen in de cel na 6 uur drogen bij 60 ° C. Rode pijlen: macrodomains op de interface. Dit cijfer is aangepast referentie 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Het droogproces biopolymeer waterige oplossing en het drogen platen. (A) Bronnen van polysaccharides (cyanobacteriën), MT (varkenshersenen) en DNA (zalm testes). (B) Zijaanzichten van sacran, MT en DNA oplossingen tijdens drogen bij 37 ° C onder dwars-gepolariseerd licht. De aanvankelijke polymeerconcentraties waren 0,5 gew%. (C) Microscopische beelden van het gedroogde polymeerfilms op het glassubstraat door de gegeven aanwijzingen van de gekruiste Nicols. Alle schaalbalken 50 urn. Dit cijfer is aangepast referentie 6. Copyright: The American Chemical Society, 2016. Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film S1: Drogen werkwijze volgens de sacran oplossing tijdens drogen bij 60 ° C, waargenomen met behulpgekruist Nicols. Klik hier om dit filmpje te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het was soms moeilijk voor de camera te richten op het monster als gevolg van de uitgezonden lichtintensiteit te laag. In dergelijke gevallen, het plaatsen van een verlengde doorzichtige kunststoffolie op het podium hielp om scherp te regelen. De beperking van de waarneembare resolutie is afhankelijk van de cameralens, ~ 10 pm in dit geval. De waarneembare beperking van de monsterdikte, Ay, afhankelijk was van de maximale lichtintensiteit van de lamp, ~ 10 mm in dit geval.
Het voordeel van de in figuur 1B inrichting is dat het zijaanzicht foto van het monster te nemen tijdens het droogproces. Geconstateerd kan zonder te vertrouwen op het horizontale vlak dat wordt gebruikt in de typische microscopen worden uitgevoerd. Door zich de aan één zijde open cellen tijdens het drogen experimenten wordt de opdamprichting gereguleerd en in de tegenovergestelde richting van de zwaartekracht. Follow zijaanzicht maakt ook de berekening van de drogende rate4.
In de toekomst, door het plaatsen van temperatuur en vochtigheid regelaars op de monstertafel van de inrichting, is het mogelijk om automatisch bewaken tijdelijke veranderingen in de oriëntatie ordeparameter. Bovendien zou een evenwicht in de setup om het gewicht veranderingen op te volgen helpen bij de schatting van de concentratie. Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om het anisotrope zwelling verduidelijken polysaccharide hydrogelen 11, 12. Het zou dus mogelijk zijn om de structurele veranderingen van zachte actuators controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidie-in-steun voor jonge wetenschappers (16K17956) van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan, Het Kyoto technoscience Center en The Mitani Stichting voor Onderzoek en Ontwikkeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sacran | Green Science Materials Inc., Japan | From Aphanothece sacrum. Mw = 1.9 × 107 g mol-1 |
|
| xanthan gum | Taiyo Kagaku Co., Japan | Neosoft XC | From Xanthomonas campestris. Mw = 4.7 × 106 g mol-1 |
| tubulin | Cytoskeleton, Inc., USA | T240 | From porcine brain. |
| GpCpp | Jena Bioscience, Germany | NU405L | |
| piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrichi, Co. LLC. | P6757-500G | PIPES |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | 342-01314 | EGTA |
| MgCl2-6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-15055 | |
| KOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 162-21813 | pellet |
| DNA | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | D1626 | From salmon testes. Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp) |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich, Co. LLC. | T9285-100ML | 10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA |
| slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan | S1111 | |
| silicon rubber sheet | Asone Co. | 6-611-32 | Thickness: 1 mm |
| centrifuge | Beckman-Coulter, Inc., USA | Avanti J-25 | equipped with a JA-20 rotor |
| light source | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | LS-LHA | |
| light guide | Sumita Optical Glass, Inc., Japan | GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M) | 80 mm × 80 mm |
| halogen lamp | Ushio Inc., Japan | JCR 15V150WBN | |
| holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | KMH-80 | |
| sample stage | Sigmakoki, Co.,Ltd. | TARW-25503L | |
| sample holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | SHA-25RO | |
| rod | Sigmakoki, Co.,Ltd. | ROU-12-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-6-40 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-60 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-80 | |
| posts holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | RS-12-130 | |
| carrier | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CAA-25LS | |
| camera holder | Sigmakoki, Co.,Ltd. | CMH-2 | |
| medium optical rail | Sigmakoki, Co.,Ltd. | OBA-500SH | |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L25 mm |
| lenstube | Tomytech, BORG | lenstube BK | 80φ, L50 mm |
| multiband | Tomytech, BORG | 80φ | |
| V plate | Tomytech, BORG | V plate 60S | |
| plate holder | Viexen, Co.,Ltd. | plate holder SX | |
| EOS Kiss X7i | Canon Inc., Japan | 8594B001 | with a standard zoom lens, EFP 18-55 mm |
| photographic software | Canon Inc., Japan | EOS Utility | |
| PC | Microsoft | Surface | |
| polarization microscope | Olympus | BX51 | |
| first order retardation plate | Olympus | U-TP530 | λ = 530 nm |
| CCD camera | Olympus | DP80 | |
| photographic software | Olympus | cellSens Standard | |
| Java-based image processing program | the National Institutes of Health | ImageJ |
References
- Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
- Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
- De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
- De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
- Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
- Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
- Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
- Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
- Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
- Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).
