Summary
이 프로토콜에는 기름 통 면봉의 사용 및 Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 와 같은 병원 체를 검출 하기 위하여 센 티 넬의 단독 사용에 비해 증가 탐지에 이르게 zebrafish 시스템의 슬러지 분석 설명 합니다. Pseudocapillaria tomentosa. 검역에 P. tomentosa 계란을 모니터링 하는 시스템도 제안 했다.
Abstract
건강 모니터링 시스템 개발 및 Danio rerio Aeromonas hydrophila, 진 균 종, Pseudocapillaria tomentosa 등의 병원 균을가지고 있기 때문에 제 브라 연구 시설에서 사용 동물 복지 및 연구 손상. 물고기는 일반적으로 분석 된 사후 미생물을 검출 하기 위하여. 센 티 넬을 사용 하 여 감시의 감도 향상 하 고 샘플을 동물의 수를 줄이기 위해 제안 된 방법입니다. 반복 시스템 사전 여과 센 티 넬 탱크의 설정을 설명 합니다. 기술은 나이, 성별, 그리고 긴장의 주의 깊은 선택에 의해 물고기 인구를 대표 하 고 수질오염을 방지 하기 위해 개발 된다. 동물의 최소 수를 사용, 기술 환경에도 자세히 나와 있습니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 표면 기름 통 면봉에는 크게 약간 우세 하 고 병원 성 mycobacterial 종 fortuitum 진 균, 진 균 haemophilum, 등의 검출 향상 사용 진 균 chelonae. 또 다른 환경 방법은 지주 탱크 또는 기름 통 P. tomentosa 계란에 대 한 보고의 바닥에 슬러지 처리 이루어져 있다. 이것은 사육 장치 가져온된 동물의 지주 탱크에 빠져들은 격리에 적용할 수 있는 저렴 하 고 빠른 기술 이다. 마지막으로, PCR 슬러지 샘플에 적용 되 고 A. hydrophila 기름 통의 하단 표면에서 발견. 일반적으로, 이러한 특정 병원 체에 적용 되는 이러한 환경 심사 기술을 사전 여과 센 티 넬의 테스트에 비해 증가 감도 끌고있다.
Introduction
보호 연구 및 동물 복지1,2, 동물 시설 내에서 병원 균의 존재를 모니터링 합니다. Zebrafish, 상태 모니터링3,,45,6,7,,89,10,11의 경우 종종 동물 분석 사후 histopathology, 세균 학 문화, 또는 분자 방법에 의존. 식민지 동물만을 테스트 하는 것은 물고기와 낮은 보급의 병원 체를 검출 하는 데 필요한 것 이라고 관련된 비용의 수 권장된 방법이 아닙니다. 따라서, 선호 하는 방법 오염 물질의 높은 부하에 동물의 작은 그룹을 노출 하는 것입니다. 이 물고기는 사전 여과 센 티 넬 라고 합니다. 이 노출 개월 지속 되며 동물 보호자의 작업 또는 목적 엔지니어링 솔루션 일부에서 증가 포함 한다. 또 다른 도전은 격리 비옥한 동물은 살아 보관 하 고이 시체에 일상적인 분석와 호환 되지 않습니다에서 가져온 심사 이다.
여기 수생 시스템의 환경을 검사 하 여 특정 zebrafish 병원 체 (A. hydrophila, 진 균 종, 그리고 P. tomentosa)를 검색 하는 몇 가지 방법을 설명 합니다. 목표는 매출, 비용, 및 탐지의 감도 최적화 하 고 상태 모니터링에 사용 되는 물고기의 수를 줄이기 위해. 이러한 메서드는 동물의 사용에 대안 그리고 일부 기술 심사 수입 검역에 적용 될 수 있습니다. 예를 들어 Mocho9 (센 티 넬 포함), 제 브라 보다 기름 통 면봉에 PCR을 수행 하 여 더 많은 병원 성 mycobacterial 종을 식별할 수 있었다 그리고이 적은 샘플으로 얻은. 그 같은 연구, P. tomentosa 계란 더 감도 부 그리고 현미경 검사 법을 사용 하 여 탱크 슬러지를 심사 하 여 발견 했다 PCR 및 histopathology 물고기를 테스트 하는 대신.
표 1 센 티 넬 프로그램3,,45,6,7,8,9,10의 다양 한 특성을 요약 한 zebrafish 시설 수로 사용. 후 여과 센 티 넬 사전 여과 센 티 넬 수신 물 일단 그것 먼저 식민지 물고기 탱크를 통해 유포 하고있다 반면 물 식민지 물고기와 같은 방식으로 나타납니다. 예를 들어 사전 여과 센 티 넬 기름 통 물 지속적으로 수신 하 여 반복 시스템에에 설정할 수 있습니다. 한 방에 많은 독립적인 시스템 있을 때이 옵션을 않을 수 있습니다. 이 경우에, 사전 여과 센 티 넬의 한 탱크 전체 룸 화면을 사용할 수 있습니다. 센 티 넬 반복 시스템, 정적 탱크에 있고 그들의 물만 사전 여과 물 즉, 방에 있는 모든 시스템에서 기름 통 물을 사용 하 여 정기적으로 변경 됩니다. 이 기술은 환경 심사의 효능 비교에 대 한 기준으로 아래 설명 되어 있습니다. 제안 된 설정은 pH 또는 질소 오염 감소 같은 물 품질 문제를 제어 하도록 설계 되었습니다.
세균 환경 심사의 개념 박테리아는 감지는 탱크의 바닥에 슬러지 또는 물 표면에 기름 통 벽에 있는 같은 biofilm에서 가설에 의존 합니다. 기름 통이 보인다 이상적인 샘플링 포인트를 recirculating 양식 체계 (물, 배설물, 피드, 그리고 다른 유기 물질) 폐기물 수집 이후 모든 탱크 사전 여과에서. 표면에는 기름 통은 종종 쉽게 연결할 수는 보라고 하는 것은 빨리, 그리고 aseptically (예: 장갑)에서 샘플의 교차 오염을 방지 하려면 수행할 수 있습니다. 개념은 zebrafish 시스템9,12에서 만연한 병원 성 진 균 종 식별 하는 데 사용 됩니다. 기술은 아래 설명 하 고 우리는 또한 zebrafish 기름 통 표면 면봉에 슬러지 A. hydrophila 의 탐지를 보고.
기생충 알에 대 한 환경 심사 기반 탐지 머 레이 외. 13 와 부양 기술은 정기적으로 기생충학 및 배설물14기생충 계란의 현미경 검사에 사용 됩니다. Mocho9 샘플링 과정에 대안을 제안 하 고 기술을 다른 종의 물고기 소 생활권을 검출 하기 위하여 사용 될 수를 보였다. 감염 된 D. rerio 통과 P. tomentosa 그들의 배설물과 함께 계란 그리고 기생충 계란 슬러지에는 탱크의 바닥에 남아 있다. 그들은 있을 수 있습니다 수집 물 보다 큰 되 고 그들의 밀도 때문. 계란의 밀도 너무 환경 샘플을 처리 하는 데 사용 됩니다. 원심 분리와 함께 첫 번째 부양 무거운 문제에서 물과 빛의 파편을 분리합니다. 두 번째 원심 튜브의 표면에 등장 하는 기생충 알 수 있도록 ( P. tomentosa 계란의 밀도 보다 큰 밀도)와 포화 설탕 솔루션에 의존 합니다.
심사는 biofilm에 박테리아와 탱크의 하단에서 P. tomentosa 슬러지 샘플 앙금 얻은 첫 번째 원심 분리 후에 이러한 모든 병원이 균에 대 한 PCR을 수행 하 여 결합할 수 있습니다. 이 샘플링 시간을 최적화합니다. 방법은 아래 설명 되어 있습니다. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 이러한 격리 컨텍스트에서 제안 합니다. 가져온된 성인 zebrafish 유지 될 필요가 있는 화면, 사육 장치 격리 탱크에 삽입 됩니다. 1 주 후 배설물 및 다른 폐기물 사육 장치에서 수집 된 있으며 현미경 또는 PCR 검사를 실시. 기술은 아래 설명 그리고 P. tomentosa 계란이이 맥락에서 현미경에 의해 발견 되었습니다.
Protocol
1. 노출 사전 여과의 반복 시스템 센 티 넬
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깨끗 한 8 L 탱크 반복 시스템을 설정 합니다. 채워 그것 물은 집 수에서 오는. 2 세라믹 구슬 추가 또는 큐브 화면 (그림 1) 시스템에서 바이오-미디어의 갯 솜. 1-2 D. rerio/L (즉, 12 생선)를 추가 합니다. 시설, 예를 들어 AB.에에서 지배적인 유전 배경의 야생 유형 물고기를 사용 하 여
- 6 생선을 다음과 같이 선택 합니다: 적어도 하나의 암컷과 6 개월 아래 나이, 한 여성 및 6, 18 개월, 그리고 한 여성 연령 18 개월 이상 한 남자 사이 한 남자의 한 남자.
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먹이 하루에 한 번입니다. (예:, 건조 다이어트, 소금물 새우) 센 티 넬 zebrafish 시설에서 사용 하는 모든 다이어트에 노출 되는 것을 확인 하는 다이어트 다. 월요일, 수요일, 그리고 금요일, 즉,에 4 개월 동안 일주일에 세 번 변경 합니다.
- 물 교환을 실시, 전송 임시 탱크에 센 티 넬 및 바이오 미디어. 센 티 넬 탱크를 완전히 비어 하 고 그것을 청소. 센 티 넬 탱크 기름 통 물 리필. 센 티 넬과 바이오 미디어를 다시 넣어.
- 기름 통 물에 4 개월에 대 한 센 티 넬을 노출 합니다. 2-파 (3 mL/L)의 과다 솔루션에서 침수 등 승인 된 방법으로 물고기를 안락사.
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확인 하려면 죽음, opercula 운동 중단 후 10 분 동안 기다립니다.
- 집게와는 수 색을 완전히 확인 된 용기에-80 ° C에 그것을 동결. 이 PCR12,15사용 될 것입니다.
- 또는 잘라는 tailat 꼬리 peduncle, 복 벽, 닉 고 4% 포 르 말린에 설정 합니다.
주의: 장갑을 사용 하 고 증기 histopathology 캐비닛. 라벨 샘플 컨테이너.
2. 기름 통 면봉
- 살 균 건조 면봉을 사용 하 여 플라스틱 샤프트. 장갑을 착용 한다. 면봉 (물 표면에 기름 통 벽)을 찾아서 표면에 쉽게 액세스를 방지 하는 모든 항목을 제거 합니다. 낮은 흐름 기름 통 표면을 선택 하십시오.
-
외부 포장을 제거 하 여 면봉 사설을 하 고 공기를 살 균 면 팁을 노출. 면봉의 교차 오염을 안 된 표면을 만지지 돌보는 피하십시오.
- 기름 통 벽 흡수 하는 물과 기름 통 물 표면 수준에서 biofilm을 5-10 cm 이상 면봉.
- 다시 면봉을 칼 집 또는 메 마른 분리기 관으로 팁을 휴식. 라벨 샘플 및 PCR 테스트 보내거나-80 ° c.에 고정
3. 탱크의 하단에 P. tomentosa 계란의 탐지
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현미경 검사 법에 의해 슬러지 분석
- 9 60 mL 주사기 사용 하 여 발음 기름 통 또는 센 티 넬을 포함 하 여 물고기를 잡고 어떤 탱크의 바닥에 슬러지. 15 mL 튜브 샘플을 나눕니다. 그들의 나사 상판과 튜브를 닫고 튜브 라벨.
- 포화 설탕 솔루션 준비 (특정 한 중력 = 1.27) 자력14227 g 뜨거운 물 177 mL에 입자가 굵은 설탕을 혼합 하 여.
- 175-250 x g 스윙 양동이와 원심 분리기에서 10 분에서 15 mL 튜브 원심 튜브를 가만히 따르다 하 고 그들의 튜브에는 토사를 유지.
- 포화 설탕 솔루션 중간 튜브를 작성. 그들의 나사 상단 튜브를 닫고 솔루션 퇴적 물을 철저 하 게 혼합.
- 원심 분리기 스윙 양동이에 튜브를 놓고 상단에 포화 설탕 해결책으로 그들을 기입 합니다. 각 튜브 위에 부드럽게 및 포화 설탕 솔루션 접촉 한 커버 유리를 설정 합니다.
- 10 분 일부 커버 유리 수 있습니다가 하 고 거기에 따라서 원심 분리 동안 휴식에 대 한 175-250 x g에서 원심 분리기는 각 60 mL 샘플 4 튜브 있습니다. 커버 유리를 리프트 하 고 유리 슬라이드에 설정 합니다. 연필 이나 마커 펜으로 슬라이드를 레이블을 지정 합니다.
- 경우에 너무 많은 커버 유리 파손 발생, 포화 설탕 솔루션, 10 분 동안 175-250 x g에서 원심 분리기 튜브의 대부분을 작성, 포화 설탕 솔루션을 상단에 기입 다음 부드럽게 커버 유리를 설정. 30 분을 기다립니다.
- P. tomentosa 달걀 현미경13 (그림 2 및 비디오 1)을 찾습니다. 확대 400 X6에서 바이 폴라 플러그를 식별 합니다.
참고: 계란의 크기는 57-78 µ m 길이 27-39 µ m 직경16,17. Note 1 긍정적인 슬라이드는 긍정적인 선언 60 mL 샘플에 대 한 충분.
-
P. tomentosa 계란에 대 한 검역 검사 수입 동물
- 탱크에서 남성과 여성의 D. rerio 를 설정 합니다. 일반적으로 수확 하 고 폰된 계란을 보존 하지만 여기 배설물 (그림 3)를 그것을 사용 하는 데 사용 하는 장치는 탱크에 추가 합니다.
참고: 예를 들어 전체 1 L 사육 탱크 (외부 탱크 및 강판 바닥 내부 탱크)은 완전히 침수 13 L 탱크, 물고기 번 식 장치 및 이동에 대 한 무료로 이용할 수에. - 1 주일 후 사육 장치를 제거 하 고 단계 3.1 "슬러지 분석 현미경 검사 법에 의해."에서 설명한 대로 사육 장치에서 수집 된 슬러지를 수확
- 탱크에서 남성과 여성의 D. rerio 를 설정 합니다. 일반적으로 수확 하 고 폰된 계란을 보존 하지만 여기 배설물 (그림 3)를 그것을 사용 하는 데 사용 하는 장치는 탱크에 추가 합니다.
4입니다. PCR 슬러지 침전 물에
- 탱크 또는 기름 통 60 mL 주사기9 의 바닥에 슬러지를 발음 하 고 60 mL 튜브에 샘플을 전송. 튜브는 스크류 상단으로 닫고 튜브 라벨. 주사기 폐기.
- 60 mL 튜브를 흔들어 하 고 15 mL 튜브에 15 mL를 전송. 튜브는 스크류 상단으로 닫고 튜브 라벨.
- 175-250 x g 스윙 양동이와 원심 분리기에서 10 분에서 15 mL 튜브 원심 튜브를 가만히 따르다 하 고 튜브에는 토사를 유지.
-
외부 포장을 제거 하 여 면봉 사설을 하 고 공기를 살 균 면 팁을 노출. 면봉의 교차 오염을 안 된 표면을 만지지 돌보는 피하십시오.
- 15 관에서 퇴적 물을 면봉 s.
- 다시 면봉을 칼 집 또는 메 마른 분리기 관으로 팁을 휴식. 라벨 샘플,-80 ℃에서 동결 하 고 PCR 테스트 보낼.
참고: 45 mL 60 mL 튜브에 남아 있습니다. 이 수 보관 P. tomentosa 계란의 검출에 대 한 슬러지 분석 현미경 검사 법에 의해 단계 3.1 예: PCR 결과 확인 하려면에 설명 된 대로. 슬러지에 PCR 심사 단계 3.2 다음 가져온된 동물에 대 한 재판을 받을 수 있습니다.
Representative Results
생선 샘플에 비해 널리 진 균 종 식별 하 기름 통 면봉의 혜택은 그림 4에 결과 의해 지원 됩니다. 115, 물고기의 테스트 M. chelonae 와 M. haemophilum 했다 발견 5%와 3%의 샘플, 각각. 아니 다른 병원 성 mycobacterial 종 확인 되었다. 동일한 시스템에서 49 기름 통 면봉 5 mycobacterial의 존재를 공개 했다. 확율 비율은 M. chelonae 그리고 M. fortuitum 감지 더 자주 PCR에 의해 물고기 샘플에서 보다 표면 기름 통 면봉에 가설으로 계산 됩니다. 이것은 통계적으로 중요 한 11의 각각 확율 비율 (95 %CI: 4 ~ 29; p < 0.0001)과 306 (95 %CI: 18 5208; p = 0.0001). 결과 표시 표면 기름 통 면봉 기술 진 균 종에 대 한 화면 zebrafish 시설에 센 티 넬의 유일한 사용에 중요 한 대안 이다 환경 샘플 또한 사용 되었다 A. hydrophila화면에. 이 박테리아는 물고기, 슬러지, 그리고 표면 샘플 (그림 4)에서 발견 했다. 이 또한 생선 소 생활권에 제안 된 기술의 능력을 지원 합니다.
P. tomentosa 계란을 검출 하기 위하여 슬러지 분석에 관한 Mocho9 계란 같은 시스템에서 분석 된 슬러지의 93%에서 발견 된 반면 PCR 및 histopathology 생선 샘플의 27%에서 기생충을 감지. 여기, 기술은 검역 심사 재현을 전했다. 이러한 맥락에서 가져온된 동물 샘플링 수 없습니다, 고 생물 관리와 적시에 자신의 건강 상태를 평가 하는 데 도움이. P. tomentosa 긍정적인 시설에서 알 수 없는 건강 상태 물고기 8 탱크 사육 장치를 설정 했다: 최대 16 물고기/13 L 탱크, 7 유전자 변형 및 1 강포한 유형 선, 성별, 혼합의 세 4-24 개월. 슬러지는 1 주일 후 장치에서 수확 되었고 현미경에 의해 분석. P. tomentosa 계란 7 (88%) 샘플에서 볼 수 있었다. 마지막으로, 기생충의 PCR 탐지 기름 통 면봉 및 슬러지 퇴적 물에 trialed 이었다. 4 6 슬러지 샘플 PCR 긍정적인 되었고 모든 결과 표면 면봉에 대 한 부정 했다. 슬러지 심사는 탱크의 바닥에가에 계란의 능력에 의존 하는 때문에, 이것은 놀라운 일이 아니다. 이 슬러지 분석 기법 D. rerio aquaria P. tomentosa 감염에 대 한 고 방법이 가져온된 동물의 심사에 대 한 적용할 수 있습니다 사용할 수 있습니다 보여줍니다.
그림 1: 반복 시스템 사전 여과 센 티 넬 탱크. 8 L 탱크 물과 화면에는 시스템의 집 수에서 바이오 미디어 채워집니다. 2 개의 백색 세라믹 바이오 미디어 비즈 (사진) 중간 탱크의 바닥에 앉는 다. 12 물고기 그들의 스트레인, 연령과 성별, 선택 하 고 센 티 넬 탱크에 추가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 현미경 검사 법에 의해 슬러지 분석 하는 동안 검색 P. tomentosa 계란. 확대 사용 400 X 했다입니다. 화살표는 바이 폴라 플러그를 나타냅니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 분석에 대 한 슬러지 수집 수조 지주에에서 빠져들 사육 장치. 이 탱크는 그림; 목적 벤치에 설정 되어 그렇지 않으면 반복 시스템에서 설정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 물고기,의 진 균 종, A. hydrophila, P. tomentosa PCR에 의해 식별의 비율 표면 기름 통 면봉, 및 기름 통 슬러지. 백분율 테스트 샘플의 수로 각 병원 체 종에 대 한 긍정적인 결과의 수를 나누어 얻을 수 있습니다. 긍정적인 결과의 백분율 물고기, 표면, 또는 슬러지, 샘플 형식에 의해 주어진 이며 박테리아의 이름 표시. 115 물고기와 49 표면 기름 통 면봉의 진 균 종 식별에 대 한 PCR에 의해 시험 되었다 이 연구의 확장 이므로 데이터 Mocho의9 결과 함께 컴파일됩니다. 물고기는 주로 사전 여과 센 티 넬 프로토콜 섹션 1에 의하여. 드물게, 센 티 넬 사용할 수 있었던, 탈북자와 오래 된 식민지 물고기 (> 18 개월) 샘플링 된. 진 균 종에 대 한 모든 테스트 시스템은 물고기와 기름 통 면봉에 시험 되었다. 확율 비율은 M. chelonae 그리고 M. fortuitum 감지 더 자주 PCR에 의해 물고기 샘플에서 보다 표면 기름 통 면봉에 가설으로 계산 됩니다. 이것은 통계적으로 중요 한 11의 각각 확율 비율 (95 %CI: 4 ~ 29; p < 0.0001)과 306 (95 %CI: 18 5208; p = 0.0001). 진 균 marinum PCR 모든 샘플에 대 한 부정적 이었고 따라서 이러한 시설에서 결 석으로 간주 되며 분석에 포함 되지 않습니다. 12, 14 표면 기름 통 면봉, 생선과 6 기름 통 슬러지는 A. hydrophila의 존재에 대 한 PCR에 의해 시험 되었다. 6 집 수 및 슬러지 표면에 P. tomentosa 의 존재에 대 한 테스트 되었습니다. PCR = 연쇄 반응. CI = 신뢰 구간. * 및 * * 나타내는 통계적 의미; 다른 비교는 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1:의 달걀에 대 한 검색 P. tomentosa 현미경. 3.1 단계에서 설명한 대로 슬라이드 슬러지 분석에서 얻은 것입니다. P. tomentosa의 달걀을 감지 하는 필드 검색 됩니다. 구조 인식 되 면 그것은 확대 된 더 높은 해상도에서 id를 확인 하. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
| 저자 | 노출의 시작 나이 | 노출의 길이 | 샘플링 시대 | 사전 또는 사후 여과 |
성별 | Strain(s) |
| 바튼 외. 3 | 4 개월 | 6 개월 | 10 개월 | 사전 여과 | N/A | N/A |
| 보 그 스 외. 4 | 6 개월 | 6 개월 | 12 개월 | 사전 여과 | N/A | AB 야생 타입 |
| Collymore 외. 5 | 가능한 한 한 어린 | 3 개월 | < 6 개월 | 사전 여과 | N/A | N/A |
| 가 슬 러 외. 6 | 4 개월 | 4 개월 | 8 개월 | 사전 및 사후 여과 |
N/A | AB 야생 타입 |
| 리 우 외. 7 | 3 개월 | 1-6 개월 | 4-9 개월 | 사전 및 사후 여과 |
N/A | 야생 타입 |
| 마틴 외. 8 | 3 개월 | 3 개월 | 6 개월 | 사전 여과 | N/A | 야생 타입 |
| Mocho9 | < 6 개월, 6-12 개월 > 18 개월 |
4 개월 | 7-24 개월 | 사전 여과 | 1 여성 및 1 남자의 각 연령 그룹 |
AB 야생 타입 |
| 머 레이 외. 10 | 3-4 개월 | 3 개월, 6 개월, 1 년 | 7, 10, 및 16 개월 |
사전 및 사후 여과 |
N/A | AB 야생 타입 |
표 1: zebrafish 시설에서 센 티 넬 설정의 비교. 센 티 넬 물고기는 그들의 나이, 성별, 또는 긴장에 따라 선택할 수 있습니다. 그들은 정의 된 기간에 대 한 노출 되 고 그들은 사전 또는 사후 여과 시스템 물 받을. 데이터는 Zebrafish 저널3,,45,6,7,8,9, 의 건강에 특별 한 문제를 2016에서 컴파일됩니다 10.
Discussion
중요 한 단계, 기술의 한계 및 문제 해결:
나이, 성별, 스트레인, 그리고 센 티 넬의 노출의 길이 표준화 되지. 이것은 표 1에 표시 됩니다. 6 개월, 세 물고기의 아래 물고기의 아주 작은 심사가입니다. 일부 병원 체는 이전 인구10,18,,1920에서 더 유행 되는 어린 물고기에 영향을 주는 일부 병원 체를 있을 수 있습니다. 마찬가지로, 성별은21일부 병원 체 대 한 성별 바이어스는 일부 보고서에도 불구 하 고 일부 센 티 넬 그룹의 선택에 고려 되지 않습니다. 긴장의 모니터링 하는 특정 병원 체에 따라 만들 수 있지만 제안 된 기술은 이러한 문제를 해결 하려고 합니다. 예를 들어 너와 진 균 종12,22의 탐지와 도움이 수도 있지만 센 티 넬 저수지 또는 디스플레이 임상 증상 역한 다음 것을 위험이 있다. 노출의 길이 관한 Zebrafish 국제 자료 센터10 의 접근 부족 오염 시간을 놓칠 수 있는 병원 체를 검출 하기 위하여 가능성이 높아집니다. 장기간된 노출에 대 한 필요는 센 티 넬은 쉽게 사용할 수 없습니다 의미 합니다. 환경 샘플의 추가는 일부 유연성과 심사 이벤트의 곱셈 수 있습니다. 예를 들어 샘플링 장소 각 심사 방법 사이 4 개월 간격으로 모든 다른 달 걸릴 수 있습니다. 이 새로 도입된 된 병원 체를 발견 하기 전에 시간의 경과 줄일 수 있습니다.
환경 심사 기법 환경에서 병원 균의 검출에 의존합니다. 병원 균은 물고기에 의해 흘리 고 따라서 시스템 물에 희석. 물 여과23 에 의해 병원 균의 가능성을 탐험 하지 했다. 우리가 설명 하는 방법 병원 체 물고기와 오염 감지를 허용 임계값에 도달 하는 biofilm에서 증식을 충분 한 시간이 주어진 경우만 효과가 있습니다. 기술의이 제한 샘플링 사이트의 중요 한 선택에 의해 극소화 된다: 탱크에 슬러지 기름 통 슬러지 보다 샘플링 되 고 물과 biofilm 기름 통 보다는 탱크 또는 후 여과 표면에서 샘플링 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 같은 시스템에서 모든 샘플 동일한 결과 줄 가능성이 있다. P. tomentosa 에 대 한 긍정적인 결과 다른 분석 결과 (histopathology, PCR, 또는 슬러지 분석)를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 문화 또는 다른 진단 실험실 mycobacterial PCR 긍정적인 결과 확인할 수 있습니다. 그러나, 건강 상태를 설정할 때 추가 샘플은 것이 좋습니다 모든 환경 심사 기법에서 부정적인 결과 확인 하.
기존/대체 방법에 관하여 기술의 중요성:
진 균 종 환경에서 일반적 이며 기름 통에서 그들의 존재는 그들의 pathogenicity12예측 하지 않습니다. Mocho9 사망률을 모니터링 하는 것이 키 건강 문제의 발달을 조사 하는 것을 보여주었다. 동물 예제를 사용 하 여 어떤 수의 조사에 필수적인 남아 있습니다. 시설에서 모든 만연한 병원 균의 검출을 의미 상태 모니터링 하 고이 환경 심사 기법의 단독 사용으로 얻을 수 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 진단 도구의 감도의 부족 수 있습니다 지연 또는 건강 상태에 대 한 정확한 설명. 센 티 넬을 사용 하 여 인구에서 널리 미생물을 검출 하는 데 필요한 물고기의 수를 감소, 하는 동안 감도의 부족 환경 심사5,23를 포함 하 여 방법의 조합을 사용 하 여 무게를 추가 한다. 실제로 특정 병원 체 자유로운 상태는 일반적으로 정의 시설에 한 종족의 부재로 같은 환경 및 동물 샘플 부정적인24,25를 테스트 해야 합니다.
기름 통 면봉 결과 진 균 종 식별 물고기 샘플 허위 부정적인 건강 상태로 이어질 수 있습니다에 의존 하는 보여줍니다. 6 테스트 mycobacterial 종으로 병원 성 설명 또는 달걀 표면 소독 염소26 검역으로 정기적으로 수행 zebrafish15 에 일부 병원 성 잠재력 것 하지 제거. 따라서, 거짓 부정 수입 라인 공동 작업자에 대 한 몇 가지 결과 있을 수 있습니다. 예를 들어 생선 샘플에 PCR에 의해 M. fortuitum 놓친 하지만 기름 통 면봉 PCR의 절반 이상이 감지. 이러한 mycobacteria는 다른 사람 및 물 시스템27에서 성장 하는 능력 보다 염소에 더 강한 고려, 그것은 비 오염 수입 시설에 대 한 위험. 라인의 수입을 허용 하려면 관리자는 신뢰 하 고 그들의 수출 시설의 건강 보고서를 비교할 필요 합니다. 28 ICLAS 성능 평가 프로그램 설치류에 해당 프로세스에 열쇠 이다. RESAMA 네트워크는 프랑스 D. rerio11 M. gordonae 와 M. mucogenicum 의 탐지를 보고합니다. 이러한 Mycobacteria 우리가 사용 하는 상용 실험실의 패널에 제안 하지는. 그것은 ICLAS 프로그램을 확장 하 고 병원 성 종29목록으로 진단 분석 실험 조화에 유용할 것 이다.
A. hydrophila 하더라도 염소30 에 그것의 감수 성을 제거 가능성이 더 일상적인 달걀 표면 소독 중 동물, 가져올 때 소개 될 잠재력을 가진 병원 체 이기도 합니다. 기름 통, 면봉, 및 슬러지 결과 환경 심사가 병원이 체를 검출 하는 데 사용 될 수 표시. 진 균 종 같은 다른 박테리아는 슬러지에 PCR23에 의해 발견 되었습니다. 샘플의이 유형은 이다 특히 관련 창 고 병원 균의 검출 수 있기 때문. 예를 들어 다른 새로운 응용 프로그램 P. tomentosa격리에서 가져온된 물고기 화면을 슬러지 분석 이다. 기생충은 동물의 건강13 및 neoplasia 모델16에 대 한 위협. 또한, 일상적인 zebrafish 달걀 표면 소독에 사용 되는 염소 농도 효율적인31되지 않습니다. 따라서, 가져온된 동물 일주일 회전율 및 어떤 물고기 안락사 없이 화면 수 매우 매력적인 것 같습니다. 이 기술은 수입 심사 함으로써 격리 및 생물 규칙을 좌우할 수 있다. 의사 결정 과정은 다음 수출 시설에서 만연한 병원 균, 가져온된 물고기와 가져오기 시설10의 건강 상태를 손상의 위험에서 샘플에 검출 된 병원 체에 따라 설계 되었습니다.
미래의 응용 프로그램 또는 이러한 기법을 습득 후 방향:
일상적인 격리 치료 옵션을 선택한 경우, 같은 약32,33,34,,3536 의 효능 사육 장치 슬러지 분석 평가 될 수 있다. 더 일반적으로, 환경 심사 박테리아와 기생충에 대 한 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 박멸, 물고기 소 생활권에 포함 한. 환경 심사의 또 다른 틈새 응용 프로그램 라이브에서 병원 체 인구 모니터링 하37,38피드입니다. 비록 이러한 기술의 주요 응용 프로그램 상태 모니터링 zebrafish 시설에 대 한 진단 도구 상자에 귀중 한 추가 이다. 더 정확 하 게, 비용 및 시간 덕분에 건강 상태, 기름 통 면봉 및 슬러지 분석의 효율적인 정의 센 티 넬 감시 및 일상적인 격리 연습을 보완. 사실, 이러한 기술의 미래 수생 실험실 건강 보고서의 일상적인 부분이 될 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그들의 기술 도움말 및 중요 한 프랜시스 크릭 연구소 BRF 수영 팀을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품의 핵심 자금 암 연구 영국 (FC001999), 영국 의학 연구 위원회 (FC001999), 및 Wellcome 트러스트 (FC001999)에서 받는 프랜시스 크릭 연구소에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
| Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
| BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
| Centrifuge tube 15 mL Corning | Corning | 430766 | |
| Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) | Sanyo | MSB020.CX1.5 | |
| Cover Glass 22 mm x22 mm | Menzel-Glaser | MNJ-350-020H | |
| Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap | Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific | F155CA | Swab sediment from sludge |
| 50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap | Corning | 430921 | |
| In-Tank Spawning Tray Set | MBK Installations Ltd |
References
- Schroeder, P., Mocho, J. P. A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare. Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).
- Mason, T., et al. Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility. Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).
- Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).
- Borges, A. C., et al. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).
- Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).
- Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).
- Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories. Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).
- Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research. Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).
- Mocho, J. -P. Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).
- Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).
- Legendre, L., et al. RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).
- Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).
- Murray, K. N., Peterson, T. S. Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish. J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).
- Foreyt, W. J. Veterinary Parasitology Reference Manual. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).
- Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R.
- Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies. Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).
- Moravec, F. Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873). Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).
- Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction. Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).
- Watral, V., Kent, M. L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).
- Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities. FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).
- Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan). J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).
- Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).
- Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).
- Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).
- Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).
- Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).
- Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).
- Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. First trial in the developmental phase of the "performance evaluation program" based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS. Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).
- Nogueira, C. L., et al. Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).
- Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains. J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).
- Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs. J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).
- Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes. Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).
- Samaee, S. M. Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).
- Collymore, C., et al. Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).
- Chang, C. T., Whipps, C. M. Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish. Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).
- Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. , (2017).
- Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).
- Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).
