Summary
Det här protokollet beskriver användningen av sumpen kompresser och slam analys av zebrafisk system, vilket leder till ökad upptäckt jämfört enda användning av vaktposter att upptäcka patogener såsom Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. och Pseudocapillaria tomentosa. Ett system för att övervaka P. tomentosa ägg i karantän föreslås också.
Abstract
Hälsa system utvecklas och används i zebrafiskar forskningsanläggningar eftersom patogener av Danio rerio såsom Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. och Pseudocapillaria tomentosa har potential att försämra djurens välbefinnande och forskning. Fisken är vanligtvis analyseras efter slakt att upptäcka mikrober. Användningen av GMES-satelliterna är föreslagna sätt att förbättra känsligheten för övervakning och att minska antalet djur att prova. Inställningen av en pre-filtrering sentinel tank ur ett recirkulerande system beskrivs. Tekniken är utvecklad att förhindra vattenförorening och att representera fiskpopulationen genom ett noggrant urval av ålder, kön och stammar. För att kunna använda det minsta antalet djur, är tekniker att skärmen miljön också detaljerade. Polymerase Chain Reaction (PCR) på ytan sump kompresser används för att avsevärt förbättra upptäckten av vissa utbrett och patogena mykobakteriella arter såsom Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumoch Mycobacterium chelonae. En annan miljömässig metod består av behandlingen av slammet på botten av en uppsamlingstank eller sumpen att leta efter P. tomentosa ägg. Detta är en billig och snabb teknik som kan tillämpas i karantän där en avel enhet är nedsänkt i uppsamlingstank importerade djur. Slutligen, PCR tillämpas slam provet och A. hydrophila upptäcks vid sumpens botten och ytan. Generellt, dessa miljögranskning tekniker tillämpas på dessa specifika patogener har lett till ökad känslighet jämfört med testning av pre-filtrering vaktposter.
Introduction
För att skydda forskning och djurskydd1,2, övervakas förekomsten av patogener inom djur faciliteter. När det gäller zebrafiskar,3,4,5,6,7,8,9,10,11 för hälsoövervakning ofta förlitar sig på djur analyseras efter slakt av histopatologi, bakteriologi kultur eller molekylära metoder. Testning endast kolonin djur är inte metoden som rekommenderas på grund av antalet fisk och relaterade kostnader som skulle krävas för att upptäcka patogener av låg prevalens. Därför är den rekommenderade metoden att avslöja en liten grupp av djur till en högre belastning av föroreningar. Dessa fiskar kallas pre-filtrering vaktposter. Denna exponering varar i månader och det innebär en ökning av den animaliska CARERs arbetsbelastning och/eller vissa specialbyggda teknisk lösning. En annan utmaning är screening av importerade raderna i karantän där de fertila djur skall hållas vid liv och detta är inte förenligt med rutinmässiga analyser på slaktkroppar.
Här beskriver vi några metoder för att upptäcka vissa zebrafiskar patogener (A. hydrophila, Mycobacterium spp. och P. tomentosa) genom screening systemets akvatiska miljön. Syftet är att minska antalet fiskar som används för övervakning av hälsotillstånd och att optimera omsättning, kostnad och känsligheten för upptäckt. Sådana metoder är ett alternativ till användning av djur och vissa tekniker kan användas för screening import i karantän. Till exempel Mocho9 kunde identifiera fler patogena mykobakteriella arter genom att utföra PCR på sumpen kompresser snarare än på zebrafisk (inklusive sentinels), och detta erhölls med färre prover. I det samma studie, P. tomentosa ägg upptäcktes med mer känslighet av screening tank slammet med flotation och mikroskopi snarare än testning fisk av PCR och histopatologi.
Tabell 1 sammanfattar de olika egenskaperna hos sentinel program3,4,5,6,7,8,9,10 används av ett antal zebrafiskar faciliteter. Efter filtrering vaktposter får vatten på samma sätt som någon koloni fisk medan pre-filtrering vaktposter få vatten när det har cirkulerat genom kolonin fisketankar först. Till exempel kan pre-filtrering vaktposter ställas in på recirkulerande system genom att kontinuerligt få sump vatten. Detta kan inte vara ett alternativ när det finns många oberoende system i ett rum. I det här fallet kan en tank av pre-filtrering vaktposter användas till skärmen hela rummet. Sentinels är en statisk tank, ur recirkulerande system, och deras vatten byts regelbundet, använder bara pre-filtrering vatten dvssump vatten från alla system i rummet. Denna teknik beskrivs nedan som en originalplan för jämförelse med effekten av miljögranskning. Den föreslagna strukturen är utformad för att styra vatten kvalitetsfrågor som en minskning av pH eller ett kväve föroreningar.
Begreppet den bakteriella miljögranskning bygger på hypotesen att bakterier kan påvisas i biofilm som hittade på sumpen väggen vid vattenytan eller i slammet på botten av en tank. Sumpen verkar en idealisk provtagningspunkt i en recirkulerande vattenbruk-systemet eftersom den samlar in avfall (vatten, avföring, foder och annat organiskt material) från alla tankar pre-filtrering. Ytan av sumpen är ofta lätt att nå, de badda är snabb och det kan utföras aseptiskt för att undvika korskontaminering av provet (från handskar till exempel). Begreppet används för att identifiera vanliga patogena Mycobacterium spp. i zebrafiskar system9,12. Tekniken beskrivs nedan och redovisar vi också upptäckt av A. hydrophila i zebrafiskar sumpen ytbehandlar kompresser och slam.
Miljömässiga screening för parasit ägg bygger på detektion av Murray et al. 13 och flotation tekniken används rutinmässigt för parasitologi och mikroskopiska screening av parasiten ägg i feces14. Mocho9 föreslagit ett alternativ till provtagning processen och visade att tekniken kunde användas för att upptäcka andra arter av fisk biotopen. Infekterade D. rerio passera P. tomentosa ägg med deras avföring och parasit äggen kvar på botten av tanken, i slammet. De kan samlas där på grund av deras densitet större än vatten. Tätheten av äggen används för att behandla miljömässiga provet också. En första flotation med centrifugering avskiljer vatten och ljus skräp från tyngre fråga. En andra centrifugering bygger på mättad sockerlösning (med en densitet större än tätheten av P. tomentosa ägg) för att möjliggöra parasit äggen att dyka upp på ytan av röret.
Screening för bakterier i biofilmen och P. tomentosa från botten av tanken kan kombineras genom att utföra PCR för alla dessa patogener på slam prov sedimenten erhålls efter den första centrifugeringen. Detta optimerar provtagningstiden. Metoden beskrivs nedan. Vi föreslår också att använda dessa tekniker i en karantän sammanhang. Skärm importerade vuxen zebrafiskar som behöver hållas vid liv, sätts en avel enhet till karantän tank. Efter en vecka, avföring och annat avfall i avel enheten hämtas och säkerhetskontrolleras med mikroskopi eller PCR. Tekniken beskrivs nedan och vissa P. tomentosa ägg upptäcktes av mikroskopi i detta sammanhang.
Protocol
1. exponering av pre-filtrering Sentinels ur ett recirkulerande System
-
Ange en ren 8 L tank ur ett recirkulerande system. Fyll upp det med vatten som kommer från sumpsna. Lägg till 2 keramiska pärlor eller svamp kuber av bio-media från system till skärm (figur 1). Lägg till 1-2 D.rerio/l (dvs., 12 fisk). Använda vildtyp fisk av den dominerande genetiska bakgrunden i anläggningen, till exempel AB.
- Välj minst 6 fisk enligt följande: minst en hona och en hane under 6 månaders ålder, en hona och en hane mellan 6 och 18 månader, och en hona och en hane över 18 månaders ålder.
-
Matar en gång om dagen. Variera kosten (t.ex., torr kost, Artemia) kontrollera sentinels utsätts för alla de dieter som används i anläggningen zebrafiskar. Byta vatten på måndag, onsdag och fredag, dvstre gånger i veckan i 4 månader.
- För att genomföra att byta vatten, överför vaktposter och bio-media till en tillfällig tank. Tömma helt sentinel tanken och rengör. Refill sentinel tanken med sump vatten bara. Sätta tillbaka vaktposter och bio-media.
- Exponera sentinels i 4 månader till sump vatten. Avliva fisken med en godkänd metod såsom nedsänkning i en överdos lösning av 2-fenoxietanol (3 mL/L).
-
För att bekräfta död, vänta 10 min efter avslutad opercula rörlighet.
- Greppa cadaver med pincett och frysa det helt vid-80 ° C i en identifierade behållare. Detta kommer att användas för PCR-12,15.
- Alternativt skär tailat den kaudala stjälk, nick bukväggen och ange i 4% formalin.
FÖRSIKTIGHET: Använd handskar och fume skåp för histopatologi. Etikett provbehållaren.
2. sump kompresser
- Använd en steril torr med en plast skaft. Använd handskar. Leta upp ytan till pinnen (sump vägg på ytan av vattnet) och ta bort eventuella objekt som hindrar enkel tillgång till ytan. Välj en sump yta med lågt flöde.
-
Blottar pinnen genom att ta bort den yttre förpackningen och exponera sterila bomull spets i luften. Undvik korskontamination mellan pinnen genom noga med att inte röra otestade ytor.
- Svabba sump väggen över 5-10 cm att absorbera vatten och biofilm på sump vatten ytan nivå.
- Skidan pinnen tillbaka eller bryta spets i ett sterilt centrifugrör. Märk provet och skicka för PCR-test eller frysa vid-80 ° C.
3. Påvisande av P. tomentosa ägg längst ned i en Tank
-
Slammet analys av mikroskopi
- Använd en 60 mL spruta9 för att aspirera slammet på botten av en sump eller någon tank som håller fisk inklusive vaktposter. Dela in provet i 15 mL rör. Stäng rören med sin skruv toppar och märka rören.
- Förbereda den mättad sockerlösningen (specifik vikt = 1,27) genom att blanda 227 g strösocker i 177 mL hett vatten med en magnetisk omrörare14.
- Centrifugera 15 mL tuberna vid 175-250 x g i 10 min i en centrifug med swing hinkar. Häll upp rören och hålla sedimenten i sin tub.
- Fyll upp rören halvvägs med den mättad sockerlösningen. Stäng rören med deras skruvlock och grundligt blanda sediment med lösningen.
- Placera rören i centrifug swing hinkar och fylla dem med mättad sockerlösning till toppen. Ange en skyddsglaset försiktigt ovanpå varje rör och i kontakt med den mättad sockerlösningen.
- Centrifugera vid 175-250 x g i 10 min. Observera att vissa skyddsglaset kan falla och bryta under centrifugeringen därav det är 4 rör för varje 60 mL prov. Lyft täckglaset och ställ den på en glasskiva. Märk bilden med en penna eller märkpenna penna.
- Alltför många skyddsglaset brytskador inträffar, fylla upp större delen av röret med den mättad sockerlösningen, Centrifugera vid 175-250 x g under 10 minuter, fylla upp till toppen med den mättad sockerlösningen och sedan försiktigt ställa skyddsglaset. Vänta i 30 min.
- Leta efter P. tomentosa äggen med mikroskopet13 (figur 2 och Video 1). Identifiera bipolär pluggarna på förstoring 400 X6.
Obs: Storleken på äggen är 57-78 µm lång och 27-39 µm diameter16,17. Observera att en positiv bild är nog för 60 mL provet anses vara positiva.
-
Screening importerat djur i karantän för P. tomentosa ägg
- Som manliga och kvinnliga D. rerio i en tank. Lägg till tank en enhet som normalt används för att skörda och bevara lekt ägg men använder det här att samla avföring (figur 3).
Obs: till exempel en full 1 L avel tank (yttre tank och inre tank med riven botten) är helt nedsänkt i en 13 L tank, tillåter fri tillgång för fisken att flytta in och ut ur avel enheten. - Ta bort avel enheten efter en vecka och skörda det insamlade slammet i avel enheten enligt beskrivningen i steg 3.1 ”slam till analys av mikroskopi”.
- Som manliga och kvinnliga D. rerio i en tank. Lägg till tank en enhet som normalt används för att skörda och bevara lekt ägg men använder det här att samla avföring (figur 3).
4. PCR på slam Sediment
- Aspirera slammet längst ned i en tank eller sump med en 60 mL spruta9 och överför provet till en 60 mL tub. Nära röret med dess skruvlock och Märk röret. Kassera sprutan.
- Skaka tuben 60 mL och överför 15 mL till en 15 mL tub. Nära röret med dess skruvlock och Märk röret.
- Centrifugera 15 mL röret vid 175-250 x g i 10 min i en centrifug med swing hinkar. Häll upp rören och hålla sedimenten i röret.
-
Blottar en kompress genom att ta bort den yttre förpackningen och exponera sterila bomull spets i luften. Undvik korskontamination mellan pinnen genom noga med att inte röra otestade ytor.
- Svabba sedimenten i röret för 15 s.
- Skidan pinnen tillbaka eller bryta spets i ett sterilt centrifugrör. Märk provet, fryser vid-80 ° C och skicka för PCR-test.
Obs: 45 mL kvar i 60 mL röret. Detta kan hållas för detektion av P. tomentosa ägg av slam analys genom mikroskopi som beskrivs i steg 3.1, till exempel för att bekräfta den PCR resultatet. PCR i slammet kan dömas för screening importerade djur följande steg 3,2.
Representative Results
Fördelarna med de sump kompresser att identifiera förhärskande Mycobacterium spp. jämfört med fisk prover stöds av resultaten i figur 4. Av 115 fisk testas, upptäcktes M. chelonae och M. haemophilum i 5% och 3% av proverna, respektive. Inga andra patogena mykobakteriella arter identifierades. Från samma system visade 49 sump kompresser förekomst av 5 mykobakteriella arter. Oddskvot beräknas med hypotesen att M. chelonae och M. fortuitum upptäcks oftare med PCR i de ytan sump kompresser än i fisk provet. Detta är statistiskt signifikant med respektive odds ratio 11 (95% CI: 4 – 29; p < 0,0001) och 306 (95% CI: 18 till 5208; p = 0,0001). Resultaten visar att den ytan sump svabbprov är ett värdefullt alternativ till enda användning av vaktposter till skärmen zebrafiskar anläggningen för Mycobacterium spp. De miljömässiga proverna användes också till skärmen för A. hydrophila. Dessa bakterier upptäcktes i fisk, slam och ytprover (figur 4). Detta stöder också de föreslagna teknikerna förmåga att skärmen fisk biotopen.
Om slam analysen att upptäcka P. tomentosa ägg, upptäckt Mocho9 parasiten i 27% av fisk proverna med PCR och histopatologi medan äggen upptäcktes hos 93% av analyserade slam från samma system. Här, ifrågasattes tekniken att återskapa karantän screening. I detta sammanhang inte importerade djur provtas, och bedöma deras hälsostatus i tid hjälper till med biosäkerhet förvaltningen. Fisk med okänd hälsostatus från en P. tomentosa positiv anläggning sattes i 8 tankar med avel enheter: maximalt 16 fisk/13 L tank, 7 transgena och 1 wild linjetyp, blandade kön, åldrarna 4-24 månader. Slammet var skördas från enheter efter en vecka och analyseras av mikroskopi. P. tomentosa ägg sågs i 7 (88%) prover. PCR-detektion av parasiten var slutligen trialed på sumpen kompresser och slam sediment. 4 av 6 slam prover var PCR-positiva och alla resultat var negativa för de ytan kompresser. Detta är inte förvånande eftersom slam screening bygger på förmågan av äggen falla till botten av tanken. Detta visar att slam analys teknikerna kan användas att skärmen D. rerio akvarier för P. tomentosa infestation och att metoderna kan anpassas för screening av importerade djur.
Figur 1: pre-filtrering sentinel tank ur recirkulerande system. En 8 L tank fylls upp med vatten och bio-media från sumpsna av systemen till skärmen. Två vita keramiska bio-media pärlorna sitter längst ner i tanken (i mitten av bilden). 12 fiskar är utvalda enligt deras ålder, stam och kön, och de läggs till sentinel tank. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: P. tomentosa ägg upptäckts under slam analys av mikroskopi. Förstoring som används var 400 X. Pilarna anger bipolär pluggarna. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: avel enhet nedsänkt i ett akvarium anläggning att samla slam för analys. Denna tank är inställd på en bänk i syfte att på bilden; Det ligger annars i recirkulerande system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Procent av identifiering av Mycobacterium spp., A. hydrophilaoch P. tomentosa med PCR på fisk, surface sump kompresser och sump slam. Procent erhålls genom att dividera antalet positiva resultat för varje patogen art med antalet testade prover. Andelen positiva resultat ges av provtyp som fisk, yta eller slam, och anges efter bakteriens namn. 115 fisk och 49 ytan sump kompresser testades med PCR för identifiering av Mycobacterium spp. Uppgifterna sammanställs med Mocho's9 resultat eftersom det är en förlängning av denna studie. Fisken är främst pre-filtrering vaktposter enligt protokoll avsnitt 1. Sällan, när vaktposter inte var tillgänglig, rymlingar och gamla kolonin fisk (> 18 månader) var provtas. Alla testade system för Mycobacterium spp. testades på fisk och sump kompresser. Oddskvot beräknas med hypotesen att M. chelonae och M. fortuitum upptäcks oftare med PCR i de ytan sump kompresser än i fisk provet. Detta är statistiskt signifikant med respektive odds ratio 11 (95% CI: 4 – 29; p < 0,0001) och 306 (95% CI: 18 till 5208; p = 0,0001). Mycobacterium marinum PCR var negativ för alla prover och det är därför anses frånvarande från dessa anläggningar och inte ingår i analysen. 12 fiskar, 14 ytan sump kompresser och 6 sump slam testades med PCR för förekomsten av A. hydrophila. 6 sumps testades för förekomsten av P. tomentosa på ytan och i slammet. PCR = Polymerase Chain Reaction. CI = konfidensintervall. * och ** indikerar statistisk signifikans; andra jämförelser var inte statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Scanning för ett ägg av P. tomentosa med mikroskopet. Bilden erhålls från slam analys som beskrivs i steg 3.1. Fältet är skannas för att upptäcka ett ägg av P. tomentosa. När en struktur känns igen, är det inzoomad för att bekräfta identifieringen med högre upplösning. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
| Författarna | Ålder i början av exponering | Längden på exponering | Provtagning ålder | Pre eller Post filtrering |
Kön | Nomenklaturkod |
| Barton et al. 3 | 4 månader | 6 månader | 10 månader | Pre-filtrering | EJ TILLÄMPLIGT | EJ TILLÄMPLIGT |
| Borges et al. 4 | 6 månader | 6 månader | 12 månader | Pre-filtrering | EJ TILLÄMPLIGT | AB vildtyp |
| Collymore o.a. 5 | Så unga som möjligt | 3 månader | < 6 månader | Pre-filtrering | EJ TILLÄMPLIGT | EJ TILLÄMPLIGT |
| Geisler o.a. 6 | 4 månader | 4 månader | 8 månader | Pre och post filtrering |
EJ TILLÄMPLIGT | AB vildtyp |
| LiU et al. 7 | 3 månader | 1-6 månader | 4-9 månader | Pre och post filtrering |
EJ TILLÄMPLIGT | Vildtyp |
| Martins et al. 8 | 3 månader | 3 månader | 6 månader | Pre-filtrering | EJ TILLÄMPLIGT | Vildtyp |
| Mocho9 | < 6 månader, 6 - 12 månader, > 18 månader |
4 månader | 7 - 24 månader | Pre-filtrering | 1 hona och 1 hane av varje åldersgrupp |
AB vildtyp |
| Murray et al. 10 | 3-4 månader | 3 månader, 6 månader, 1 år | 7, 10 och 16 månader |
Pre och post filtrering |
EJ TILLÄMPLIGT | AB vildtyp |
Tabell 1: jämförelse av sentinel inställningar i zebrafiskar faciliteter. Sentinel fisken kan väljas enligt deras ålder, kön eller stam. De utsätts för en definierad period och de får före eller efter filtrering system vatten. Uppgifterna sammanställts från de 2016 specialnummer om hälsa av zebrafisk journal3,4,5,6,7,8,9, 10.
Discussion
Begränsningar av tekniker, kritiska moment, och felsökning:
Ålder, kön, stam och längden på exponering av sentinels är inte standardiserade. Detta visas i tabell 1. Det finns mycket lite screening av fisk under 6 månaders ålder eller äldre fisk. Det kan finnas vissa patogener som påverkar unga fisken som det finns vissa patogener som är vanligare hos äldre befolkning10,18,19,20. Likaså anses inte kön i valet av vissa sentinel grupper trots vissa rapport att det finns en könsfördomar för vissa patogener21. Den föreslagna tekniken försöker lösa problemen, även om valet av stammen kunde göras enligt en specifik patogen att övervaka. Till exempel TU kunde hjälpa med påvisande av Mycobacterium spp.12,22, men det finns en risk att sentinels skulle då fungera som en reservoar eller display kliniska tecken. Angående längden på exponering ökar metoden med zebrafiskar International Resource Center10 chanserna att upptäcka patogener som kan missas med en otillräcklig kontaminering period. Behovet av långvarig exponering innebär att vaktposter inte är lätt tillgängliga. Tillägg av miljöprover tillåter viss flexibilitet och multiplikation av screening händelser. Till exempel kan provtagning ske varannan månad med 4 månaders intervall mellan varje screeningmetod. Detta kan minska den tid som förflutit innan nyinförda patogener upptäcks.
Miljögranskning tekniker är beroende av patogener i miljön. Patogener är skjul av fisken och därför utspätt i systemets vatten. Var inte att undersöka möjligheten att fånga patogenerna av vattenfiltrering23 . De metoder som vi beskriver är bara effektiva om patogener ges tillräckligt med tid att föröka sig i fisk och biofilm att nå ett tröskelvärde för kontaminering som möjliggör identifiering. Denna begränsning av tekniker minimeras genom ett kritiskt urval av provtagningspunkterna: slammet i tanken samplas snarare än sump slammet och vattnet och biofilm provtas på ytan av sumpen i stället för i en tank eller efter filtrering. Alla prover från samma system finns dock osannolikt att ge samma resultat. Positiva resultat för P. tomentosa kan bekräftas med hjälp av en annan analys (histopatologi, PCR eller slam analys). Mykobakteriella PCR-positiva resultat kan bekräftas av kultur eller ett annat diagnostiskt laboratorium. Men, när du upprättar en hälsostatus, ytterligare prover rekommenderas att bekräfta negativa resultat från någon miljösållning teknik.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga/alternativa metoder:
Mycobacterium spp. är vanliga i miljön och deras närvaro i sumpen förutsäga inte deras patogenicitet12. Mocho9 visade att övervakning dödligheten är nyckeln att kartlägga utvecklingen av hälsofrågor. Användningen av animaliskt prover fortfarande viktigt att veterinärmedicinska undersökningar. Hälsoövervakning innebär alla förekommande patogener i en anläggning och detta kan inte uppnås med enbart användning av miljögranskning tekniker. Dock kan en brist på känslighet av diagnos verktyg fördröja eller förhindra en korrekt beskrivning av hälsoläget. Medan användningen av vaktposter minskar antalet fiskar som krävs för att upptäcka en förhärskande mikrob i befolkningen, avsaknaden av känslighet lägger till vikt genom en kombination av metoder, inklusive miljögranskning5,23. Verkligen definieras specifik patogen fri status brukar som avsaknad av en art i anläggningen så att miljön och djurs prover måste testa negativa24,25.
Sumpen provstickan resultaten att identifiera Mycobacterium spp. visar att förlita sig på fisk prover kan leda till ett falskt negativa hälsotillstånd. De 6 testa mykobakteriella arterna beskrivs som patogena eller potentiella patogena zebrafiskar15 och några vill inte elimineras genom ägg ytdesinfektion med klor26 som rutinmässigt utförs i karantän. Därför, den falska negationen kanske vissa konsekvenser för medarbetare som importerar rader. Till exempel M. fortuitum missades av PCR på fisk prov men mer än hälften av sumpen pinnen PCR upptäckt den. Med tanke på att dessa mykobakterier är mer resistenta mot klor än andra och deras förmåga att växa i vattensystem27, är det en risk för icke-kontaminerade importerande anläggningen. Import av linjer måste chefer kunna, lita och jämföra exporterande anläggningen med deras hälsa rapporter. ICLAS prestanda utvärdering Program28 är nyckeln till det processen i gnagare. RESAMA nätverket rapporterar upptäckt av M. gordonae och M. mucogenicum i franska D. rerio11. Dessa mykobakterier föreslås inte i panelerna av kommersiella laboratorier som vi använder. Det skulle vara nyttigt att förlänga programmet ICLAS och att harmonisera de diagnostiska analyserna samt listan över patogena arterna29.
A. hydrophila är också en patogen som har potential att införas när du importerar djur, även om dess känslighet för klor30 gör dess eliminering mer troligt under rutinmässig ägg ytdesinfektion. Den sump, pinnen och slam resultat visar att miljögranskning kan användas för att upptäcka denna patogen. Andra bakterier som Mycobacterium spp. har upptäckts i slammet av PCR-23. Denna typ av prov är särskilt relevant eftersom det tillåter skjul patogener. En annan ny ansökan är exempelvis slam analysen till skärmen importerad fisk i karantän för P. tomentosa. Parasiten är ett hot mot djurets hälsa13 och neoplasi modeller16. Dessutom är klor koncentrationer används i rutinmässiga zebrafiskar ägg ytdesinfektion inte effektiv31. Förmågan att skärmen de importerade djuren med en veckas omsättning och utan någon fisk dödshjälp förefaller därför mycket attraktiv. Denna teknik kan påverka karantän och biosäkerhet reglerna genom att låta en triage av importen. En beslutsprocess är sedan utformade enligt de förhärskande patogenerna i exporterande anläggningen, de upptäckta patogenerna i proverna från importerade fisken och risken för att äventyra hälsostatusen hos den importerande anläggning10.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter bemästra dessa tekniker:
Även om rutinmässiga karantän behandling är det valda alternativet, kan effekten av sådan medicinering32,33,34,35,36 bedömas med avel enhet slam analysen. Mer allmänt miljögranskning kunde användas för att testa föreningar mot bakterier och parasiter utrotning, bland annat i fisk biotopen. En annan nisch tillämpning av miljömässiga screening är att övervaka patogen befolkningen i live feed37,38. Den huvudsakliga tillämpningen av dessa tekniker är dock som ett värdefullt tillskott till diagnos verktygslådan för hälsoövervakning i zebrafiskar faciliteter. Tack vare en mer exakt, kostnad och tid effektiv definition av hälsostatus, sump kompresser och slam analys är komplement till sentinelövervakning och den rutinmässiga karantän praxisen. Framtiden för dessa tekniker är faktiskt att vara en rutinmässig del av någon vattenlevande laboratorierapport hälsa.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka BRF simsport laget av Francis Crick Institute for deras teknisk hjälp och kritiska input. Detta arbete stöds av Francis Crick Institute som mottar dess basfinansiering från Cancer Research UK (FC001999), brittiska Medicinska forskningsrådet (FC001999) och Wellcome Trust (FC001999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
| Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
| BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
| Centrifuge tube 15 mL Corning | Corning | 430766 | |
| Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) | Sanyo | MSB020.CX1.5 | |
| Cover Glass 22 mm x22 mm | Menzel-Glaser | MNJ-350-020H | |
| Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap | Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific | F155CA | Swab sediment from sludge |
| 50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap | Corning | 430921 | |
| In-Tank Spawning Tray Set | MBK Installations Ltd |
References
- Schroeder, P., Mocho, J. P. A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare. Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).
- Mason, T., et al. Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility. Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).
- Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).
- Borges, A. C., et al. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).
- Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).
- Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).
- Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories. Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).
- Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research. Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).
- Mocho, J. -P. Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).
- Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).
- Legendre, L., et al. RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).
- Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).
- Murray, K. N., Peterson, T. S. Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish. J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).
- Foreyt, W. J. Veterinary Parasitology Reference Manual. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).
- Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R.
- Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies. Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).
- Moravec, F. Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873). Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).
- Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction. Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).
- Watral, V., Kent, M. L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).
- Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities. FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).
- Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan). J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).
- Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).
- Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).
- Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).
- Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).
- Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).
- Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).
- Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. First trial in the developmental phase of the "performance evaluation program" based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS. Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).
- Nogueira, C. L., et al. Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).
- Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains. J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).
- Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs. J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).
- Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes. Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).
- Samaee, S. M. Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).
- Collymore, C., et al. Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).
- Chang, C. T., Whipps, C. M. Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish. Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).
- Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. , (2017).
- Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).
- Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).
