Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Miljøtester Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa i sebrafisk systemer

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/55306
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biological Research Facility, The Francis Crick Institute

Summary

Denne protokollen beskriver bruk av sump vattpinner og slam analyse av sebrafisk systemer, som fører til økt oppdagelsen forhold til eget bruk av voktere å oppdage patogener som Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa. Et system for å overvåke P. tomentosa egg i karantene er foreslått.

Abstract

Helse overvåking systemer er utviklet og brukt i sebrafisk forskningsanlegg fordi patogener i Danio rerio som Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa har potensial til å svekke dyrevelferd og forskning. Fisken er vanligvis analysert post mortem å oppdage mikrober. Bruk av voktere er en foreslått måte å forbedre følsomheten til overvåking og redusere antall dyr å prøve. Innstillingen for en pre filtrering sentinel tank av et resirkulerende system er beskrevet. Teknikken er utviklet til å hindre vannforurensning og representerer fiskebestanden av valget av alder, kjønn og stammer. Bruke minimum antall dyr, er teknikker til skjermen miljøet også detaljert. Polymerase kjedereaksjon (PCR) på overflaten sump vattpinner brukes til å forbedre gjenkjenning av enkelte utbredte og sykdomsfremkallende mycobacterial arter som Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumog Mycobacterium chelonae. En annen miljømessig metoden består av behandling slam på bunnen av en holder tank eller sump å lete etter P. tomentosa egg. Dette er en billig og rask teknikk som kan brukes i karantene der en avl enhet er neddykket i holde tanken importert dyr. Endelig PCR gjelder slam prøven og A. hydrophila er oppdaget på bunnpannens bunnen og overflate. Vanligvis har disse miljøtester teknikkene til disse bestemte patogener ført til en økt følsomhet sammenlignet med testing av pre filtrering voktere.

Introduction

For å beskytte forskning og dyrevelferd1,2, overvåkes tilstedeværelse av patogener i dyr fasiliteter. Ved sebrafisk, sunnhet avlytting3,4,5,6,7,8,9,10,11 ofte avhengig av dyr analysert post mortem av histopatologi, bakteriell kultur eller genetiske metoder. Testing bare kolonien dyr er ikke den anbefalte metoden på grunn av fisk og relaterte kostnader som kreves for å oppdage patogener lav prevalens. Derfor, den foretrukne metoden er å eksponere en liten gruppe dyr til en større belastning av miljøgifter. Disse fiskene kalles pre filtrering voktere. Denne eksponeringen varer i måneder, og det innebærer en økning i dyr pleierens arbeidsmengde og/eller noen spesialbygde engineering løsning. En annen utfordring er screening av importerte linjene i karantene der fruktbare dyrene er holdes i live og dette er ikke kompatibel med rutinemessig analyser på skrotter.

Her beskriver vi noen metoder for å oppdage bestemte sebrafisk patogener (A. hydrophila, Mycobacterium spp. og P. tomentosa) av screening akvatiske systemets miljø. Målet er å redusere antall fisk brukes for helseovervåking og optimalisere omsetning, kostnad og følsomhet for gjenkjenning. Slike metoder er et alternativ til bruk av dyr og noen teknikker kan brukes til screening import i karantene. For eksempel Mocho9 klarte å identifisere flere sykdomsfremkallende mycobacterial arter ved å utføre PCR på sump vattpinner ikke på sebrafisk (inkludert voktere), og dette ble oppnådd med færre prøver. I den samme studien, P. tomentosa egg ble oppdaget med mer følsomhet av screening tank slam flotasjon og mikroskopi i stedet for å teste fisken PCR og histopatologi.

Tabell 1 oppsummerer de forskjellige egenskapene til sentinel programmer3,4,5,6,7,8,9,10 brukes av en rekke sebrafisk fasiliteter. Etter filtrering voktere får vann på samme måte som noen kolonien fisk mens pre filtrering voktere motta vann når det har sirkulert gjennom kolonien akvarier først. For eksempel kan pre filtrering voktere defineres på resirkulerende systemet ved å motta kontinuerlig sump vann. Dette kan ikke være et alternativ når det er mange uavhengige systemer i ett rom. I dette tilfellet kan en tank av pre filtrering voktere brukes til skjermen hele rommet. Skiltvaktene er i en statisk tank, av resirkulerende systemet, vann endres regelmessig, med bare pre filtrering vann dvssump vann fra alle systemene i rommet. Denne teknikken er beskrevet nedenfor som en baseline for sammenligning med effekten av miljømessige screening. Det foreslåtte oppsettet er utformet for å kontrollere problemer med vannkvaliteten som en nedgang på pH eller en Nitrogenforurensningen.

Begrepet den bakterielle miljøtester avhengig hypotesen at bakterier er synlig i biofilm som man finner på sump veggen på vannflaten eller slam nederst i en tank. Bunnpannen synes en ideell prøvepunkt i et resirkulerende akvakultur system siden samler avfall (vann, avføring, fôr og annet organisk materiale) fra alle tanker før filtrering. Overflaten av bunnpannen er ofte lett tilgjengelig, det swabbing er rask og kan utføres tas aseptisk for å unngå kryss-kontaminering av prøven (fra hansker for eksempel). Begrepet brukes til å identifisere utbredt patogene Mycobacterium spp. sebrafisk systemer9,12. Teknikken er beskrevet nedenfor og vi rapporterer også påvisning av A. hydrophila i sebrafisk sump overflaten vattpinner og slam.

Miljøtester for parasitt egg er basert på oppdagelsen av Murray et al. 13 og flotasjon teknikken brukes rutinemessig for parasittologi og mikroskopiske screening av parasitt egg i avføring14. Mocho9 foreslått et alternativ til prøvetaking prosessen og viste at teknikken kan brukes til å oppdage andre arter av fisk naturtypen. Infiserte D. rerio passerer P. tomentosa egg med deres avføring og parasitten eggene blir værende på bunnen av tanken, i slam. De kan være samlet det på grunn av tetthet deres større enn vann. Tettheten av eggene brukes til å behandle miljømessige prøven også. Første Kjør med sentrifugering skiller vannet og lys rusk fra tyngre saken. En andre sentrifugering er avhengig av mettet sukkeroppløsning (med en tetthet som er større enn tettheten av P. tomentosa egg) for å tillate parasitt egg å komme på overflaten av røret.

Screening for bakterier i biofilm og P. tomentosa fra bunnen av tanken kan kombineres ved å utføre PCR for alle disse patogener på slam eksempel sediment innhentet etter den første sentrifugering. Dette optimaliserer prøvetidspunkt. Metoden som er beskrevet nedenfor. Vi foreslår også å bruke disse teknikkene i karantene sammenheng. Til skjermen importerte voksen sebrafisk som må holdes i live, settes en avl enhet til karantene tanken. Etter en uke, er avføring og annet avfall i avl enheten samlet og vist av mikroskopi eller PCR. Teknikken er beskrevet nedenfor og noen P. tomentosa egg ble oppdaget av mikroskopi i denne sammenheng.

Protocol

1. eksponering for pre filtrering Sentinels av et resirkulerende System

  1. Angi en ren 8 L tank av et resirkulerende system. Fylle den med vann som kommer fra sumps. Legg 2 keramiske perler eller svamp kuber av bio-media fra systemer til skjermen (figur 1). Legge til 1-2 D. reriol (dvs., 12 fisk). Bruke wild type fisk av dominerende genetisk bakgrunn i anlegget, for eksempel AB.
    1. Velg minst 6 fisk som følger: minst en kvinne og en mann under 6 måneder, en kvinne og en mann mellom 6 og 18 måneder, og en kvinne og en mann over 18 måneder av alderen.
  2. Mate en gang om dagen. Variere dietter (f.eks, diett, brine reker) å sikre sentinels er utsatt for alle dietter i sebrafisk anlegget. Endre vannet på mandag, onsdag og fredag, dvstre ganger i uken for 4 måneder.
    1. For å oppførsel vann endre, overføre voktere og bio-media i en midlertidig tank. Tømme fullstendig sentinel tanken og rense den. Fylle på sentinel tanken med sump vann. Sette voktere og bio-media tilbake.
  3. Utsett sentinels for 4 måneder til sump vann. Euthanize fisken med en godkjent metode for eksempel nedsenking i en overdose av 2-phenoxyethanol (3 mL/L).
  4. Bekreft død ved å vente 10 min etter opphør av opercula bevegelse.
    1. Grip cadaver med tang og fryse det helt på-80 ° C i en identifisert beholder. Dette brukes for PCR12,15.
    2. Alternativt kutte tailat caudal peduncle, nick bukveggen og satt i 4% formalin.
      FORSIKTIG: Bruk hansker og fume skap for histopatologi. Etiketten beholderen prøven.

2. sump vattpinner

  1. Bruk en steril tørr vattpinne med en plast aksel. Bruk hansker. Finn overflaten til vattpinne (sump vegg på overflaten av vannet) og fjerne elementer hindre lett tilgang til overflaten. Velg en sump overflate med lav strømning.
  2. Trekk av vattpinnen ved å fjerne de ytre emballasjen og utsette steril bomull spissen til luft. Unngå kryss-kontaminering av vattpinnen ved å ta vare ikke å berøre utestet overflater.
    1. Vattpinne sump veggen over 5-10 cm å absorbere vann og biofilm på overflaten vannstanden sump.
    2. Skjede vattpinnen tilbake eller bryte spissen i et sterilt sentrifuge rør. Etiketten prøven og sende for PCR testing eller fryse på-80 ° C.

3. påvisning av P. tomentosa egg på bunnen av en Tank

  1. Slam analyse av mikroskopi
    1. Bruk en 60 mL sprøyte9 inneholder slam på bunnen av en sump eller noen tank holder fisk inkludert voktere. Del prøven i 15 mL rør. Lukk rør med deres skruen topper og etiketten rørene.
    2. Forberede sukker mettet løsningen (egenvekt = 1.27) ved å blande 227 g sukker i 177 mL varmt vann med en magnetisk rørestang14.
    3. Sentrifuge 15 mL rør 175-250 x g i 10 minutter i en sentrifuge med swing bøtter. Dekanter rør og holde sediment i sine rør.
    4. Fyll opp rør halvveis med mettet sukkeroppløsning. Lukk rør med deres ovenfra og grundig blande sediment med løsningen.
    5. Plasser rør i sentrifuge swing bøtter og fylle dem med sukker mettet løsning til toppen. Angi ett cover glass forsiktig på toppen av hver rør og i kontakt med sukker mettet løsning.
    6. Sentrifuge 175-250 x g for 10 min. Merk at noen cover glass kan falle og brekke under sentrifugering derav det er 4 rør for hver 60 mL prøve. Løft dekselet glasset og sette den på et glass lysbilde. Merke lysbildet med en blyant eller markør penn.
      1. I tilfelle for mange cover glass skader oppstår, fylle opp de fleste av rør med sukker mettet solution sentrifuge 175-250 x g for 10 min, fylle opp til toppen med mettet sukkeroppløsning, så forsiktig sette dekket glasset. Vent 30 min.
    7. Se etter P. tomentosa eggene med mikroskopet13 (figur 2 og Video 1). Identifisere bipolar pluggene på forstørrelse 400 X6.
      Merk: Størrelsen på eggene er 57-78 µm lang og 27-39 µm diameter16,17. Merk en positiv lysbildet er nok for 60 mL prøven å bli erklært positiv.
  2. Screening importert dyr i karantene for P. tomentosa egg
    1. Angi mannlige og kvinnelige D. rerio i en tank. Legge til tanken en enhet som vanligvis brukes til å høste og bevare gytt egg, men bruk den her å samle avføring (Figur 3).
      Merk: For eksempel en full 1 L avl tank (ytre tanken og indre tank med revet bunnen) er helt under vann i en 13 L tank, gir fri tilgang for fisken å flytte av avl enheten.
    2. Fjerne avl enheten etter en uke og høste samlet slam i avl enheten som beskrevet i trinn 3.1 "slam analyse av mikroskopi."

4. PCR på slam Sediment

  1. Sug opp slam på bunnen av en tank eller sump med en 60 mL sprøyte9 og overføre prøven til en 60 mL tube. Lukk røret med sin ovenfra og etiketten røret. Kast sprøyten.
  2. Riste den 60 mL tuben og overføre 15 mL slik 15 mL. Lukk røret med sin ovenfra og etiketten røret.
  3. Sentrifuge 15 mL tube 175-250 x g i 10 minutter i en sentrifuge med swing bøtter. Dekanter rør og holde sediment i røret.
  4. Trekk en vattpinne ved å fjerne de ytre emballasjen og utsette steril bomull spissen til luft. Unngå kryss-kontaminering av vattpinnen ved å ta vare ikke å berøre utestet overflater.
    1. Vattpinne sediment i røret for 15 s.
    2. Skjede vattpinnen tilbake eller bryte spissen i et sterilt sentrifuge rør. Etiketten prøven, fryse-80 ° c og sende for PCR testing.
      Merk: 45 mL forblir i 60 mL tube. Dette kan bli holdt for påvisning av P. tomentosa egg av slam analyse av mikroskopi som beskrevet i trinn 3.1, for eksempel for å bekrefte PCR resultatet. PCR i slam kan bli tiltalt for screening importert dyr etter trinn 3.2.

Representative Results

Fordelene av sump vattpinner å identifisere utbredt Mycobacterium spp. sammenlignet med fisk prøver støttes av resultatene i Figur 4. 115 fisk testet, ble M. chelonae og M. haemophilum oppdaget i 5% og 3% av prøvene, henholdsvis. Ingen andre sykdomsfremkallende mycobacterial arter ble identifisert. Fra samme systemer avsløre 49 sump vattpinner tilstedeværelsen av 5 mycobacterial arter. Odds forholdet beregnes med hypotesen at M. chelonae og M. fortuitum er oppdaget oftere av PCR i overflaten sump vattpinner enn i fisk utvalget. Dette er statistisk signifikant med respektive odds ratio på 11 (95% CI: 4 til 29; p < 0,0001) og 306 (95% CI: 18 til 5208; p = 0,0001). Resultatene viser at overflaten sump vattpinne teknikken er et nyttig alternativ til eget bruk av voktere skjermen sebrafisk anlegget for Mycobacterium spp. Miljøprøver ble også brukt til skjermen for A. hydrophila. Disse bakteriene ble oppdaget i fisk, slam, og overflaten prøver (Figur 4). Dette støtter også evne til den foreslåtte teknikker å skjermen fisk naturtypen.

Om slam analyse for å oppdage P. tomentosa egg, oppdaget Mocho9 parasitten i 27% av fisk prøvene av PCR og histopatologi mens eggene ble oppdaget i 93% av analyserte slam fra samme system. Her, ble teknikken utfordret til å reprodusere karantene screening. I denne sammenheng ikke importert dyr prøves, og vurdere deres helsetilstand i tide hjelper med biosikkerhet ledelsen. Fisk av ukjent helsetilstand fra en P. tomentosa positiv anlegget ble satt i 8 tanker med avl enheter: maksimalt 16 fisk/13 L tanken, 7 transgene og 1 wild type-linjen og blandet kjønn, alderen 4-24 måneder. Slam var høstet fra enhetene etter en uke og analyseres av mikroskopi. P. tomentosa egg ble sett i 7 (88%) prøver. Endelig, PCR påvisning av parasitten var trialed sump vattpinner og slam sedimenter. 4 til 6 slam prøvene var PCR positiv og alle resultatene var negative for av overflaten vattpinner. Dette er ikke overraskende siden slam screening er avhengig av evnen til eggene å falle til bunnen av akvariet. Dette viser at slam analyseteknikker kan brukes til skjermen D. rerio akvarier for P. tomentosa infestation og at metodene kan tilpasses for screening av importerte dyr.

Figure 1
Figur 1: pre filtrering sentinel tank ut av resirkulerende systemet. En 8 L tanken er fylt med vann og bio-media fra sumps av systemer til skjermen. To hvite keramiske bio-media perlene sitte på bunnen av tanken (midt på bildet). 12 fisk velges i henhold til deres alder, belastning og kjønn, og de legges til sentinel tanken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: P. tomentosa egg oppdaget under slam analyse av mikroskopi. Forstørrelse brukt var 400 X. Pilene angir bipolar pluggene. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: avl enheten neddykket i en fisken holder tank å samle slam for analyse. Denne tanken er satt på en benk for bildet. Det ligger ellers i resirkulerende systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Prosentandel av identifikasjon av Mycobacterium spp., A. hydrophilaog P. tomentosa av PCR på fisk, overflaten sump vattpinner, og sump slam. Prosent er oppnådd ved å dele antall positive resultater for hver patogen Art antall testet utdrag. Prosentandelen av positive resultater er gitt etter prøven som fisk, overflate eller slam, og indikerte bakterier navn. 115 fisk og 49 overflaten sump vattpinner ble testet av PCR for identifikasjon av Mycobacterium spp. Dataene er kompilert med Mocho's9 resultater siden det er en forlengelse av denne studien. Fisken er hovedsakelig pre filtrering sentinels som protokollen avsnitt 1. Sjelden, når voktere ikke var tilgjengelig, escapees og gamle kolonien fisk (> 18 måneder) ble valgt. Alle systemer som er testet for Mycobacterium spp. ble testet på fisk og sump vattpinner. Odds forholdet beregnes med hypotesen at M. chelonae og M. fortuitum er oppdaget oftere av PCR i overflaten sump vattpinner enn i fisk utvalget. Dette er statistisk signifikant med respektive odds ratio på 11 (95% CI: 4 til 29; p < 0,0001) og 306 (95% CI: 18 til 5208; p = 0,0001). Mycobacterium marinum PCR var negativ for alle prøvene og det er derfor ansett fraværende fra disse anleggene og ikke inkludert i analysen. 12 fisk, 14 overflaten sump vattpinner og 6 sump slam ble testet av PCR for tilstedeværelsen av A. hydrophila. 6 sumps ble testet for tilstedeværelsen av P. tomentosa på overflaten og slam. PCR = polymerasekjedereaksjons. CI = konfidensintervall. * og ** angi statistiske betydning; andre sammenligninger var ikke statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: skanning for egg P. tomentosa med mikroskopet. Lysbildet er Hentet fra slam analyse som beskrevet i trinn 3.1. Feltet er skannet for å finne egg P. tomentosa. Når en struktur er anerkjent, zoomes det inn for å bekrefte identifikasjon med høyere oppløsning. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Forfattere Alder ved starten av eksponering Lengden på eksponering Prøvetaking alder Pre- eller Post
filtrering		 Kjønn Strain(s)
Barton et al. 3 4 måneder 6 måneder 10 måneder Før filtrering I/T I/T
Borges et al. 4 6 måneder 6 måneder 12 måneder Før filtrering I/T AB villtype
Collymore et al. 5 Så unge som mulig 3 måneder < 6 måneder Før filtrering I/T I/T
Geisler et al. 6 4 måneder 4 måneder 8 måneder Før og etter
filtrering		 I/T AB villtype
Liu et al. 7 3 måneder 1-6 måneder 4-9 måneder Før og etter
filtrering		 I/T Wild type
Martins et al. 8 3 måneder 3 måneder 6 måneder Før filtrering I/T Wild type
Mocho9 < 6 måneder,
6 - 12 måneder,
> 18 måneder		 4 måneder 7 - 24 måneder Før filtrering 1 kvinne og
1 hann av
hver aldersgruppe		 AB villtype
Murray et al. 10 3-4 måneder 3 måneder, 6 måneder, 1 år 7, 10 og 16
måneder		 Før og etter
filtrering		 I/T AB villtype

Tabell 1: sammenligning av sentinel innstillingene i sebrafisk fasiliteter. Sentinel fisken kan velges etter alder, kjønn, eller stamme. De er utsatt for en bestemt periode, og de få pre- eller post filtrering system vann. Dataene er Hentet fra 2016 spesialnummer på helse sebrafisk journal3,4,5,6,7,8,9, 10.

Discussion

Begrensninger av teknikker, avgjørende skritt, og feilsøking:

Alder, kjønn, belastning, og lengden på eksponering av sentinels er ikke standardiserte. Dette er vist i tabell 1. Det er svært lite screening av fisk under 6 måneder eller år fisk. Det kan være noen patogener som påvirker den unge fisken som det er noen patogener som er mer utbredt i de eldre befolkning10,18,19,20. Tilsvarende er kjønn ikke vurdert i valg av noen sentinel grupper til tross for noen rapporten at det er en kjønns bias for noen patogener21. Den foreslåtte teknikken prøver å løse disse problemene, men valg av belastningen kan gjøres etter en bestemt patogen overvåke. For eksempel TU kunne hjelpe med oppdagelsen av Mycobacterium spp.12,22, men det er en risiko som sentinels vil da fungere som et reservoar vise eller klinisk underskriver. Om hvor lang eksponering øker tilnærming av sebrafisk International Resource Center10 sjansene å oppdage patogener som kan være savnet med en utilstrekkelig forurensning periode. Behovet for langvarig eksponering innebærer at voktere ikke er tilgjengelige. Tillegg av miljøprøver kan litt fleksibilitet og multiplikasjon av screening hendelsene. For eksempel kan prøvetaking finne sted hver andre måned med en 4 måneders intervallet mellom hver screening metode. Dette kan redusere bortfall av tid før en nylig introduserte patogen oppdages.

Miljøtester teknikker er avhengige av gjenkjenning av patogener i miljøet. Patogener er skur av fisken og derfor fortynnet i vann system. Muligheten for å fange patogener av vann filtrering23 var ikke utforsket. Metodene vi beskrive er bare effektiv hvis patogener er gitt nok tid å multiplisere fisk og biofilm å nå en terskel forurensning tillater gjenkjenning. Denne begrensningen av teknikkene minimeres ved et kritisk utvalg av webområdene prøvetaking: slam i tanken samples enn sump slam og vann og biofilm samples i overflaten av bunnpannen og ikke i en tank eller post filtrering. Likevel er alle prøvene i samme system neppe til å gi samme resultat. Positive resultater for P. tomentosa kan bekreftes ved å bruke en annen analysen (histopatologi, PCR eller slam analyse). Mycobacterial PCR positive resultater kan bekreftes ved kultur eller en annen diagnostisk laboratorium. Men når etablerende en helsetilstand, er ytterligere eksempler anbefalt å bekrefte negative resultater fra noen miljøtester teknikk.

Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende/Alternative metoder:

Deres tilstedeværelse i bunnpannen ikke forutse ikke deres virusets12 Mycobacterium spp. er vanlig i miljøet. Mocho9 viste at overvåking dødelighet er nøkkelen å kartlegge utviklingen av helseproblemer. Bruk av dyr prøvene er fortsatt viktig å en veterinary undersøkelse. Helseovervåking innebærer påvisning av alle utbredt patogener i anlegg, og dette kan ikke oppnås med eget bruk miljøtester teknikker. Likevel, mangel på sensitivitet diagnose verktøy kan forsinke eller forhindre en nøyaktig beskrivelse av helsetilstanden. Mens bruken av voktere reduserer antall fisk kreves for å gjenkjenne en utbredt mikrobe i befolkningen, legger mangel på sensitivitet vekt til å bruke en kombinasjon av metoder, inkludert miljøtester5,23. Faktisk er bestemt patogen gratis status vanligvis definert som fravær av en art i anlegget slik at miljø og dyr må teste negative24,25.

Sump vattpinne resultatene å identifisere Mycobacterium spp. viser at stole på fisk prøver kan føre til en falsk negativt helsetilstand. 6 testet mycobacterial arter er beskrevet som patogene eller potensial patogene i sebrafisk15 og noen ville ikke bli eliminert av egg overflaten desinfeksjon med klor26 som rutinemessig utført i karantene. Falske negative kan derfor ha noen konsekvenser for samarbeidspartnere som importere linjer. For eksempel M. fortuitum var savnet av PCR på fisk utvalg, men mer enn halvparten av sump vattpinnen PCR oppdaget den. Tatt i betraktning at disse mykobakterier er mer motstandsdyktig mot klor enn andre og deres evne til å vokse i vann systemer27, er det en risiko for ikke-forurenset import anlegget. For å tillate import av linjer, må ledere stole og sammenligne rapportene av eksport med deres. ICLAS ytelse evaluering Program28 er nøkkelen til denne prosessen i gnagere. RESAMA nettverket rapporterer oppdagelsen av M. gordonae og M. mucogenicum i fransk D. rerio11. Disse mykobakterier er ikke definert i paneler av kommersielle laboratorier som vi bruker. Det ville være nyttig å utvide ICLAS programmet og for å harmonisere de diagnostiske analyser som listen over patogene arter29.

A. hydrophila er også en patogen som har potensial til å bli introdusert når du importerer dyr, selv om sin mottakelighet for klor30 gjør sin eliminering mer sannsynlig under rutinemessig egg overflaten desinfisering. I sumpen, vattpinne og slam resultater viser at miljøtester kan brukes til å oppdage denne patogen. Andre bakterier som Mycobacterium spp. oppdages i slam av PCR23. Denne typen utvalg er spesielt relevant siden gjør påvisning av skur patogener. En annen ny program er for eksempel slam analyse til skjermen importerte fisk i karantene for P. tomentosa. Parasitten er en trussel til dyrets helse13 og neoplasi modeller16. Videre er klor konsentrasjoner i rutinemessig sebrafisk egg overflaten desinfeksjon ikke effektiv31. Derfor, kan skjermen importerte dyrene med en ukes omsetning og uten noen fisk euthanasia synes svært attraktive. Denne teknikken kan påvirke karantene og biosikkerhet reglene ved å tillate en triage av import. En beslutningsprosess så laget etter utbredt patogener i eksport anlegget, oppdaget patogener i prøvene fra den importerte fisken og risikoen for at helsetilstanden til import anlegget10.

Framtidige applikasjoner eller etter mestre disse teknikkene:

Selv om rutinemessig karantene behandling alternativet valgt, kan effekten av slike medisiner32,33,34,35,36 vurderes med avl enheten slam analyse. Mer generelt, miljømessige screening kan brukes til å teste forbindelser mot bakterier og parasitten utrydding, inkludert fisk naturtypen. En annen nisje søknad av miljømessige screening er å overvåke patogen befolkningen i live feed37,38. Men den viktigste anvendelsen av disse teknikkene er som et verdifullt tillegg til diagnose verktøykassen for helse overvåking sebrafisk fasiliteter. En mer nøyaktig, kostnader og tid effektiv definisjon av helsetilstand, sump vattpinner og slam analyse er komplementære til sentinel overvåking og rutinemessig karantene praksis. Fremtiden for disse teknikkene er faktisk å være en rutinemessig del av akvatiske laboratorium helse rapporter.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke BRF svømming laget av Francis Crick Institute for teknisk hjelp og kritiske inndata. Dette arbeidet ble støttet av Francis Crick Institute som mottar sin kjernen finansiering fra kreftforskning Storbritannia (FC001999), UK Medical Research Council (FC001999) og Wellcome Trust (FC001999).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aqua-Sed 250 mL Vetark 2-phenoxyethanol
Tubed Sterile Dryswab Tip mwe MW100 Sump surface
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric Becton
Dickinson		 300866 They are actually
graduated to 60 ml
Centrifuge tube 15 mL Corning Corning 430766
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) Sanyo MSB020.CX1.5
Cover Glass 22 mm x22 mm Menzel-Glaser MNJ-350-020H
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific F155CA Swab sediment from sludge
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap Corning 430921
In-Tank Spawning Tray Set MBK Installations Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schroeder, P., Mocho, J. P. A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare. Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).
  2. Mason, T., et al. Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility. Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).
  3. Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).
  4. Borges, A. C., et al. Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study. Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).
  5. Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).
  6. Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).
  7. Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories. Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).
  8. Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research. Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).
  9. Mocho, J. -P. Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).
  10. Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center. Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).
  11. Legendre, L., et al. RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities. Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).
  12. Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).
  13. Murray, K. N., Peterson, T. S. Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish. J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).
  14. Foreyt, W. J. Veterinary Parasitology Reference Manual. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).
  15. Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R. Mycobacteriosis in zebrafish colonies. ILAR J. 53 (2), 95-105 (2012).
  16. Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies. Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).
  17. Moravec, F. Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873). Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).
  18. Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction. Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).
  19. Watral, V., Kent, M. L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).
  20. Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities. FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).
  21. Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan). J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).
  22. Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).
  23. Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).
  24. Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).
  25. Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).
  26. Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).
  27. Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).
  28. Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. First trial in the developmental phase of the "performance evaluation program" based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS. Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).
  29. Nogueira, C. L., et al. Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).
  30. Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains. J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).
  31. Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs. J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).
  32. Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes. Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).
  33. Samaee, S. M. Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).
  34. Collymore, C., et al. Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).
  35. Chang, C. T., Whipps, C. M. Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish. Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).
  36. Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. , (2017).
  37. Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio. Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).
  38. Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish. Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).

Tags

Mikrobiologi problemet 130 miljøtester Aeromonas hydrophila Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa sebrafisk Danio rerio sunnhet avlytting biofilm slam karantene fisk vann mikrobiologi
Miljøtester <em>Aeromonas hydrophila</em>, <em>Mycobacterium</em> spp. og <em>Pseudocapillaria tomentosa</em> i sebrafisk systemer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mocho, J. P., Martin, D. J.,… More

Mocho, J. P., Martin, D. J., Millington, M. E., Saavedra Torres, Y. Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems. J. Vis. Exp. (130), e55306, doi:10.3791/55306 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter