Summary
膵管注入は、系統トレース、遺伝子導入、および細胞ライン特異的ターゲティングを可能にする重要な技術です。ここでは、膵臓細胞への薬物およびウイルス送達のための膵管注入技術を紹介する。
Abstract
膵臓は、内分泌成分と外分泌成分の両方を有する二官能器官である。多くの病理は、糖尿病、膵炎、膵臓癌を含む膵臓を苦しめることができます。これら3つの疾患はすべて、即時治療を開発するだけでなく、病態生理をよりよく理解するために、研究の活発な分野をマークします。これらの研究分野をさらに進めるツールはほとんどありません。膵管注入は、系統トレース、遺伝子導入、および細胞ライン特異的ターゲティングを可能にする重要な技術です。この技術は、十二指腸とアンペアの第2部分の複雑な解剖を必要とし、続いて胆管の閉塞と膵管のカヌル化を伴う。このテクニックは最初は技術的に難しいですが、アプリケーションは無数です。グループ間の手順の詳細におけるあいまいさは、標準プロトコルの必要性を強調した。本研究は、GFPを発現するウイルスベクターの膵管注入後の膵臓内の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現と偽の手術を説明する。注入は、それゆえに発現は膵臓に特異的であり、他のどの組織タイプにも発現が存在しない。
Introduction
膵臓は、内分泌および外分泌成分の両方を有する二機能器官である。多くの病理は、糖尿病、膵炎、および膵臓癌1を含む膵臓を苦しめる可能性がある。これら3つの疾患はすべて、即時治療を開発するだけでなく、病態生理をよりよく理解するために、研究の活発な分野をマークします。
標的治療的送達方法は有益であろう。我々は、膵臓細胞への薬物およびウイルス送達に有効かつ選択的な方法である膵管注入技術を開発した。このモデルでは、膵管は選択的にカニューレ化され、共通の胆管は閉塞され、膵臓への送達のみを可能にする。
この技術は、膵臓の発達および病理2、3に重要な発達経路をさらに解明するために、特定の細胞型の系統トレースを可能にする。ウイルスベクターにおける異なるプロモーターは、細胞株の特異的標的化を可能にし、これらの細胞株4、5に遺伝子を導入することを可能にする。この研究は、GFPを発現するウイルスベクターと偽手術を発現するウイルスベクターの膵管注入後の膵臓内の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を実証する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物実験は、ピッツバーグ小児病院の動物研究・ケア委員会とピッツバーグ大学の施設動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 術前準備
- 吸入イオブルラン(1 - メンテナンス時は3%、誘導では最大5%)を鼻コーンを介して適切な麻酔レベルに投与する。鉗子とつまみつまみによって麻酔の妥当性を監視する。応答の欠如は十分であると考えられ、呼吸抑制が起こる可能性があるため、過剰に投薬しないようにしてください。
- 動物を背中に置いて、顕微鏡の解剖ステージに置き、腹部を目的の観点から中心にします。手術用テープで動物を固定化します。麻酔下で乾燥を防ぐために、動物の目に眼科軟膏を適用します。
- 脱毛クリームの滑らかで厚い層を適用し、3分間所定の位置に残します。小さな部分で脱毛を確認してください。クリームと髪を70%エタノール浸しガーゼでそっと拭き取ります。
- 70%エタノール浸しガーゼ、続いてベタジン浸しガーゼで拭いて動物の腹部を浄化し、消毒します。外科的処置を通して生殖不能状態を維持する。
2. 適切な露出
- 皮膚に中線切開を行い、皮膚の中傷をメスを用いて、キシフォイドプロセスから臍に切開します。Adson鉗子で腹を持ち上げ、はさみを使って中線に小さな穴を開けます。
- 腹膜切開を皮膚切開の長さに伸ばし、中線(リネアアルバ)に残るように注意する。
注:これは上の中腹腹腔内手術を生成します。 - 一般的な胆管を露出する鈍いレトラクターで肝臓を高めます。湾曲したブルドッグの血管クランプで共通の胆管をクランプします。
注:この操縦は、肝臓への望ましくない注入を防ぎます。
3. 膵乳頭・十二指腸切毛術の同定
- 十二指腸を識別し、アルガ鉗子で、乳頭を表示するためにそれを大きく引き込みます。
注:乳頭は十二指腸の第2の部分の前表面の白い斑点です。 - 十二指腸を大きく引き込み、膵管の経過を同定することを可能にする。301/2ゲージ針で、乳頭の真向かいにある十二指腸の壁を正接的に穿刺する。
注: 針は十二指腸に入るダクトと同じ角度に従う必要があります。
4. 輸液。
- カテーテルがダクト内に見えるまで、ステップ3.2で作成した十二指腸切欠切を通してカテーテルを通過させます。カテーテルをダクトに1cm以下に進め、副管支流のバイパスを防ぎます。
- 2番目の湾曲したブルドッグの血管クランプでカテーテルを所定の位置にクランプします。ポンプの電源を入れ、選択したボリュームを注入します。注入される容積は25~250μLの範囲で、理想的な体積は約150μLです。
- 約1.5mLの腹腔内注射を行い、損失を相殺します。乾燥を防ぐために湿ったガーゼで露出した腸を覆います。
- 注入の終わりに、カテーテルを所定の位置に保持していたブルドッグクランプを取り外す。ブルドッグクランプを使用して、膵管からカテーテルを静かに取り外します。共通の胆管からクランプを解放します。
- 実行中の縫合糸を使用して、腹と皮膚を1つまたは2つの層で閉じます。
注:十二指腸切剖学は、単独で封印するので、閉じる必要はありません。 - 術後鎮痛として、処置中に5mg/kgでケトフェンの用量を投与し、翌日に1回投与する。
- マウスが回復するまで、ヒートランプの下のケージにマウスを戻します。マウスに食べ物と水のアドリビタムを提供します。
- 胸骨の不参せを維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。完全に回復するまで、手術を受けた動物を他の動物の会社に返却しないでください。
5. サンプルの準備
- 動物を二酸化炭素室に入れるか、子宮頸部脱臼を行う。
- 膵臓を収穫します, コントロールとして脾臓, 肝臓, 十二指腸.4°Cで一晩パラホルムアルデヒドで組織を固定します。 前に説明した30%のショ糖でサンプルを一晩で凍結保護する、6.
- サンプルをスナップフリーズします。ミクロトームを使用して、6 μmの厚さの組織を切り離します。前述の7のように、蛍光イメージングを用いて顕微鏡でイメージングを行う。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
練習と慎重な外科技術では、これらのマウスの生存率は95%を超える必要があります。注入の1週間後、所望の効果は膵臓で明らかであるべきです。10~12週齢のマウスを膵管注入に利用した。ここでは、偽の手術と比較して、CMVプロモーターを有するアデノ関連ウイルス血清型8(AAV8)を用いて緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現させる。マウス膵臓は、注入の7日後に収穫した。膵臓、脾臓、十二指腸の切片をインスリン抗体とHoeschtで染色した。 図1 は、AAV8で膵管注入を受けたマウスの膵臓全体に、偽の手術を受けたマウスとは対照的に広範囲に及ぶGFPの発現があることを示している。これらのマウスには肝臓、脾臓、十二指腸に発現がなく、したがって注入の選択的性質を文書化する。これらのデータは、DNAおよびRNA発現プロファイルを含む他のいくつかの方法で確認することができる。
図 1.膵管注入後のGFPの発現 (a)(b)GFPを発現するAAV8による膵管注入と比較して、シャム手術。スケールバーは50 μmを表します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この研究は、膵臓に遺伝子やその他の分子を特異的かつ効果的に送達するための効果的なマウスモデルである膵管注入の背後にある方法論を詳細に説明する。さまざまなグループ間の手順の詳細におけるあいまいさは、標準化されたプロトコル8、9、10の必要性を強調した。
処置のいくつかの重要なステップがあります, 若いから始まる, 健康なマウスの選択.十二指腸の穿フォーマは、どんなに小さく、制御されたが、間違いなく炎症性サイトカインおよび完全に特徴付けられていない他の要因の募集につながるマウスの外傷性事象である。したがって、カテーテルの導入のために可能な最小の十二指腸切除術を作成しているように、繊細な解剖が重要である。全体のプロシージャの最も重要なステップは、送達システムと膵管の缶取です。
膵乳頭の過度の破壊によって困難が生じ、圧倒的な全身炎症反応を引き起こす。膵臓は繊細な器官です。外科のコミュニティでは、口語的に「混乱」しない器官として記述されています。成功率は、開業医のスキルレベルでわずかに異なります。胆管が適切に閉塞している限り、注入は膵臓単独に100%特異的である。
手順の学習曲線は非常に急であり、主な制限は練習で克服されます。前述のように、十二指腸および膵臓の過剰な操作は、避けなければならない圧倒的な炎症反応につながる可能性があります。
この手順は、多くの異なる分野にわたって幅広い適用性を持っています。特異的ウイルスベクター11の使用を通じて標的遺伝子送達の方法として利用することができる。この手順はまた、膵臓細胞機能の解明を助ける分子の特異的注入を可能にすることができる。特定の分子の特異的送達は、増殖を生じさせる島内のシグナル伝達経路を修飾する魅力的な方法である12。また、膵臓内で所望の遺伝子型や表現型を直接産生することで、トランスジェニックの繁殖の必要性を排除することができます。アプリケーションは無数です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者は謝辞を持っていません。浙江省保健家族計画財団(グラント20146242)と温州科学技術局(Grant Y20140248)から資金が寄せられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
