Summary
ضخ قناة البنكرياس هو تقنية هامة يمكن أن تسمح لتتبع النسب، وإدخال الجينات، واستهداف خط الخلية محددة. يتم تقديم تقنية ضخ قناة البنكرياس لتوصيل المخدرات والفيروسية إلى خلايا البنكرياس هنا.
Abstract
البنكرياس هو جهاز ثنائي الوظائف مع كل من مكونات الغدد الصماء والغدد الصماء. يمكن أن يصيب عدد من الأمراض البنكرياس، بما في ذلك مرض السكري والتهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس. كل ثلاثة من هذه الأمراض علامة مجالات نشطة من الدراسة، ليس فقط لتطوير العلاج الفوري، ولكن أيضا لفهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية. وهناك عدد قليل من الأدوات لتعزيز مجالات الدراسة هذه. ضخ قناة البنكرياس هو تقنية هامة يمكن أن تسمح لتتبع النسب، وإدخال الجينات، واستهداف خط الخلية محددة. تتطلب هذه التقنية تشريحا معقدا للجزء الثاني من الاثني عشر والأمبولة ، يليه انسداد القناة الصفراوية وتكنيس قناة البنكرياس. على الرغم من أن هذه التقنية هي صعبة من الناحية الفنية في البداية، والتطبيقات لا تعد ولا تحصى. 10- وأبرز الغموض في تفاصيل الإجراء بين المجموعات الحاجة إلى بروتوكول موحد. يصف هذا العمل التعبير عن بروتين فلوري أخضر (GFP) داخل البنكرياس بعد ضخ قناة البنكرياس لناقل فيروسي يعبر عن GFP مقابل جراحة صورية. التسريب وبالتالي التعبير محدد للبنكرياس ، دون التعبير موجود في أي نوع آخر من الأنسجة.
Introduction
البنكرياس هو جهاز ثنائي الوظائف ، مع كل من مكونات الغدد الصماء والغدد الصماء. يمكن أن يصيب عدد من الأمراض البنكرياس ، بما في ذلك مرض السكري والتهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس1. كل ثلاثة من هذه الأمراض علامة مجالات نشطة من الدراسة، ليس فقط لتطوير العلاج الفوري، ولكن أيضا لفهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية.
ومن شأن طريقة التسليم العلاجي المستهدفة أن تكون مفيدة. لقد طورنا تقنية ضخ قناة البنكرياس التي هي طريقة فعالة وانتقائية لتسليم المخدرات والفيروسية إلى خلايا البنكرياس. في هذا النموذج، القناة البنكرياسية يتم تحصينها بشكل انتقائي، والقناة الصفراوية الشائعة محصرة، مما يسمح بالولادة حصرا إلى البنكرياس.
هذه التقنية يمكن أن تسمح لتتبع النسب من أنواع الخلايا المحددة لتوضيح المزيد من مسارات النمو الهامة لتطوير البنكرياس وعلم الأمراض2،3. المروجين مختلفة في ناقلات الفيروسية تسمح لاستهداف محددة من خطوط الخلية وإدخال الجينات في هذه الخطوط الخلية4،5. يوضح هذا العمل التعبير عن بروتين فلوري أخضر (GFP) داخل البنكرياس بعد ضخ قناة البنكرياس لنواقل فيروسي يعبر عن GFP مقابل جراحة صورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة البحوث والعناية بالحيوانات في مستشفى الأطفال في بيتسبرغ واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة بيتسبرغ على جميع التجارب على الحيوانات.
1. التحضير قبل الجراحة
- إعطاء isoflurane المستنشق (1 - 3٪ للصيانة وما يصل إلى 5٪ للتحريض) عن طريق مخروط الأنف إلى مستوى مخدر مناسب. رصد كفاية التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم مع ملقط. ويعتبر عدم وجود استجابة كافية، وتأكد من عدم الإفراط في الطب، كما قد يحدث الاكتئاب التنفسي.
- ضع الحيوان على ظهره على مرحلة المجهر تشريح، مع البطن تركزت في ضوء الهدف. شل حركة الحيوان بشريط جراحي. تطبيق مرهم العيون على عيون الحيوان لمنع الجفاف أثناء التخدير.
- ضعي طبقة ناعمة وسميكة من كريم إزالة الشعر واتركيها في مكانها لمدة 3 دقائق. تحقق من منطقة صغيرة لإزالة الشعر. مسح بلطف قبالة كريم والشعر مع 70٪ الإيثانول غارقة الشاش.
- تطهير وتطهير البطن من الحيوان عن طريق مسحه مع 70٪ الشاش غارقة الإيثانول تليها الشاش غارقة في بيتادين. الحفاظ على الظروف العقيمة طوال العملية الجراحية.
2. التعرض السليم
- إجراء شق خط الوسط في الجلد من عملية xyphoid إلى السرة باستخدام مشرط. رفع الصفاق مع ملقط Adson وجعل ثقب صغير في خط الوسط باستخدام مقص.
- تمديد شق الصفاق إلى طول شق الجلد، مع الحرص على البقاء على خط الوسط (خط ألبا).
ملاحظة: هذا سوف ينتج استئصال البطن خط الوسط العلوي. - رفع الكبد مع السحب حادة لفضح القناة الصفراوية المشتركة. المشبك القناة الصفراوية المشتركة مع المشبك الأوعية الدموية البلدغ المنحني.
ملاحظة: هذه المناورة يمنع التسريب غير المرغوب فيه في الكبد.
3. تحديد بابيلا البنكرياس ودومينوتومي
- تحديد الاثني عشر و, مع ملقط Arruga, التراجع عن ذلك caudally لعرض الحليمة.
ملاحظة: الحليمة بقعة بيضاء على السطح الأمامي للجزء الثاني من الاثني عشر. - تراجع عن الاثني عشر caudally، مما يسمح لتحديد مسار القناة البنكرياس. مع إبرة قياس 30، ثقب جدار الاثني عشر عرضيا، مباشرة مقابل الحليمة.
ملاحظة: يجب أن تتبع الإبرة نفس زاوية القناة عند دخولها إلى الاثني عشر.
4. التسريب.
- مرر القسطرة عبر استئصال الاثني عشر الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.2 حتى تكون القسطرة مرئية داخل القناة. تقدم القسطرة إلى القناة لا يزيد طولها عن 1 سم لمنع تجاوز روافد القناة الصغيرة.
- المشبك القسطرة في مكان مع المشبك بولدوغ الأوعية الدموية المنحني الثاني. قم بتشغيل المضخة وضخ وحدة التخزين المحددة. قد يتراوح الحجم المشبع من 25 إلى 250 ميكرولتر، مع حجم مثالي يبلغ حوالي 150 ميكرولتر.
- إعطاء حقنة داخل الصفاق من حوالي 1.5 مل من المالحة لتعويض الخسائر. قم بتغطية الأمعاء المكشوفة بالشاش الرطب لمنع الجفاف.
- في ختام التسريب، قم بإزالة مشبك البلدغ الذي كان يحمل القسطرة في مكانها. استخدم مشبك البلدغ لإزالة القسطرة برفق من قناة البنكرياس. حرر المشبك من القناة الصفراوية الشائعة.
- أغلق الصفاق والجلد في طبقة أو طبقتين باستخدام خياطة قيد التشغيل.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لإغلاق استئصال الاثني عشر، كما أنها سوف ختم من تلقاء نفسها. - كما مسكن بعد الجراحة, إعطاء جرعة من كيتوفين في 5 ملغم /كغ أثناء الإجراء واحد في اليوم التالي.
- أعد الفأر إلى قفصه تحت مصباح حراري حتى يتعافى. تزويد الماوس مع الغذاء والماء libitum الإعلانية.
- لا تترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على شغل المنصب القصي. لا تقم بإرجاع الحيوان الذي خضع لعملية جراحية إلى شركة الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تماما.
5. إعداد العينة
- ضع الحيوان في غرفة ثاني أكسيد الكربون أو قم بخلع عنق الرحم.
- حصاد البنكرياس، مع الطحال والكبد، والاثني عشر كضوابط. إصلاح الأنسجة في بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. Cryoprotect العينة في 30٪ السكروز بين عشية وضحاها, كما سبق وصفه6.
- المفاجئة تجميد العينات. قسم الأنسجة في سمك 6 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. إجراء التصوير على المجهر مع التصوير الفلوري، كما سبق وصفه7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع الممارسة والتقنية الجراحية الدقيقة ، يجب أن يكون معدل بقاء هذه الفئران أكبر من 95٪. بعد أسبوع واحد من التسريب ، يجب أن يكون التأثير المطلوب واضحا في البنكرياس. الفئران في 10 إلى 12 أسابيع من العمر استخدمت لضخ قناة البنكرياس. هنا نستخدم الفيروس المرتبط بال أدينو النمط المصلي 8 (AAV8) مع مروج CMV للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، بالمقارنة مع الجراحة الصورية. تم حصاد البنكرياس الفئران 7 أيام بعد التسريبات. كانت أجزاء من البنكرياس والطحال والاثني عشر ملطخة بالأجسام المضادة للأنسولين وهوشت. الشكل 1 يظهر أن هناك تعبير واسع من GFP في جميع أنحاء البنكرياس في الفئران التي خضعت لضخ قناة البنكرياس مع AAV8, بدلا من تلك التي خضعت لعملية جراحية صورية. لا يوجد تعبير في الكبد أو الطحال أو الاثني عشر في هذه الفئران ، وبالتالي توثيق الطبيعة الانتقائية للتسريب. يمكن تأكيد هذه البيانات بعدة طرق أخرى، بما في ذلك ملفات تعريف التعبير عن الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 التعبير عن GFP بعد ضخ قناة البنكرياس. (أ) جراحة الشام بالمقارنة مع (ب) ضخ قناة البنكرياس مع AAV8 التعبير عن GFP. يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا العمل بالتفصيل المنهجية وراء ضخ قناة البنكرياس ، وهو نموذج فعال للفأرة لتسليم الجينات والجزيئات الأخرى على وجه التحديد وبشكل فعال إلى البنكرياس. الغموض في تفاصيل الإجراء بين المجموعات المختلفة أبرز الحاجة إلى بروتوكول موحد8و9و10.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء ، بدءا من اختيار الفئران الشابة والصحية. ثقب الاثني عشر ، مهما كانت صغيرة وتسيطر عليها ، هو حدث صادم في الماوس الذي يؤدي بلا شك إلى تجنيد السيتوكينات الالتهابية وغيرها من العوامل التي لم يتم وصفها تماما. لذلك ، فإن التشريح الدقيق أمر بالغ الأهمية ، كما هو خلق أصغر استئصال ثنائي عشر ممكن لإدخال القسطرة. أهم خطوة في الإجراء بأكمله هو علبة القناة البنكرياس مع نظام التسليم.
يمكن أن تنشأ صعوبات مع الاضطراب المفرط في حليمة البنكرياس ، مما يؤدي إلى استجابة التهابية نظامية ساحقة. البنكرياس هو جهاز حساس. في المجتمع الجراحي ، يوصف بالعامية بأنه عضو لا "يعبث" به. سوف تختلف معدلات النجاح قليلا فقط مع مستوى مهارة الممارس. طالما القناة الصفراوية هو انسداد بشكل صحيح، فإن ضخ تكون محددة 100٪ إلى البنكرياس وحده.
منحنى التعلم لهذا الإجراء حاد جدا، ويتم التغلب على القيد الرئيسي مع الممارسة. كما ذكر سابقا ، يمكن أن يؤدي التلاعب المفرط بالثنائي والبنكرياس إلى استجابة التهابية ساحقة يجب تجنبها.
وينطبق هذا الإجراء على نطاق واسع في العديد من التخصصات المختلفة. ويمكن استخدامه كوسيلة لإيصال الجينات المستهدفة من خلال استخدام ناقلات فيروسية محددة11. يمكن أن يسمح الإجراء أيضا بالتسريب المحدد للجزيئات التي تساعد في توضيح وظيفة خلايا البنكرياس. التسليم المحدد لبعض الجزيئات هو وسيلة جذابة لتعديل مسارات الإشارات داخل الجزر لإنتاج الانتشار12. ويمكن للنظام أيضا تجنب الحاجة إلى تربية المعدلة وراثيا عن طريق إنتاج مباشرة النمط الجيني المطلوب والنمط الظاهري داخل البنكرياس. التطبيقات لا تعد ولا تحصى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي إقرار. تم تلقي التمويل من مؤسسة الصحة وتنظيم الأسرة التابعة لمقاطعة تشجيانغ (منحة 20146242) ومؤسسة مكتب ونتشو للعلوم والتكنولوجيا (المنحة Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
