Summary
Инфузия протоков поджелудочной железы является важным методом, который может позволить отслеживать родословную, вводить гены и нацеливаться на клеточную линию. Здесь представлена методика инфузии протоков поджелудочной железы для доставки лекарств и вирусов к клеткам поджелудочной железы.
Abstract
Поджелудочная железа является бифункциональным органом как с эндокринными, так и с экзокринными компонентами. Ряд патологий может поразить поджелудочную железу, включая диабет, панкреатит и рак поджелудочной железы. Все эти три заболевания отмечают активные направления исследования, не только для разработки немедленной терапии, но и для лучшего понимания их патофизиологии. Существует мало инструментов для дальнейшего развития этих областей обучения. Инфузия протоков поджелудочной железы является важным методом, который может позволить отслеживать родословную, вводить гены и нацеливаться на клеточную линию. Техника требует сложного рассечения второй части двенадцатиперстной кишки и ампулы с последующим окклюзией желчного протока и канюляцией протока поджелудочной железы. Хотя поначалу техника технически сложна, приложений множество. Неоднозначность в специфике процедуры между группами подчеркнула необходимость стандартного протокола. Эта работа описывает экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) в поджелудочной железе после инфузии протока поджелудочной железы вирусного вектора, экспрессирующего GFP, по сравнению с фиктивной операцией. Инфузия и, следовательно, экспрессия специфичны для поджелудочной железы, без экспрессии, присутствующей в любом другом типе ткани.
Introduction
Поджелудочная железа является бифункциональным органом, с эндокринными и экзокринными компонентами. Ряд патологий может поразить поджелудочную железу, включая диабет, панкреатит и рак поджелудочной железы1. Все эти три заболевания отмечают активные направления исследования, не только для разработки немедленной терапии, но и для лучшего понимания их патофизиологии.
Целевой терапевтический метод доставки был бы полезен. Мы разработали методику инфузии протоков поджелудочной железы, которая является эффективным и селективным методом доставки лекарств и вирусов к клеткам поджелудочной железы. В этой модели проток поджелудочной железы избирательно канюлятируется, а общий желчный проток закупоривается, что позволяет доставлять исключительно в поджелудочную железу.
Этот метод может позволить проследить родословную конкретных типов клеток для дальнейшего выяснения путей развития, важных для развития поджелудочной железы и патологии2,3. Различные промоторы в вирусных векторах позволяют специфически нацеливаться на клеточные линии и ввести гены в эти клеточные линии4,5. Эта работа демонстрирует экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) в поджелудочной железе после инфузии протока поджелудочной железы вирусного вектора, экспрессирующего GFP, по сравнению с фиктивной операцией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по исследованиям и уходу за животными в Детской больнице Питтсбурга и Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Питтсбурга.
1. Предоперационная подготовка
- Вводят ингаляционный изофлуран (1 - 3% для поддержания и до 5% для индукции) через носовой конус до соответствующего анестезирующего уровня. Следите за адекватностью анестезии путем ущемления щипцами. Отсутствие ответа считается адекватным, и обязательно не следует чрезмерно принять лекарства, так как может возникнуть угнетение дыхания.
- Поместите животное на спину на сцену рассекающего микроскопа, с брюшком, центрируемым с учетом цели. Обездвижить животное хирургическим скотчем. Наносите офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Нанесите гладкий толстый слой крема для удаления волос и оставьте на месте на 3 мин. Проверьте небольшой участок для удаления волос. Аккуратно протрите крем и волосы 70% пропитанной этанолом марлей.
- Очистите и продезинфицируйте брюшко животного, протирая его 70% пропитанной этанолом марлей, а затем пропитанной бетадином марлей. Поддерживать стерильные условия на протяжении всей хирургической процедуры.
2. Правильная экспозиция
- Сделайте разрез средней линии в коже от ксилоидного отроста до пупка с помощью скальпеля. Поднимите брюшину щипцами Адсона и сделайте ножницами небольшое отверстие в средней линии.
- Удлините брюшинный разрез до длины разреза кожи, заботясь о том, чтобы оставаться на средней линии (linea alba).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к лапаротомии верхней средней линии брюшной полости. - Поднимите печень с помощью тупых втягивателей, чтобы обнажить общий желчный проток. Зажмите общий желчный проток изогнутым сосудистым зажимом бульдога.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр предотвращает нежелательный вливание в печень.
3. Идентификация сосочков поджелудочной железы и дуоденотомия
- Определите двенадцатиперстную кишку и с помощью щипцов Арруга втягивайте ее каудально, чтобы отобразить сосочек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосочек представляет собой белое пятно на передней поверхности второй части двенадцатиперстной кишки. - Втягиваете двенадцатиперстную кишку каудально, позволяя выявить течение протока поджелудочной железы. Иглой 301/2 калибра проколоть стенку двенадцатиперстной кишки по касательной, прямо напротив сосочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна следовать тому же углу, что и проток, когда она входит в двенадцатиперстную кишко.
4. Настой.
- Пропустите катетер через дуоденотомию, созданную на этапе 3.2, пока катетер не будет виден в протоке. Выдвигайте катетер в проток не более чем на 1 см, чтобы предотвратить обход второстепенных протоков притоков.
- Зажмите катетер на месте вторым изогнутым сосудистым зажимом бульдога. Включите насос и влийте выбранный объем. Объем инфузии может варьироваться от 25 до 250 мкл, с идеальным объемом приблизительно 150 мкл.
- Ввести внутрибрюшинную инъекцию примерно 1,5 мл физиологического раствора, чтобы компенсировать потери. Накройте открытый кишечник влажной марлей, чтобы предотвратить высыхание.
- В конце инфузии снимите зажим бульдога, который удерживал катетер на месте. Используйте зажим бульдога, чтобы аккуратно удалить катетер из протока поджелудочной железы. Отпустите зажим из общего желчного протока.
- Закройте брюшину и кожу в один или два слоя с помощью бегущего шва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости закрывать дуоденотомию, так как она будет герметизироваться сама по себе. - В качестве послеоперационной анальгезии вводят дозу кетофена в 5 мг/кг во время процедуры и одну на следующий день.
- Верните мышь в клетку под тепловой лампой, пока она не восстановится. Обеспечьте мышь пищей и водой ad libitum.
- Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудины. Не возвращайте животное, перенесшего операцию, в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет.
5. Пробоподготовка
- Поместите животное в углекислотную камеру или выполните вывих шейки матки.
- Соберите поджелудочную железу, с селезенкой, печенью и двенадцатиперстной кишки в качестве контрольной. Зафиксируйте ткани в параформальдегиде на ночь при 4 °C. Криозащита образца в 30% сахарозы на ночь, как описаноранее 6.
- Заморозьте образцы. Срез ткани толщиной 6 мкм с помощью микротома. Выполняют визуализацию на микроскоп с флуоресцентной визуализацией, как описаноранее 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При практике и тщательной хирургической технике выживаемость этих мышей должна быть больше 95%. Через неделю после инфузии желаемый эффект должен проявляться в поджелудочной железе. Мышей в возрасте от 10 до 12 недель использовали для инфузий протоков поджелудочной железы. Здесь мы используем аденоассоциированный вирус серотипа 8 (AAV8) с промотором ЦМВ для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) по сравнению с фиктивной операцией. Поджелудочную железу мышей собирали через 7 дней после инфузий. Участки поджелудочной железы, селезенки и двенадцатиперстной кишки окрашивали антителами к инсулину и Хештом. Рисунок 1 показывает, что существует обширная экспрессия GFP по всей поджелудочной железе у мышей, которые подверглись инфузии протоков поджелудочной железы с AAV8, в отличие от тех, кто перенес фиктивную операцию. У этих мышей нет экспрессии в печени, селезенке или двенадцатиперстной кишки, что документирует селективный характер инфузии. Эти данные могут быть подтверждены несколькими другими методами, включая профили экспрессии ДНК и РНК.
Рисунок 1. Экспрессия GFP после инфузии протоков поджелудочной железы. (a) Фиктивная хирургия по сравнению с (b) инфузией протоков поджелудочной железы с экспрессией GFP AAV8. Шкала представляет собой 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе подробно описывается методология инфузии протоков поджелудочной железы, эффективная мышиная модель для доставки генов и других молекул конкретно и эффективно в поджелудочную железу. Неоднозначность в специфике процедуры между различными группами высветила необходимость стандартизированного протокола8,9,10.
Существует несколько критических этапов процедуры, начиная с отбора молодых, здоровых мышей. Перфорация двенадцатиперстной кишки, каким бы маленьким и контролируемым она ни была, является травматическим событием у мыши, которое, несомненно, приводит к набору воспалительных цитокинов и других факторов, которые не были полностью охарактеризованы. Поэтому деликатное рассечение имеет решающее значение, как и создание наименьшей дуоденотомии, возможной для введения катетера. Важнейшим этапом всей процедуры является канюляция протока поджелудочной железы с помощью системы родоразрешения.
Трудности могут возникнуть при чрезмерном нарушении работы сосочков поджелудочной железы, приводящих к подавляющей системной воспалительной реакции. Поджелудочная железа является тонким органом; в хирургическом сообществе он в разговорной речи описывается как орган, с которого не нужно «возиться». Показатели успеха будут варьироваться лишь незначительно в зависимости от уровня квалификации практикующего. До тех пор, пока желчный проток должным образом закупоривается, инфузия будет на 100% специфична только для поджелудочной железы.
Кривая обучения для процедуры довольно крутая, и основное ограничение преодолевается практикой. Как уже говорилось ранее, чрезмерные манипуляции с двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железой могут привести к подавляющей воспалительной реакции, которую необходимо избегать.
Процедура имеет широкое применение во многих различных дисциплинах. Он может быть использован в качестве метода для целевой доставки генов с использованием специфических вирусных векторов11. Процедура также может позволить специфическую инфузию молекул, которые помогают в выяснении функции клеток поджелудочной железы. Специфическая доставка определенных молекул является привлекательным методом модификации сигнальных путей внутри островков для получения пролиферации12. Система также может ликвидировать необходимость трансгенного разведения путем непосредственного производства желаемого генотипа и фенотипа в поджелудочной железе. Приложений бесчисленное множество.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
У авторов нет подтверждений. Финансирование было получено от Фонда Комиссии по здравоохранению и планированию семьи провинции Чжэцзян (грант 20146242) и Фонда Научно-технического бюро Вэньчжоу (грант Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
