Summary
Infusion af pancreaskanal er en vigtig teknik, der kan give mulighed for afstamningssporing, genintroduktion og cellelinjespecifik målretning. En pancreas kanal infusion teknik til narkotika og viral levering til bugspytkirtelceller præsenteres her.
Abstract
Bugspytkirtlen er et bifunktionelt organ med både endokrine og exokrine komponenter. En række patologier kan ramme bugspytkirtlen, herunder diabetes, pancreatitis, og kræft i bugspytkirtlen. Alle tre af disse sygdomme markerer aktive studieområder, ikke kun for at udvikle øjeblikkelig terapi, men også for bedre at forstå deres patofysiologi. Der er kun få værktøjer til at fremme disse studieområder. Infusion af pancreaskanal er en vigtig teknik, der kan give mulighed for afstamningssporing, genintroduktion og cellelinjespecifik målretning. Teknikken kræver indviklede dissektion af den anden del af duodenum og ampulla, efterfulgt af okklusion af galdegangen og kannulation af bugspytkirtelkanalen. Selvom teknikken er teknisk udfordrende i starten, er applikationerne utallige. Tvetydigheden i de særlige forhold i proceduren mellem grupperne understregede behovet for en standardprotokol. Dette arbejde beskriver udtrykket af en grøn fluorescerende protein (GFP) i bugspytkirtlen efter bugspytkirtlen infusion af en viral vektor udtrykke GFP versus en fingeret kirurgi. Infusionen og derfor udtrykket er specifikt for bugspytkirtlen, uden udtryk til stede i nogen anden vævstype.
Introduction
Bugspytkirtlen er et bifunktionelt organ, med både endokrine og exokrine komponenter. En række patologier kan ramme bugspytkirtlen, herunder diabetes, pancreatitis, og kræft i bugspytkirtlen1. Alle tre af disse sygdomme markerer aktive studieområder, ikke kun for at udvikle øjeblikkelig terapi, men også for bedre at forstå deres patofysiologi.
En målrettet terapeutisk leveringsmetode ville være gavnlig. Vi har udviklet en pancreas kanal infusion teknik, der er en effektiv og selektiv metode til medicin og viral levering til bugspytkirtelceller. I denne model, bugspytkirtelkanalen er selektivt cannulated, og den fælles galdegangen er okkluderet, giver mulighed for levering udelukkende til bugspytkirtlen.
Denne teknik kan give mulighed for afstamning sporing af specifikke celletyper til yderligere at belyse de udviklingsmæssige veje er vigtige for bugspytkirtel udvikling og patologi2,3. Forskellige promotorer i virale vektorer giver mulighed for specifik målretning af cellelinjer og for indførelse af gener i disse cellelinjer4,5. Dette arbejde viser udtryk for en grøn fluorescerende protein (GFP) i bugspytkirtlen efter pancreas kanalen infusion af en viral vektor udtrykke GFP versus en fingeret kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Research and Care Committee på Children's Hospital i Pittsburgh og University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Præoperativ forberedelse
- Indadministrer inhaleret isofluran (1 - 3% til vedligeholdelse og op til 5% til induktion) via en næsekebeke til et passende bedøvelsesniveau. Overvåg tilstrækkeligheden af anæstesi ved tå knivspids med pincet. Manglen på en reaktion anses for tilstrækkelig, og sørg for ikke at overmedicinere, da respirationsdepression kan forekomme.
- Placer dyret på ryggen på dissekerende mikroskopstadie, med maven centreret i betragtning af målet. Immobiliser dyret med kirurgisk tape. Påfør oftalmisk salve på dyrets øjne for at forhindre tørhed under bedøvelse.
- Påfør et glat, tykt lag hårfjerningscreme og lad det være på plads i 3 minutter. Tjek et lille område for hårfjerning. Tør forsigtigt fløde og hår af med 70% ethanol-gennemblødt gaze.
- Rens og desinficer dyrets underliv ved at tørre det med en 70% ethanol-gennemblødt gaze efterfulgt af en betadine-gennemblødt gaze. Opretholde sterile forhold under hele den kirurgiske procedure.
2. Korrekt eksponering
- Lav en midterlinje snit i huden fra xyphoid processen til navlestrengen ved hjælp af en skalpel. Løft bughinden med Adson pincet og lav et lille hul i midterlinjen ved hjælp af en saks.
- Udvid peritoneal snittet til længden af hudens snit, idet man sørger for at forblive på midterlinjen (linea alba).
BEMÆRK: Dette vil producere en øvre midline abdominal laparotomi. - Løft leveren med stumpe retractorer for at udsætte den fælles galdegang. Klem den almindelige galdegang med en buet bulldog vaskulær klemme.
BEMÆRK: Denne manøvre forhindrer uønsket infusion i leveren.
3. Identifikation af pancreas Papilla og Duodenotomy
- Identificer duodenum og, med Arruga pincet, trække det kaudalet at vise papilla.
BEMÆRK: Papillen er en hvid plet på den forreste overflade af den anden del af duodenum. - Træk duodenum caudally, giver mulighed for identifikation af løbet af bugspytkirtlen kanalen. Med en 301/2-gauge nål, punktere væggen i duodenum tangentielt, lige overfor papilla.
BEMÆRK: Nålen skal have samme vinkel som kanalen, når den kommer ind i duodenummet.
4. Infusion.
- Kateteret føres gennem den duodenotomi, der blev oprettet i trin 3.2, indtil kateteret er synligt i kanalen. Fremryk kateteret ind i kanalen ikke mere end 1 cm for at forhindre bypass af mindre duktil bifloder.
- Klem kateteret på plads med en anden buet bulldog vaskulær klemme. Tænd for pumpen, og indgyd den valgte lydstyrke. Det infunderede volumen kan variere fra 25 - 250 μL med et ideelt volumen på ca. 150 μL.
- Der gives en intraperitoneal injektion på ca. 1,5 mL saltvand for at kompensere for tab. Dæk den udsatte tarm med en fugtig gaze for at forhindre udtørring.
- Ved afslutningen af infusionen skal du fjerne bulldogklemmen, der holdt kateteret på plads. Brug bulldogklemmen til forsigtigt at fjerne kateteret fra pancreaskanalen. Slip klemmen ud af den almindelige galdegang.
- Luk bughinden og huden i et eller to lag ved hjælp af en løbende sutur.
BEMÆRK: Der er ingen grund til at lukke duodenotomien, da den vil forsegle af sig selv. - Som postoperativ analgesi gives en dosis ketofen ved 5 mg/kg under proceduren og en den følgende dag.
- Vend musen tilbage til buret under en varmelampe, indtil den kommer sig. Giv musen mad og vand ad libitum.
- Forlad ikke dyret uden opsyn, før det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Returner ikke et dyr, der er blevet opereret, til selskab med andre dyr, før det er fuldt genoprettet.
5. Prøveforberedelse
- Placer dyret i et kuldioxidkammer eller udfør cervikal dislokation.
- Høst bugspytkirtlen, med milten, leveren, og duodenum som kontrol. Vævene fastgøres i paraformaldehyd natten over ved 4 °C. Kryobeskytter prøven i 30% saccharose natten over, som tidligere beskrevet6.
- Fastfrys prøverne. Vævet afsnitsstudent i en tykkelse på 6 μm ved hjælp af en mikrotome. Udfør billeddannelse på et mikroskop med fluorescensbilleddannelse, som tidligere beskrevet7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med praksis og omhyggelig kirurgisk teknik skal overlevelsesraten for disse mus være større end 95%. En uge efter infusion, den ønskede effekt bør være tydelig i bugspytkirtlen. Mus i alderen 10 til 12 uger blev brugt til indføring i bugspytkirtlen. Her bruger vi en adeno-associeret virus serotype 8 (AAV8) med en CMV promotor til at udtrykke grønne fluorescerende protein (GFP), i forhold til en fingeret kirurgi. Mus bugspytkirtel blev høstet 7 dage efter infusionerne. Dele af bugspytkirtlen, milt, og duodenum blev plettet med insulin antistof og Hoescht. Figur 1 viser, at der er omfattende udtryk for GFP i hele bugspytkirtlen i de mus, der gennemgik pancreas kanal infusion med AAV8, i modsætning til dem, der gennemgik fingeret kirurgi. Der er intet udtryk i leveren, milten eller duodenum i disse mus, hvilket dokumenterer infusionens selektive karakter. Disse data kan bekræftes med flere andre metoder, herunder DNA- og RNA-udtryksprofiler.
Figur 1. Udtryk for GFP efter pancreas duct infusion. (a) Sham kirurgi i forhold til (b) pancreas kanal infusion med AAV8 udtrykke GFP. Skalalinjen repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver i detaljer metoden bag bugspytkirtelkanal infusion, en effektiv mus model for levering af gener og andre molekyler specifikt og effektivt til bugspytkirtlen. Tvetydighed i de særlige forhold i proceduren mellem forskellige grupper understregede behovet for en standardiseret protokol8,9,10.
Der er flere kritiske trin i proceduren, begyndende med udvælgelsen af unge, sunde mus. Perforering af duodenum, uanset hvor lille og kontrolleret, er en traumatisk begivenhed i musen, der utvivlsomt fører til rekruttering af inflammatoriske cytokiner og andre faktorer, der ikke er helt karakteriseret. Derfor er en delikat dissektion afgørende, ligesom det skaber den mindste duodenotomi, der er mulig for indførelsen af kateteret. Det vigtigste trin i hele proceduren er kannulationen af bugspytkirtelkanalen med leveringssystemet.
Vanskeligheder kan opstå med overdreven forstyrrelse af bugspytkirtlen papilla, hvilket fører til en overvældende systemisk inflammatorisk reaktion. Bugspytkirtlen er et delikat organ; i det kirurgiske samfund, er det i daglig tale beskrives som et organ ikke at "rode" med. Succesraten vil kun variere en smule med praktiserende læge færdighedsniveau. Så længe galdegangen er korrekt okkluderet, vil infusionen være 100% specifik for bugspytkirtlen alene.
Indlæringskurven for proceduren er ret stejl, og den vigtigste begrænsning overvindes med praksis. Som tidligere nævnt kan overdreven manipulation af duodenum og bugspytkirtel føre til en overvældende inflammatorisk reaktion, der skal undgås.
Proceduren har bred anvendelighed på tværs af mange forskellige discipliner. Det kan bruges som en metode til målrettet genlevering ved brug af specifikke virale vektorer11. Proceduren kan også give mulighed for specifik infusion af molekyler, der støtte i belysningen af pancreas cellefunktion. Den specifikke levering af visse molekyler er en tiltalende metode til ændring af signalvejene i holmene for at producere spredning12. Systemet kan også undgå behovet for transgen avl ved direkte at producere en ønsket genotype og fænotype i bugspytkirtlen. Ansøgningerne er utallige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser. Der blev modtaget støtte fra Foundation of Health and Family Planning Commission of Zhejiang Province (Grant 20146242) og Foundation of Wenzhou Science &Technology Bureau (Grant Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
