Muse Venstre Anterior Faldende (LAD) kranspulsåreombinding: En forbedret og forenklet model for myokardieinfarkt

Abstract

Iskæmisk hjertesygdom (IHD), eller akut koronarsyndrom (ACS), er en af ​​de førende årsager til dødsfald i USA. IHS er karakteriseret ved nedsat blodforsyning til hjertet, hvilket resulterer i tab af oxygen til og den deraf følgende nekrose af hjertemusklen. Den MI model har vundet popularitet for dens brug som en kortsigtet iskæmi-reperfusion model og en langsigtet permanent ligation model. Nedenfor beskriver vi en pålidelig metode til permanent ligering af LAD. Med musen genteknologi bliver mere avancerede, og med en stigende tilgængelighed af kvalitets murine kirurgiske instrumenter, er musen blevet en populær model for MI operationer. Vores kirurgisk model inkorporerer brugen af ​​en let reversibel bedøvelsesmiddel til hurtig genopretning af musen; en minimalt invasiv endotracheal intubation uden at involvere en tracheotomi; og en thoracentesis gennem den oprindelige torakotomi webstedet uden at skabe en yderligere snit i brystet, som ergjort i nogle andre metoder, til effektivt at fjerne overskydende blod og luft fra brysthulen. Denne fremgangsmåde er forholdsvis mindre invasiv end andre metoder, som dramatisk reducerer kirurgiske og post-kirurgiske komplikationer og dødelighed og forbedrer reproducerbarheden.

Introduction

Koronarsygdom eller ACS, er den mest udbredte kardiovaskulær hændelse og vil blive anset for den vigtigste årsag til morbiditet og mortalitet i hele verden i 2020 ^1. Årsagen til ACS er tilstedeværelsen af en myocardial thrombose på grund af brud på en koronar aterosklerotisk plak, der blokerer eller reducerer blodtilførslen til hjertet væv ^2. Derfor er der kliniske tegn på forekomst af akut myocardieiskæmi, såsom myokardieinfarkt (MI) ^{3, 4.} MI fører til et tab i masse af cardiomyocytter og en progression til patologisk ventrikulær remodellering, hvilket kan føre til ventrikulær dysfunktion og hjertesvigt ^{5, 6.}

En af de mest effektive måder at studere IHD har været at efterligne human myokardieinfarkt i en dyremodel. Dette opnås ved at okkludere LAD imus. Ved hjælp af denne model, vi undersøge, hvordan hjertet kan beskyttes mod de skader som følge af IHS.

I det seneste årti har forskere flyttet fra anvendelse af større dyremodeller til mindre dyr, herunder overgangen fra rotter til mus. Den mindre musemodel er begyndt at foretrække af mange årsager, herunder deres lille størrelse, stor kuldstørrelse, billige at vedligeholde, og korte drægtighedsperioden, såvel som for den ekspansive tilgængelighed af transgene og gen-knockout modeller ^7. Selvom mus er små i størrelse, har nye kirurgiske instrumenter specielt designet til dem hjulpet i denne udvikling. Vores metode udnytter disse nye kirurgiske instrumenter.

Mens flere metoder gennemfører en invasiv trakeostomi, bruger vi en mindre invasiv metode til endotracheal intubation. Ved hjælp af overhead-belysning af oropharynx, vi intubere uden at skabe nogen indsnit, der giver en mere sikker og mindre traumatisk oplevelse for than dyr. Musen anbringes derefter i respirator og blev ved isofluran under hele proceduren. På grund af den korte varighed af anæstesi produceret af lægemidlet, det tager kun et par minutter for dyret at komme sig efter bedøvelsen, når den er afbrudt. Vores kirurgisk model indeholder også en minimalt invasiv thoracentesis. Den omhyggelige fjernelse af blod og overskydende luft fra brysthulen under anvendelse thoracentesis gennem den oprindelige torakotomi indsnit har rettet en fælles postoperativ komplikation af LAD ligering: spændingen pneumothorax. Denne fremgangsmåde, som eliminerer behovet for de to ekstra indsnit anvendes i andre fremgangsmåder-en for trakeostomi og en anden for de thoracentesis-har gav færre postoperative komplikationer og har drastisk reduceret dødelighed.

Protocol

Dette dyr protokol er blevet gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Rhode Island Hospital.

1. Anæstesi og intubation

1. Vejer musen til at beregne dosen af ​​postoperativ smerte medicin.
2. Placer musen i en induktion kammer og levere 4% isofluran i 9 - 10 min, overvågning dyret i hele. Tænde en varm perle sterilisator således at apparatet kan forvarmes til ca. 250 ° C. Forvarmning vil tage 15 - 20 minutter.
3. Når musen når en dyb plan af anæstesi, med en vejrtrækning hastighed på ca. 32 vejrtrækninger / min, placeres musen på ryggen på en Styrofoam medføre og anvende et elastisk bånd er fastgjort under de bedste fortænder til at holde munden åben. Bekræft sedering ved at udføre en tå knivspids. Placere en høj intensitet illuminator over musen så oropharynx kan visualiseres.
4. Brug buede pincet til at åbne kæben og et andet parpincet til at løfte tungen ud af vejen. Vær sikker på at intubere mens placeret i eller lige under øjenhøjde med kroppen af ​​musen. Det anbefales at bruge af kirurgiske lupper.
5. Visualiser åbning og lukning af stemmebånd. Når de er åbne, indsætte en 20-gauge, 1-i intravenøs (IV) kateter med en stump spids nål indføreren. Brug nålen til at lede katetret til tracheal åbning, men undgå at indsætte nålen ind i luftrøret. Verifikation af korrekt placering kan gøres ved hjælp af en plastikoverførselspipette.
6. Overføre intuberet mus til en arbejdsflade udstyret med en opvarmningsindretning. Tilslut musen til en lille gnaver ventilator indstillet til et slagvolumen på 150 pi / slag og et slagtal på 130 slag / min.
7. Levere 2,5% isofluran. Kontroller, at intubation ved at kontrollere for bilateral bryst stige. Bekræft anæstesi ved at udføre en tå knivspids. Musen kan få brug 5 - 10 min på ventilatoren kan blive fuldt bedøvet.

1. Bånd ned intubationsrøret på tilslutningsstedet mellem ventilatoren og IV-kateter. Tape ned ekstremiteterne. Placer sterile smørende dråber på øjnene.
2. Trim den ventrale venstre side af brystkassen med en elektrisk barbermaskine. Støve barberede pels med tørservietter og anvende en lille lag af hårfjerning fløde anvendelse af en steril vatpind. Cremen bør forblive i kontakt med hårsækkene til cirka 30 - 45 s.
3. Mens de fløde processer sted tre sterile vatpinde i tre 1,5 ml rør fyldt med Betadine gennemvæde. Anvendelse klude fugtet med destilleret vand, forsigtigt tørre væk fløde og pels.
4. Rengør kirurgiske område tre gange, skiftevis Betadine og sterile 70% isopropanol prep puder, rengøring i en cirkulær bevægelse flytter fra centrum til periferien. Placer en steril drapere med en kvart størrelse hul over kirurgiske område med musen.
5. Rens området omkring mouse med 70% ethanol. Kontroller anæstesi endnu en gang med en tå knivspids.

3. LAD Ligering

1. Placer autoklaverede kirurgiske instrumenter i varmt perle sterilisator forvarmet til 250 ° C i ca. 20 s. Placer de steriliserede instrumenter steril autoklaverede kirurgisk afdækningsstykke. Don kirurgiske handsker.
2. Brug fint-tip pincet til forsigtigt at løfte huden på et punkt ca. 5 mm til venstre for fremtrædende formet som et sværd brusk. Brug en kirurgisk skalpel med en nr 10 kniv til at oprette en lodret snit i huden fra dette punkt opad, til det niveau af manubrium.
3. Brug buede pincet til forsigtigt at adskille huden og musklen lag. Åbn muskel lag, efter huden indsnit. Sæt to 5-0 polypropylensuturer gennem musklen lag, en på hver side af snittet, og fastgør suturerne midlertidigt med klemmer til at holde muskellaget åben.
4. Identificere og gøre et snit i den tredje interkostalrum efternaturlig vinkel brystkassen. Fjern tapen fra den venstre yderpunkterne af mus og sikre sin venstre bageste fod til sin ret bageste fod med tape. Skær et længere stykke tape og sikre sin forreste venstre fod til operativsystemet overflade i en lidt forhøjet position. Rengør handsker med 70% ethanol.
5. Brug en retraktor til forsigtigt at adskille ^3. og ^4. ribben. Skær en lille del af steril gaze, ca. 1 i x ½ i, og dyppe den i sterilt 0,9% saltvand. Pres overskydende saltopløsning og bruge pincet til forsigtigt indsætte gaze mod venstre lunge at forhindre utilsigtet lungeskade under proceduren.
6. forsigtigt fjerne den tynde pericardium med pincet.
7. Rive en lille mængde af bomuld fra en steril vatpind og rul den ind i en lille kugle. Dyp dette vat i sterilt 0,9% saltvand og aftør forsigtigt over overfladen af ​​hjertet at værdsætte arterierne. Skub forsigtigt venstre forkammer opad og find kranspulsårerne underneath.
8. Identificere LAD og bestå en 8-0 nylonsutur under LAD; komplet to kast at sikre ligering. Hvis ligering er vellykket, venstre hjertekammer fjernt fra ligatur vilje blanchere.
9. Med pincet, fjern gaze indsat tidligere, og derefter forsigtigt fjerne retraktoren. Indsætte en 6-i, 25-gauge fleksibelt rør fastgjort til en 25-gauge kanyle i brysthulen gennem torakotomi åbning. Advance ca. 1 - 2 ud i af slangen i rummet over venstre lunge. Retur musen til rygleje og rengør handsker med 70% ethanol.
10. Bruge 5-0 polypropylensuturer på en enkel afbrudt mønster at lukke brystkassen, holde brystrør på plads. Fjern de to suturer holder musklen lag åben. Bruge 5-0 polypropylensuturer på en enkel kontinuerligt mønster at lukke musklen lag, igen holde brystrør på plads.
11. Vedhæfte en 1-ml sprøjte til 25-gauge nål på brystet røret. Træk forsigtigt opad på springetr samtidig gradvis ekstrahere brystrør fra brysthulen med pincet. Udtrække røret langsomt, da dette trin fjerner overskydende luft og blod, som ellers ville blive fanget i brysthulen og resulterer i en pneumothorax.
12. Når sprøjten er fyldt, frigøres sprøjten fra kanylen og bortskaffe affaldet i et spild bæger eller vask. Fortsæt denne proces, indtil brystet røret er fuldstændigt udtrukket. Sikre, at brystet tæt forseglet.
13. Formindske isofluran til 1,5%. Luk huden med 4-0 polypropylen suturer i en enkel afbrudt mønster. Drej isofluran fordamper fra.
14. Administrere 0,1 mg / mL buprenorphin i 0,9% saltvand via en intraperitoneal (IP) injektion. Topisk anvendelse 2 mg / ml Lidocain med 2 mg / ml Bupivacain i 0,9% saltvand til snittet. Administrere mellem 200 - 500 pi 0,9% saltvand via en subkutan injektion, skalering saltvandet beløb til vægten af ​​musen.
15. Vent 5 minutter efter administering af smertestillende medicin for at fjerne musen fra intubationsrøret. Dette hjælper i overgangen fra respiratoren.
    1. Hvis musen ikke har en bilateral brystkassen hæver gang fra respiratoren, udføre nål dekompression. For at gøre dette, indføre en 25-gauge steril nål og en 1-ml sprøjte mellem ^3. og ^4. ribben, indtil den træder brysthulen, betegnet med et pludseligt fald i modstand. Træk forsigtigt i stemplet for at fjerne overskydende luft.
16. Når musen viser en tilstrækkelig bilateral vejrtrækning og dybde og reagerer på en tå knivspids, placeres musen i en ren opsving bur under en varmelampe. Give musen med fugtig mad og en vandflaske, overvågning i en laminær strømning i 15 - 20 min. Overvåg for en overdreven vejrtrækning indsats, voldsom blødning, eller andre potentielt livstruende komplikationer.
17. For de næste tre dage, administrere 0,1 mg / ml buprenorphin smertestillende medicin via en IP ijection to gange dagligt. Overvåg musen dagligt.

Representative Results

Musene aflives otteogtyve dage efter operationen, og hjerterne høstes og undersøges. Musene bedøves med 50 - 75 mg / kg ketamin og 5 - 10 mg / kg xylazin. Når dyret er under tilstrækkelig anæstesi brysthulen åbnet, og anvendelse af en 23-gauge nål, er kold kaliumchlorid (KCI, 30 mM) injiceret i den posteriore basale region af hjertet. Hjertet er anholdt i diastolen. For yderligere validering af ligering hjertet fjernes fra dyret og injiceres med 4% paraformaldehyd og dernæst 1% Evans Blue-farvestof. Figur 1 viser manglen på Evans Blue i den iskæmiske venstre ventrikel. Figur 2 viser en ordentlig endotracheal intubation setup. Figur 3 viser placeringen af brystet rør til thoracentesis i den indledende incisionsstedet, med muskellaget sutureres lukket omkring røret før luftudsugning fra chest hulrum. Trichromfarvning viser en stigning i collagen i infarktområdet region (figur 4).

Figur 1: Evans Blå Injection. Den Evans Blå injektion afslører en mangel på farvestof i iskæmisk væv, lokaliseret til venstre hjertekammer infarkte region. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: endotrakeal intubation. Demonstration af en ordentlig endotrakeal intubation opsætning. Operatøren, iført kirurgiske lupper, sidder i øjenhøjde med musen. En høj intensitet illuminator er fokuseret nedad på den tracheale region, gennemlysende oropharynx. Et elastisk bånd er hægtet bag de øvre fortænder, så føreren at åbne munden med de buede pincet. De buede pincet bruges til at holde tungen til siden for klar visualisering. En intravenøs kateter intubationskanyle med en stump-spids nål indføreren fremføres på en lidt opad, mens åbning og lukning af stemmebånd visualiseres. Visualisering af stemmebånd åbner og lukker før intubation forsøg er en af ​​de kritiske punkter for en vellykket intubation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Thoracentesis. Placering af brystet tube til thoracentesis, indsat i den oprindelige indsnit site. Muskellaget syes lukket omkringrøret før luften i brysthulen ekstraheres med en sprøjte, og derefter brystet røret fjernes. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: trichromfarvning. Venstre panel: Kontrol, ikke-LAD-ligeret hjerte. Right panel: LAD-ligeret, infarkte hjerte. Trichromfarve (Masson) anvendelse Biebrich scarlet-syre fuchsin opløsning, phosphowolframsyre / phosphormolybdensyre opløsning, og anilin blå afslører øget kollagen (blå) som markør for fibrose i tværsnit venstre ventrikel med infarkt region. Bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Med en stigende anvendelse af MI modellen i laboratorier, søger den beskrevne procedure til at øge effektiviteten og overlevelsesraten for musene samtidig minimere deres postoperative smerter og ubehag. Denne protokol tilstræber at minimere dødeligheden ved at gøre en lang række forbedringer af forskellige aspekter af LAD ligation procedure. Der er et par forskelle. Nogle murine intubation undersøgelser, der udnytter ketamin og xylazin sammen med isofluran til induktion på grund gavn for deres længere varighed af anæstesi, har vist øget dødelighed ^8. Vores metode anvender kun isofluran til induktion, hvilket reducerer potentialet for narkotikarelaterede komplikationer. En anden lignende LAD underbinding protokol indbefatter en tracheotomi, der producerer en forlænget restitutionstid og et øget behov for præcis træning ^9. Den procedure, vi beskriver her anvender en ikke-invasiv metode til endotracheal intubation, hvilket resulterer i lower dødelighed og højere reproducerbarhed af resultaterne. Også, snarere end kun at bruge en elektrisk barbermaskine, vores proceduren anvendes også hårfjerning creme til pels fjernelse, hvilket giver en fuldstændig klar visualisering af det sterile område i mindre end 1 min.

En anden væsentlig forskel er repositionering af mus, som forekommer efter, snarere end før, de indledende indsnit. Gør indskæringerne mens musen er rygliggende giver mulighed for en mere direkte og præcis visualisering af landmærker som f.eks formet som et sværd brusk, hvilket således resulterer i højere reproducerbarhed af resultaterne. Vores metode bruger også sterile vatpinde snarere end en Cauter til blødende ledelse, faldende iatrogene brandskader og risikoen for infektion. Bortset fra disse forskelle, brystet rør indsættelse for thoracentesis er især bemærkelsesværdigt, da vores metode ikke indebærer oprettelse af en ny snit til røret. Tværtimod, det indebærer indsættelse røret i en tidligere snit, igen faldende mortalitet. Den procedure, vi beskriver også indbefatter: (1) anvendelse af en retraktor, der muliggør en mere nøjagtig og stabil visualisering af kranspulsårerne; (2) indsættelse af steril gaze ind i brysthulen under proceduren, hvorved risikoen for iatrogene lungeskader; og (3) administration af saltvand følge fremgangsmåden, der er blevet vist at både forkorte restitutionstiden og forhindre hypotermi.

Selvom vi beskrive en permanent ligation model, kan denne procedure også ændres til en akut MI-model. Den akutte MI model, også beskrevet som iskæmi og reperfusion, henviser til 30 - 60 min iskæmi efterfulgt af reperfusion i hjertevævet ^7. En alternativ fremgangsmåde til at vurdere infarktstørrelsen eller risikoområdet efter iskæmi og reperfusion er farvningen af 2% triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) ^10. TTC farvning er baseret på evnen til at farve levedygtigt væv efter iskæmisk insultgrundet dehydrogenaser stede i hjertevæv. Disse enzymer omdanner en opløselig komponent til en uopløselig rød komponent, hvorved afgrænser infarktområdet område ^11. Den akutte MI model kan efterligne de mekanismer, der forekommer i human hjertesygdom og kan således være et nyttigt redskab til at belyse begivenhederne i myokardieiskæmi ^10. LAD ligering kan verificeres ved at observere en øjeblikkelig ændring i væv farve, giver en fordel for denne fremgangsmåde til at inducere et MI. En anden metode til at kontrollere for en vellykket ligation er brugen af ​​elektrokardiogram, selv om dette indebærer brug af dyrt udstyr, og kan ikke være muligt for alle laboratorier.

Som beskrevet ovenfor er der flere nemme og billige molekylære teknikker til at bekræfte ligeringen efter høst hjertet. De to teknikker, der er vist ovenfor, er Evans blå farvning og trichromfarvning. Evans Blå farvestof injiceres direkte ind i buen af ​​AORTA, viser, hvor der er mangel på blodgennemstrømning. Dette er en hurtig og effektiv metode, der anvendes umiddelbart efter høst hjertet til at teste, om modellen var en succes, og at måle omfanget af koronar blokering. For trichromfarvning, skal hjertet være sektioneret og derefter udsat for immunhistokemi. Trichromfarvning kan indikere post-iskæmiske fibrotiske områder eller hjerte- ramt af kronisk iskæmi. Injektionen af ​​postoperativ mus 2 - 24 t før aflivning med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (edu), en analog til thymidin, er en effektiv metode til at indikere områder af DNA-replikation og celleproliferation efter iskæmi, især i undersøgelser med vaskulær regeneration ^12.

Generelt begrænsningerne af LAD underbinding undersøgelsen omfatter forekomsten af ​​postoperativ dødelighed, primært forårsaget af tilstedeværelsen af ​​hjertearytmier, blødning og pneumothorax. En effektiv thoracentesis, without yderligere bryst indsnit (beskrevet i den nuværende metode), og den korrekte postoperativ pleje er nødvendig for at undgå morbiditet og mortalitet hos dyrene. Den meget omhyggelig monitorering af postoperativ hypotermi er også kritisk. Reduktionen i antallet af hals og bryst indsnit (til tracheotomi og thoracentesis) er beskrevet i den nuværende metode vil hjælpe med at forbedre overlevelseschancerne. Undgåelse af injicerbare præ-operative anæstetika beskrevet heri, vil også forbedre det postoperative forløb af dyrene.

For at opnå høj reproducerbarhed, LAD ligation model kræver grundig uddannelse og erfaring. Skal operatøren udføre flere uger af kirurgi for at få mulighed for at reproducerbar gøre infarkter ved de ønskede steder på hjertet. Uddannelse og erfaring er to kritiske faktorer for en vellykket LAD ligation overlevelse kirurgi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Intensity Light Source	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite Operating Platform	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery.
SurgiSuite LED Lighting Kit	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize.
Small Rodent Anesthesia System	VetEquip Inc.	901810
Isofluorane	Piramal Enterprises	66794-017-10
Buprenorphine	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
Surgical Loupes	Roboz	RS-6687
Small Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	73-0043
Lubricating Drops	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
Electric Razor	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
Hair Removal Cream	Nair
Medical Tape	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
Betadine	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% Isopropanol Wipes	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
Surgical Drapes	Braintree	SP-TS
Surgical Gloves	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8630G
8-0 Nylon Sutures	Fine Science Tools	12051-08
Platinum-Cured Tubing	Harvard Apparatus	72-1042	0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter
0.9% Saline	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8631G
1 CC Syringe with 25-Gauge Needle	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
Scissors	Kent Scientific Corporation	INSS600225
Forceps	Kent Scientific Corporation	INS700100
Cotton Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
IV Catheter, 20-Gauge	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
Retractor	Kent Scientific Corporation	INS 750369
Forceps	Fine Science Tools	11003-12
Dissecting Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 700101
Dissecting Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 700103
Hemostatic Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 750451
Hemostatic Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 750452
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS 700131
Needle Holder	Kent Scientific Corporation	INS 600109
Scissors	Kent Scientific Corporation	INS 600225