Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس بدقة بقاء الخلايا العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات (فدا) والبروبيديوم يوديد (بي) تلطيخ مزدوج في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخ مثقف، ثقافة العصبية الأولية المستخدمة كنموذج في المختبر في علم الأعصاب والبحوث العصبية.

Abstract

المستزرعة الأولية المخيخ الحبيبية وقد استخدمت الخلايا العصبية (كغنز) على نطاق واسع كنموذج في المختبر في علم الأعصاب والبحوث نيوروفارماكولوغي. ومع ذلك، فإن التعايش من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية في ثقافة كغن قد يؤدي إلى التحيزات في تقييم دقيق للالسلامة العصبية. وقد استخدمت فلوريسئين دياسيتات (فدا) و بروبيديوم يوديد (بي) تلطيخ مزدوج لقياس بقاء الخلية عن طريق تقييم في وقت واحد الخلايا القابلة للحياة والموت. استخدمنا فدا-بي تلطيخ مزدوج لتحسين حساسيات المقايسات اللونية وتقييم بقاء الخلايا العصبية في كغنز. وعلاوة على ذلك، أضفنا الأزرق البقع الحمض النووي الفلورسنت (على سبيل المثال، هويشت) لتحسين دقة. يصف هذا البروتوكول كيفية تحسين دقة تقييم بقاء الخلايا العصبية باستخدام هذه الأساليب في ثقافة كغن. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن استبعاد عدد من الخلايا الدبقية باستخدام المجهر مضان. ويمكن تطبيق استراتيجية مماثلة لتمييز غلي غير المرغوب فيهاالخلايا العصبية من الخلايا العصبية في مختلف الثقافات الخلية المختلطة، مثل الثقافة القشرية الأولية والثقافة الحصين.

Introduction

وتستخدم مقايسات السمية اللونية، مثل مقايسة البروميد (3، 4 - 5 - ثنائي ميثيل - 2 - ثيازوليل) 2 - 5 - ثنائي فينيل - 2 - H - تيترازوليوم، لقياس بقاء الخلية في المختبر . المستزرع الأولي المخيخ الحبيبية الخلايا العصبية (كغنز) من الفئران حساسة لمختلف السموم العصبية، بما في ذلك 1-ميثيل -4-فينيل بيريدينيوم أيون، بيروكسيد الهيدروجين، والغلوتامات 1 ، 2 . لذلك، يمكن استخدام الثقافات كغن كنموذج في المختبر في مجال علم الأعصاب. قد تحتوي الثقافات كغن على مجموعة متنوعة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، والتي يمكن أن تمثل حوالي 1٪ من مجموع الخلايا في ثقافة كغن. ومع ذلك، تستجيب الخلايا الدبقية بشكل مختلف للسموم العصبية بالمقارنة مع الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى التحيز في بقاء الخلايا العصبية يقاس المقايسات اللونية 3 .

في خلايا قابلة للحياة، فلوريسئين دياسيتات (فدا) يمكن تحويلها إلى فلوريسئين من قبل إستيراس.بروبيديوم يوديد (بي) يمكن أن تتفاعل مع الحمض النووي بعد اختراق الخلايا الميتة ويمكن استخدامها للإشارة إلى موت الخلايا المبرمج داخل الثقافة. لذلك، يمكن فدا-بي تلطيخ مزدوج يمكن تقييم خلايا قابلة للحياة والخلايا الميتة في وقت واحد، مما يشير إلى أن بقاء الخلية يمكن قياسها بشكل أكثر دقة من خلال الجمع بين كل من الأساليب اللونية. وعلاوة على ذلك، عن طريق إضافة هويشت، وصمة عار الفلورسنت الأزرق للنوى، ودقة بقاء الخلية يمكن زيادة تحسين. بروتوكول المعروضة هنا يصف فدا-بي تلطيخ مزدوج و فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي، والتي يمكن استخدامها لتحليل بدقة جدوى الخلايا العصبية في كغن مثقف الابتدائي.

هذا البروتوكول يستفيد من تصور والتمييز كغنز والخلايا الدبقية من قبل أحجامها والأشكال المختلفة. بعد تلطيخ، يتم حساب أعداد الخلايا العصبية القابلة للحياة والخلايا العصبية الميتة من الصور التي تم التقاطها من قبل المجهر الفلورسنت. وتستبعد الخلايا الدبقية الكبيرة الحجم بمقارنة نماذج كغن النموذجية tأكين تحت وضع الفلورسنت مع تلك التي اتخذت تحت وضع النقيض المرحلة. ويمكن إجراء استراتيجية مماثلة لقياس بقاء الخلايا العصبية في الخلايا الخلوية المختلطة التي تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، مثل الثقافات القشرية الأولية والثقافات الحصين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (منشورات نيه رقم 80-23، المنقحة 1996)، ووافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) في جامعة نينغبو (نينغبو) SYXK-2008-0110).

1. إعداد الحلول والثقافة وسائل الإعلام

ملاحظة: الكواشف والأسهم تحتاج إلى أن تكون مستعدة في ظل ظروف معقمة. تعقيم عن طريق تصفية باستخدام فلتر مع حجم المسام من 0.22 ميكرون.

  1. إعداد بولي L- يسين (بل) حل الأسهم بإضافة 5 ملغ من بل إلى 10 مل من الماء المقطر المزدوج (د 2 O). تعقيم عن طريق التصفية. قسامة وتخزين حل الأسهم بل في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
  2. إعداد العازلة كريبس بإضافة 7.25 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.4 غرام من بوكل، 0.14 غرام من ناه 2 بو 4 ، 2.6 غرام من D- الجلوكوز، و 5.94 غرام من 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثان سلفونيك حمض إلى 100 مل من د 2 </ الفرعية> O. تعقيم عن طريق التصفية. تخزين حل العازلة كريبس في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. إعداد 3.82٪ مغ 2 سو 4 حل بإضافة 3.82 غرام من مغ 2 سو 4 إلى 100 مل من د 2 O. تعقيم عن طريق التصفية. تخزين محلول مغ 2 سو 4 في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
  4. إعداد 1.2٪ كاكل 2 الحل عن طريق إضافة 1.2 غرام من كاكل 2 إلى 100 مل من د 2 O. تعقيم عن طريق التصفية. تخزين محلول كاكل 2 في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
  5. إعداد 2M حل بوكل بإضافة 15 غرام من بوكل إلى 100 مل من د 2 O. تعقيم عن طريق التصفية. تخزين محلول بوكل في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
  6. إعداد حل الأسهم D- الجلوكوز بإضافة 1.8 غرام من D- الجلوكوز إلى 100 مل من د 2 O. تعقيم عن طريق التصفية. قسامة وتخزين حل الجلوكوز D في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  7. إعداد سايتوزين β-D- أرابينوفورانوسيد (آرا- C) الأسهم سولوتأيون بإضافة 0.24 غرام من آرا-C إلى 10 مل من د 2 O. تعقيم عن طريق التصفية. قسامة وتخزين أرا-C حل المخزون في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
  8. إعداد 250 مل من الوسط الاستزراعى (25-30 الجراء) باستخدام 25 مل من مصل بقري الجنين (فبس)، 2.5 مل من الجلوتامين 100x، 2.78 مل من محلول 2M بوكل، و 2.5 مل من المضادات الحيوية 100x في بسال المتوسطة النسر (بمي) . ضبط مستوى الصوت إلى 250 مل وتعقيم عن طريق التصفية.
  9. إعداد 25K المتوسطة باستخدام 2.5 مل من الجلوتامين 100X، 2.78 مل من محلول 2M بوكل، و 2.5 مل من المضادات الحيوية 100X في بمي. ضبط مستوى الصوت إلى 250 مل وتعقيم عن طريق التصفية.
  10. إعداد 5K المتوسطة باستخدام 2.5 مل من الجلوتامين 100X و 2.5 مل من المضادات الحيوية 100X في بمي. ضبط مستوى الصوت إلى 250 مل وتعقيم عن طريق التصفية.
    ملاحظة: وسط الثقافة، 25K المتوسطة، و 5 K المتوسطة تحتاج إلى أن تكون طازجة
  11. إعداد فدا الحل الأسهم عن طريق إضافة 5 ملغ من ادارة الاغذية والعقاقير إلى 1 مل من الأسيتون. تخزين محلول المخزون فدا في 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل. </ لى>
  12. إعداد حل الأسهم بي بإضافة 1 ملغ من بي إلى 1 مل من د 2 O. تخزين حل الأسهم بي في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
  13. إعداد حل الأسهم هويشت بإضافة 5 ملغ من هويشت 33342 إلى 1 مل من د 2 O. تخزين حل الأسهم هويشت في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.

2. إعداد حلول تشريح

ملاحظة: هل هذا 1 د قبل تشريح.

  1. إعداد حل تشريح بإضافة 15 مل من العازلة كريبس، 1.2 مل من 3.82٪ مغ 2 سو 4 حل، و 0.45 غرام من مصل البقر الزلال (بسا) إلى 150 مل من د 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
  2. التسمية 5 × 50 مل أنابيب على النحو التالي: 1، 2، 3، 4، و 5.
  3. وضع 40 مل من محلول تشريح في حقنة 50 مل مع فلتر. تصفية 30 مل من محلول تشريح في أنبوب 1، و 2 مل كل إلى عدة 35 ملم أطباق ثقافة الخلية، والتي سيتم استخدامها لمعالجة الأنسجة.
  4. إلى tأوب 2، إضافة 12.5 ملغ من التربسين في 50 مل من محلول تشريح. مزيج تماما من فورتيكسينغ. تعقيم عن طريق التصفية.
  5. إلى أنبوب 3، إضافة 1.2 ملغ من دناز الأول، 7.8 ملغ من المانع التربسين فول الصويا، و 150 ميكرولتر من 3.82٪ مغ 2 سو 4 حل في 15 مل من محلول تشريح. مزيج تماما من فورتيكسينغ. تعقيم عن طريق التصفية.
  6. إلى أنبوب 4، إضافة 5 مل من الحل من أنبوب 3. إضافة 10.5 مل من محلول تشريح. تعقيم عن طريق التصفية.
  7. إلى أنبوب 5، إضافة 100 ميكرولتر من 3.82٪ مغ 2 سو 4 حل و 15 ميكرولتر من 1.2٪ كاكل 2 الحل في 12.5 مل من محلول تشريح. مزيج تماما من فورتيكسينغ. تعقيم عن طريق التصفية.
  8. تخزين جميع الأنابيب في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.

3. طلاء لوحات ثقافة الخلية

ملاحظة: هل هذا 1 د قبل تشريح.

  1. إضافة 1 مل من محلول الأسهم بل إلى 100 مل من د 2 O (التركيز النهائي: 5 ميكروغرام / مل). معطف من البلاستيك6-جيدا أو 12 جيدا لوحات زراعة الخلايا (2 مل لكل بئر ل 6-جيدا لوحات زراعة الخلايا أو 1 مل لكل بئر لوحات 12 خلية جيدا زراعة) بإضافة 5 ميكروغرام / مل من محلول بولي L- يسين.
  2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 يوم (أو عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة). 1-2 ساعة قبل تشريح، وإزالة الحل باستخدام ماصة. يغسل مرة واحدة مع د 2 O وجافة في هود ثقافة الخلية.

4. معالجة الأنسجة لمدة 8 يوم من العمر سبراغ داولي الفئران.

  1. وضع طبق 100 ملم على الجليد. قطع رأس الجراء الفئران في طبق باستخدام زوج من مقص معقم.
  2. إدراج مقص في الثقبة ماغنوم وقطع الجانبين من الجمجمة، من الأذنين إلى العينين. رفع الجمجمة باستخدام زوج من ملقط. تأكد من أن الدماغ كله هو في الجمجمة. عزل المخيخ ووضعه في طبق 35 ملم المذكورة أعلاه باستخدام زوج من ملقط.
  3. العمل تحت المجهر تشريح. إزالة السحايا والأوعية الدموية مع اثنين من أزواج من ملقط.
  4. ختم الأنسجة مع شفرة. وضع الأنسجة في أنبوب 1. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في رت و 1500 × ز.
  5. نضح طاف. حفظ بيليه.
  6. إضافة الحل في أنبوب 2 إلى بيليه. ريسوسبيند عن طريق هز بلطف.
  7. وضع أنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يهز بلطف كل 3 دقائق.
  8. إضافة الحل في أنبوب 4 لهذا الحل. هزة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في رت و 1500 x ز.
  9. نضح طاف. حفظ بيليه.
  10. إضافة الحل في أنبوب 3 ريسوسبيند بيليه.
  11. إعداد اثنين من 15 مل أنابيب. وضع نصف الخلايا في كل أنبوب. ماصة صعودا وهبوطا 60-70x باستخدام ماصة باستور قطن توصيل لتجانس الخلايا.
  12. إضافة 3 مل من محلول في أنبوب 5 لكل أنبوب 15 مل. السماح لهم الجلوس في رت لمدة 10 دقيقة ثم إزالة بعناية طاف مع ماصة باستور القطن توصيل. وضع طاف في أنابيب 15 مل جديدة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في رت و 1500 × ز.
  13. ايذوب طاف. حفظ بيليه.
  14. إضافة المتوسطة ثقافة في بيليه للحصول على كثافة الخلايا حوالي 1.5 × 10 6 خلايا / مل (حوالي 100 مل ل 10 الجراء).
  15. وضع الخلايا في لوحات الثقافة والثقافة لهم في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .

5. إضافة أرا-C و D- الجلوكوز خلال الثقافات

  1. بعد 24 ساعة، إضافة أرا-C حل المخزون (10 ميكرولتر / جيدا لمدة 12 جيدا لوحات زراعة الخلايا أو 20 ميكرولتر / جيدا لمدة 6 جيدا لوحات زراعة الخلايا؛ التركيز النهائي: 1 ملم) لمنع نمو الخلايا الدبقية.
  2. في يوم 7، إضافة 50 ميكرولتر من محلول الأسهم D- الجلوكوز لكل بئر لمدة 12 جيدا لوحات زراعة الخلايا أو 100 ميكرولتر لكل بئر لمدة 6 جيدا لوحات زراعة الخلايا بحيث تركيز النهائي هو 1 ملم.

6. فدا-بي تلطيخ مزدوج و فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي في ​​الثقافة كغن

  1. إعداد فدا-بي حل العمل بإضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون ادارة الاغذية والعقاقير (تركيز النهائي: 10 ميكروغرام / مل) و 50 ميكرولتر من محلول الأسهم بي (التركيز النهائي: 50 ميكروغرام / مل) في 10 مل من برنامج تلفزيوني. مزيج من فورتيكسينغ ووضع هذا على الجليد.
    1. ل فدا-بي-هويشت حل العمل، إضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون ادارة الاغذية والعقاقير (التركيز النهائي: 10 ميكروغرام / مل)، 50 ميكرولتر من محلول الأسهم بي (التركيز النهائي: 50 ميكروغرام / مل)، و 10 ميكرولتر من حل الأسهم هويشت (تركيز النهائي: 5 ميكروغرام / مل) في 10 مل من برنامج تلفزيوني. مزيج من فورتيكسينغ ووضع هذا على الجليد.
      ملاحظة: طازجة إعداد فدا-بي حل العمل و فدا-بي-هويشت حل العمل فقط قبل الاستخدام.
  2. خذ لوحة ثقافة الخلية من الحاضنة. وضعه على الجليد.
  3. نضح وسط الثقافة واستبدالها مع برنامج تلفزيوني الباردة.
    ملاحظة: يجب أن يتم تغيير الحل ببطء وبعناية. تجنب لمس الخلايا مع نصائح ماصة.
  4. نضح برنامج تلفزيوني الباردة واستبدالها مع الباردة فدا بي أو فدا-بي-هويشت حل العمل (500 ميكرولتر / نحنل 12-جيدا لوحات زراعة الخلايا أو 1 مل / جيدا لمدة 6 جيدا لوحات زراعة الخلايا). ترك على الجليد لمدة 5 دقائق.
  5. نضح فدا-بي أو فدا-بي-هويشت حل العمل وإضافة برنامج تلفزيوني الباردة (100 ميكرولتر / جيدا لمدة 12 جيدا لوحات زراعة الخلايا أو 50 ميكرولتر / جيدا لمدة 6 جيدا لوحات ثقافة الخلية).
    ملاحظة: يجب أن لا يسمح الخلايا لتجف عند التقاط الصور.
  6. التقاط الصور باستخدام المجهر الفلورسنت. استخدام فلتر الإثارة مع تمرير الفرقة من 450 - 490 نانومتر. كشف انبعاثات مضان ل فدا، بي، و هويشست في 520، 620، و 460 نانومتر، على التوالي. تحت نفس الظروف، التقاط صورة تحت الضوء العادي باستخدام وضع النقيض من المرحلة المجهر الفلورسنت.
    ملاحظة: خذ الصور في غضون 15 دقيقة بعد ادارة الاغذية والعقاقير بي أو فدا-بي-هويشت تلطيخ. وقت التعرض هو 100-300 مللي ثانية و الكسب التناظري هو 2.8x.

7. تقييم الجدوى العصبية

  1. ل فدا-بي تلطيخ مزدوج، تراكب الصور من الخلايا الكشف عن بعد التصفيةمن خلال مرشحات مضان مختلفة عن طريق سحب طبقة ادارة الاغذية والعقاقير إيجابية على طبقة بي إيجابية في برنامج تحرير الرسومات.
    1. ضبط التعتيم للطبقة إيجابية ادارة الاغذية والعقاقير عن طريق إدخال "50٪" في مجال "التعتيم" من لوحة "الطبقات". دمج طبقتين عن طريق النقر على زر "دمج مرئي" في القائمة "طبقة". تعيين تباين الصور تراكب عن طريق إدخال "50" في حقل "التباين" تحت "صورة" | "التعديلات" | "السطوع / التباين". تأكد من عدم وجود فدا و بي خلية إيجابية مزدوجة في الصور تراكب.
  2. ل فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي، تراكب الصور من الخلايا الكشف بعد تصفية مرشحات مضان مختلفة عن طريق سحب طبقة إيجابية ادارة الاغذية والعقاقير على طبقة بي إيجابية في برنامج تحرير الرسومات. ضبط التعتيم للطبقة إيجابية ادارة الاغذية والعقاقير عن طريق إدخال "50٪" في مجال "التعتيم" من "الطبقات & #34؛ فريق.
    1. دمج طبقتين عن طريق النقر على زر "دمج مرئي" في القائمة "طبقة". اسحب طبقة هوشست الإيجابية على الطبقة المدمجة. ضبط التعتيم من طبقة إيجابية هويشت عن طريق إدخال "50٪" في مجال "التعتيم" من لوحة "الطبقات". دمج الطبقتين عن طريق النقر على زر "دمج مرئي" في القائمة "طبقة".
  3. تمييز بصريا كبيرة، وعدم انتظام الخلايا الدبقية غير النظامية من كغن عن طريق مقارنة الصور التي اتخذت في ظل وضع الفلورسنت مع تلك التي اتخذت تحت وضع النقيض من المرحلة - خلايا بأقطار ثلاث مرات أكبر من كغن تعتبر الخلايا الدبقية وينبغي استبعادها.
  4. عد عدد الخلايا العصبية القابلة للحياة والخلايا العصبية الميتة، على التوالي، وذلك باستخدام خلية مكافحة البرنامج المساعد في برنامج معالجة الصور (على سبيل المثال، إيماجيج) 4 .
    1. ل فدا-بي تلطيخ مزدوج، يدويا علامة صغيرة فدا إيجابية الخلايا كماالخلايا العصبية القابلة للحياة. يدويا علامة بي-إيجابية الخلايا كما الخلايا العصبية الميتة. ل فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي، يدويا علامة FDA- و هويشست-مزدوجة إيجابية الخلايا الخلايا العصبية قابلة للحياة يدويا. يدويا علامة PI- و هويشست مزدوجة إيجابية الخلايا كما الخلايا العصبية الميتة.
  5. حساب نسبة بقاء الخلايا العصبية باستخدام المعادلة التالية:٪ من الجدوى العصبية = [عدد الخلايا العصبية قابلة للحياة / (عدد الخلايا العصبية الميتة + عدد الخلايا العصبية القابلة للحياة)] × 100٪. لكل بئر، واختيار خمسة حقول عشوائية ومتوسط ​​نسبة بقاء الخلايا العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام المناعية المزدوج من GAP43 (الأحمر) و غفاب (الأخضر) لتحليل شكل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، على التوالي 2 ، 5 . كلا الخلايا العصبية والخلايا الدبقية موجودة في ثقافة كغن. الخلايا الدبقية إيجابية غفاب كبيرة وغير منتظمة في الشكل، كما هو موضح من قبل الأسهم في الصور ( الشكل 1 ). المقايسات التقليدية لحيوية الخلية لا يمكن تمييز الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية عندما تستخدم لقياس بقاء الخلايا العصبية. ولذلك، فدا-بي و فدا-بي-هويشت تلطيخ، والتي يمكن تمييز الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية، هي مفيدة لتقييم دقيق للبقاء الخلايا العصبية في ثقافة كغن.

تم استخدام التحدي المنخفض البوتاسيوم للحث على وفاة الخلايا العصبية في ثقافة كغن. تظهر الصور التمثيلية ثقافة كغن تحدى مع وسط البوتاسيوم المنخفض (5K)، وسط العادي (25K)، أو أصلنال المتوسطة، كما تم تحليلها من قبل ادارة الاغذية والعقاقير بي تلطيخ مزدوج ( الشكل 2A ) أو فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي ( الشكل 2B ). يتم عرض بقاء الخلايا العصبية التي تقاس بطرق مختلفة في الشكل 3 (يعني ± سيم). كانت البدائل الخلية التي تقاسها فدا-بي تلطيخ مزدوج في السيطرة، 25K، و 5 K المجموعات 99.8 ± 4.2٪، 98.2 ± 2.9٪، و 43.9 ± 8.6٪، على التوالي ( الشكل 3A ). كانت البدائل الخلية التي تقاسها فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي في ​​السيطرة، 25K، و 5 K المجموعات 99.8 ± 1.6٪، 96.7 ± 4.4٪، و 48.3 ± 4.4٪، على التوالي ( الشكل 3B ). كانت البدائل الخلية التي تقاسها اختبار مت في السيطرة، 25K، و 5 K المجموعات 102.1 ± 3.9٪، 96.5 ± 1.7٪، و 57.5 ± 5.7٪، على التوالي ( الشكل 3C ). وكانت النسب المئوية لنزع هيدروجين اللاكتيك (لد) في مجموعات السيطرة و 25 K و 5 K 100.0 ± 5.5٪ و 94.5 ± 11.2٪ و 202.1 ± 15.3٪ على التوالي ( 2 . اختبار مت يقيم نشاط نادف تعتمد أوكسيدوريدوكتاس الخلوية، مما يعكس عدد الخلايا قابلة للحياة 2 . ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا يمكن تمييز الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية عند استخدامها لقياس بقاء الخلايا العصبية في ثقافة كغن. باستخدام فدا-بي و فدا-بي-هويشت تلطيخ، يمكن استبعاد عدد من الخلايا الدبقية، ويمكن قياس بقاء الخلايا العصبية بدقة. وعلاوة على ذلك، فإن بقاء الخلايا العصبية في 5K كغن المعالجة المتوسطة قياسها من قبل ادارة الاغذية والعقاقير بي أو ادارة الاغذية والعقاقير بي-هويشت تلطيخ كان أصغر قليلا من التي تقاسها فحص مت. قد يكون هذا لأن معظم الخلايا الدبقية التي لم تكن حساسة ل 5 K السمية العصبية التي يسببها تم استبعادها من قبل ادارة الاغذية والعقاقير بي أو فدا-بي-هويشت تلطيخ، ولكن ليس من خلال فحص مت.

شكل 1
الشكل 1: كل الخلايا العصبية الصغيرة والكبيرة، غير النظامية الخلايا الدبقية موجودة في الثقافة كغن. في يوم 8 في المختبر س، كانت كغن المزدوج إمونوستيند مع GAP43 (الأحمر) و غفاب (الأخضر) للخلايا العصبية والخلايا الدبقية، على التوالي. تظهر الصور على النقيض من المرحلة مورفولوجيا الخلايا. المقايسات التقليدية لحيوية الخلية لا يمكن تمييز الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية عندما تستخدم لقياس بقاء الخلايا العصبية. ولذلك، فدا-بي و فدا-بي-هويشت تلطيخ، والتي يمكن تمييز الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية، هي مفيدة لتقييم دقيق للبقاء الخلايا العصبية في ثقافة كغن. شريط مقياس: 100 ميكرون. السهم الأزرق: الخلايا العصبية النموذجية. السهم الأبيض: الخلايا الدبقية النموذجية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
فدا-بي تلطيخ مزدوج و فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي إظهار منخفض البوتاسيوم الناجم عن الخلايا العصبية الموت في كغن الثقافة. في يوم 8 في المختبر س، تم تبديل الثقافات كغن إلى 5K أو 25K المتوسطة. لم يتغير الوسط في ثقافات السيطرة. بعد 24 ساعة من التحدي، تم تقييم الثقافات كغن من قبل ( A ) فدا-بي تلطيخ مزدوج أو ( B ) فدا-بي-هويشست تلطيخ الثلاثي. شريط مقياس = 100 ميكرون. السهم: الخلايا الدبقية النموذجية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: الكمي من الجدوى العصبية في الثقافة كغن. في يوم 8 في المختبر س، تم تبديل الثقافات كغن إلى 5K أو 25K المتوسطة. الوسط في ثقافة الرقابةs لم يتغير. بعد 24 ساعة من التحدي، تم تحليل بقاء الخلية من قبل ( A ) فدا-بي تلطيخ مزدوج، ( B ) فدا-بي-هويشت تلطيخ الثلاثي، و ( C ) فحص مت. ( D ) تم تحليل إطلاق لد من قبل مقايسة لد. يتم التعبير عن البيانات كوسيلة ± سيم. ** p <0.01 مقابل السيطرة (أنوفا، اختبار توكي). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تعديل هذا البروتوكول من الإجراءات التي تم وصفها سابقا 6 ، 7 . وقد قضى الباحثون الوقت في محاولة للحد من نمو الخلايا غير العصبية من خلال تحسين الظروف عند زراعة الخلايا العصبية الأولية في المختبر 8 . ومع ذلك، حتى مع تحسن ظروف الثقافة، تبقى بعض الخلايا الدبقية. وعلاوة على ذلك، الخلايا غير العصبية ضرورية في الثقافات العصبية الأولية لأنها تساعد في نمو الخلايا العصبية والنضج 9 . في هذه الدراسة، تم استخدام أرا-C لتقليل نمو الخلايا الدبقية، على الرغم من أنه لا يزال هناك حوالي 1 - 5٪ وجود الخلايا الدبقية في ثقافة كغن. وتعرض هذه المشكلة أيضا في دراسات المجموعات الأخرى 10 . في ثقافة كغن، أحجام وأشكال الخلايا الدبقية تختلف إلى حد كبير عن الخلايا العصبية. قطر كغنز حوالي 10 ميكرون، و كغن ناضجة لها عمليات غنية التي تربط الخلايا العصبية. هاوفر، قطر الخلايا الدبقية في الثقافة كبيرة نسبيا، حوالي 30-100 ميكرون، لذلك فمن السهل التمييز بين الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية في الصور. لذلك، ميزة واحدة من فدا-بي و فدا-بي-هويشت تلطيخ هو لقياس بدقة بقاء الخلايا العصبية في الثقافات العصبية الأولية التي لا يتم منع نمو الخلايا غير العصبية من قبل تقنيات الثقافة.

ويمثل موت الخلايا المبرمج المنخفض البوتاسيوم في الثقافات كغن، مع 25K الخلايا المعالجة المتوسطة كسيطرة، نموذجا ممتازا لدراسة موت الخلايا المبرمج العصبي. وقد استخدمت العديد من المجموعات، بما في ذلك مختبرنا، هذه الدراسة النموذجية الكلاسيكية آليات أبوبتوتيك الكامنة من الخلايا العصبية 2 ، 11 . لذلك، تم استخدام هذا النموذج للحث على وفاة الخلايا العصبية. وقد تم تحسين تركيز الأصباغ ومدة تلطيخ المستخدمة في هذا البروتوكول. تركيزات منخفضة من الأصباغ ومدد قصيرة من تلطيخ يمكن أن يسبب تلطيخ غير كاف، مما يؤدي إلى غير دقيقة كونتينغ من الخلايا العصبية الميتة. ومع ذلك، تركيزات عالية من الأصباغ وفترات طويلة من تلطيخ يمكن أن تحفز مزيد من وفاة الخلايا العصبية وتسبب تحيز في تقدير بقاء الخلية. لذلك، يجب أن تؤخذ الصور في أقرب وقت ممكن بعد إضافة الأصباغ. في فدا-بي صور تلطيخ مزدوجة، يتم وضع علامة الخلايا إيجابية ادارة الاغذية والعقاقير الصغيرة كما الخلايا العصبية قابلة للحياة. ومع ذلك، تميل أجسام الخلايا إلى مجموعة في ثقافة كغن. ولذلك، فإنه يمكن أن يكون من الصعب فصل خلايا قابلة للحياة من قبل ادارة الاغذية والعقاقير تلطيخ. في هذه الدراسة، تم استخدام هوشست، وصمة عار النووية، لتحسين دقة. يمكن اعتبار الخلايا الصغيرة مع الأجسام الخلية إيجابية ادارة الاغذية والعقاقير والنوى إيجابية هويشست الخلايا العصبية قابلة للحياة في فدا-بي-هويشست تلطيخ الصور الثلاثية.

بالمقارنة مع المقايسات السمية اللونية، فدا-بي و فدا-بي-هويشت تلطيخ تتطلب المزيد من الوقت لتقييم الجدوى الخلايا العصبية في الثقافة كغن. ولذلك، فإن البروتوكول الحالي قد لا تكون مناسبة لفحص الأدوية اعصاب. ومع ذلك، هذا القيديمكن حلها باستخدام نظام التصوير عالية المحتوى. وثمة قيد آخر لهذه التقنية هو أنه لا يمكن التمييز بين كغن و غليال بواسطة بي. ومع ذلك، لأن الخلايا العصبية هي أكثر عرضة للسموم العصبية من الخلايا الدبقية، بي-إيجابية الخلايا الميتة هي أساسا الخلايا العصبية 12 .

إلى جانب فدا، بي، و هويشت، وتستخدم الأصباغ الأخرى، مثل مت، SYTO13، و SYBR14، لقياس بقاء الخلية 13 ، 14 . لفحص مت، الخلايا الدبقية التي ليست حساسة للسموم العصبية يمكن تحويل مت إلى فورمازان، مما يؤدي إلى الإفراط في تقدير بقاء الخلايا العصبية. SYTO13 هو خلية نفاذية ولها محصول الفلورسنت الأخضر عالية عندما تكون ملزمة إلى الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. اقترحت دراسة سابقة أن SYTO13 تلطيخ يشير أساسا الخلايا المبرمج في ثقافة كغن ولكن لا يميز الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية 13 . SYBR14 هو غشاء دائم الحمض النووي غشاء. SYBR14-بي تلطيخ مزدوج هو لناإد لقياس بقاء الخلية لأن كلا الأصباغ تسمية الحمض النووي، وبالتالي الالتفاف على الغموض 14 . ومع ذلك، SYBR14-بي تلطيخ مزدوج لا يمكن أن تميز بشكل فعال الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية في ثقافة كغن. ولذلك، فدا-بي و فدا-بي-هويشت تلطيخ، والتي يمكن تمييز الخلايا الدبقية من الخلايا العصبية، هي مفيدة لتقييم دقيق للبقاء الخلايا العصبية في ثقافة كغن.

وأخيرا، فدا-بي و فدا-بي-هويشت تلطيخ لا تقتصر على تحليل الجدوى الخلايا العصبية في الثقافات كغن. العديد من الثقافات الخلية المختلطة (على سبيل المثال، الثقافات القشرية الأولية والثقافات الحصين الأولية) تحتوي أيضا على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. لذلك، يمكن تطبيق استراتيجية مماثلة لتلك الثقافات الخلية المختلطة لتحليل بدقة بقاء الخلايا العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ (LY15H310007)، ومشروع البحوث التطبيقية على التكنولوجيا غير الربحية لمقاطعة تشجيانغ (2016C37110)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U1503223، 81673407)، و نينغبو الدولية للعلوم و مشروع التعاون التكنولوجي (2014D10019)، وفريق الابتكار بلدية نينغبو لعلوم الحياة والصحة (2015C110026)، ومشروع التعاون الدولي مقاطعة قوانغدونغ للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2013B051000038)، وبرنامج البحوث الأساسية شنتشن (JCYJ20160331141459373)، وقوانغدونغ هونغ (غب / 012 / 16GD)، ومجلس منح البحوث في هونغ كونغ (15101014)، وجامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية (G-يبغق)، وصندوق كينغ وونغ ماغنا في جامعة نينغبو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Tags

علم الأعصاب، العدد 123، والخلايا العصبية الحبيبية الحبيبية، فلوريسئين دياسيتات، يوديد بروبيديوم، بقاء الخلية، وخلايا الدبقية، والمضان المجهري
تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, … More

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter