Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdering af neuronal levedygtighed ved anvendelse af fluoresceindiacetat-propidiumiodid dobbeltfarvning i cerebellar granulærneuronkultur

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man nøjagtigt måler neuronal levedygtighed ved anvendelse af fluoresceindiacetat (FDA) og propidiumiodid (PI) dobbeltfarvning i dyrkede cerebellære granulære neuroner, en primær neuronalkultur, der anvendes som in vitro- model i neurovidenskab og neurofarmakologiforskning.

Abstract

Primære dyrkede cerebellar granulære neuroner (CGN'er) er blevet anvendt i vid udstrækning som en in vitro- model inden for neurovidenskab og neurofarmakologi. Sameksistensen af ​​glialceller og neuroner i CGN-kultur kan imidlertid føre til forstyrrelser i den nøjagtige vurdering af neuronal levedygtighed. Fluoresceindiacetat (FDA) og propidiumiodid (PI) dobbeltfarvning er blevet anvendt til at måle celle-levedygtighed ved samtidig evaluering af de levedygtige og døde celler. Vi anvendte FDA-PI dobbeltfarvning for at forbedre følsomheden af ​​de kolorimetriske analyser og at evaluere neuronal levedygtighed i CGN'er. Derudover tilføjede vi blå fluorescerende DNA-pletter ( f.eks. Hoechst) for at forbedre nøjagtigheden. Denne protokol beskriver hvordan man kan forbedre nøjagtigheden af ​​vurderingen af ​​neuronal levedygtighed ved at anvende disse metoder i CGN-kultur. Ved hjælp af denne protokol kan antallet af glialceller udelukkes ved anvendelse af fluorescensmikroskopi. En lignende strategi kan anvendes til at skelne den uønskede gliAlceller fra neuroner i forskellige blandede cellekulturer, såsom primær kortikultur og hippocampalkultur.

Introduction

Colorimetriske cytotoksicitetsanalyser, såsom 3- (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT) assayet, anvendes almindeligvis til at måle cellelevedygtighed in vitro . Primære dyrkede cerebellar granulære neuroner (CGN'er) fra rotter er følsomme for forskellige neurotoksiner, herunder 1-methyl-4-phenylpyridiniumion, hydrogenperoxid og glutamat 1 , 2 . Derfor kan CGN-kulturer anvendes som en in vitro- model inden for neurovidenskab. CGN-kulturer kan indeholde en række celler, herunder neuroner og glialceller, som kan tegne sig for ca. 1% af de samlede celler i CGN-kulturen. Glialceller reagerer imidlertid forskelligt på neurotoksiner sammenlignet med neuroner, hvilket fører til en bias i neuronal levedygtighed målt ved kolorimetriske analyser 3 .

I levedygtige celler kan fluoresceindiacetat (FDA) omdannes til fluorescein med esterase.Propidiumiodid (PI) kan interagere med DNA'et efter indtrængning af døde celler og kan bruges til at indikere apoptose i kulturen. Derfor kan FDA-PI dobbeltfarvning samtidig evaluere levedygtige celler og døde celler, hvilket tyder på, at cellelevedygtigheden kan måles mere præcist ved at kombinere begge kolorimetriske metoder. Ved at tilføje Hoechst, en blå fluorescerende plet til kerner, kunne nøjagtigheden af ​​cellelevedygtighed yderligere forbedres. Den her præsenterede protokol beskriver FDA-PI dobbeltfarvning og FDA-PI-Hoechst triple-farvning, som kan bruges til nøjagtigt at analysere neuronal levedygtighed i primære dyrkede CGN'er.

Denne protokol udnytter visualisering og skelnen mellem CGN og glialceller i deres forskellige størrelser og former. Efter farvning regnes antallet af levedygtige neuroner og døde neuroner fra repræsentative billeder taget af fluorescerende mikroskopi. De store glialceller er udelukket ved sammenligningen af ​​typiske CGN'er tAken under fluorescerende tilstand med dem taget under fase kontrast mode. En lignende strategi kan udføres for at måle neuronal levedygtighed i blandede cellekulturer indeholdende neuroner og glialceller, såsom primære kortikale kulturer og hippocampalkulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer fulgte National Institutes of Health (NIH) Guide til pleje og brug af laboratoriedyr (NIH Publications No. 80-23, revideret 1996) og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ningbo University SYXK-2008-0110).

1. Fremstilling af opløsninger og kulturmedier

Bemærk: Reagenser og lagre skal fremstilles under sterile forhold. Steriliser ved filtrering ved anvendelse af et filter med en porestørrelse på 0,22 μm.

  1. Forbered Poly-L-Lysin (PLL) stamopløsning ved at tilsætte 5 mg PLL til 10 ml dobbeltdestilleret vand (ddH20). Steriliser ved filtrering. Aliquot og opbevar PLL stamopløsningen ved -20 ° C i flere måneder.
  2. Klargør Krebs-buffer ved at tilsætte 7,25 g NaCl, 0,4 g KCl, 0,14 g NaH2P04, 2,6 g D-glucose og 5,94 g 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre til 100 ml DdH 2 </ Sub> O. Steriliser ved filtrering. Opbevar Krebs bufferopløsningen ved 4 ° C i op til en måned.
  3. Forbered 3,82% Mg2SO4-opløsning ved at tilsætte 3,82 g Mg2S04 til 100 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Opbevar Mg 2 SO 4- opløsningen ved 4 ° C i flere måneder.
  4. Forbered 1,2% CaCl2 opløsning ved at tilsætte 1,2 g CaCl2 til 100 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Opbevar CaCl2-opløsningen ved 4 ° C i flere måneder.
  5. Forbered 2M KCl opløsning ved at tilsætte 15 g KCl til 100 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Opbevar KCl-opløsningen ved 4 ° C i flere måneder.
  6. Forbered D-glucose stamopløsningen ved at tilsætte 1,8 g D-glucose til 100 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Aliquot og opbevar D-glucoseopløsningen ved 4 ° C i op til en måned.
  7. Forbered Cytosin β-D-Arabinofuranosid (Ara-C) bestandssolutIon ved tilsætning af 0,24 g Ara-C til 10 ml ddH20. Steriliser ved filtrering. Aliquot og opbevar Ara-C stamopløsningen ved 4 ° C i flere måneder.
  8. Fremstil 250 ml dyrkningsmedium (til 25-30 pupper) ved anvendelse af 25 ml føtal bovint serum (FBS), 2,5 ml 100x glutamin, 2,78 ml 2M KCl opløsning og 2,5 ml 100x antibiotika i Basal Medium Eagle (BME) . Juster volumenet til 250 ml og steriliser ved filtrering.
  9. Fremstil 25K medium ved anvendelse af 2,5 ml 100x glutamin, 2,78 ml 2M KCl opløsning og 2,5 ml 100x antibiotika i BME. Juster volumenet til 250 ml og steriliser ved filtrering.
  10. Forbered 5K medium ved anvendelse af 2,5 ml 100x glutamin og 2,5 ml 100X antibiotika i BME. Juster volumenet til 250 ml og steriliser ved filtrering.
    BEMÆRK: Kulturmediet, 25K medium og 5K medium skal fremstilles frisk
  11. Forbered FDA stamopløsning ved at tilføje 5 mg FDA til 1 ml acetone. Opbevar FDA stamopløsningen ved 4 ° C til langtidsopbevaring. </ Li>
  12. Forbered PI stamopløsning ved at tilføje 1 mg PI til 1 ml ddH20. Opbevar PI stamopløsningen ved 4 ° C i flere måneder.
  13. Forbered Hoechst stamopløsning ved at tilføje 5 mg Hoechst 33342 til 1 ml ddH 2 O. Opbevar Hoechst stamopløsningen ved 4 ° C i flere måneder.

2. Fremstilling af opløsningsopløsninger

BEMÆRK: Gør dette 1 d før dissektion.

  1. Forbered dissektionsopløsningen ved at tilsætte 15 ml Krebs-buffer, 1,2 ml 3,82% Mg2S04-opløsning og 0,45 g bovint serumalbumin (BSA) til 150 ml ddH20. Juster pH til 7,4 ved anvendelse af NaOH.
  2. Mærk 5 x 50 ml rør som følger: 1, 2, 3, 4 og 5.
  3. Anbring 40 ml dissektionsopløsning i en 50 ml sprøjte med et filter. Filtrer 30 ml dissektionsopløsning i rør 1 og 2 ml hver til flere 35 mm cellekulturskåle, som vil blive anvendt til at behandle væv.
  4. Til tUbe 2, tilsættes 12,5 mg trypsin i 50 ml dissektionsopløsning. Blandes fuldstændigt ved vortexing. Steriliser ved filtrering.
  5. Til rør 3 tilsættes 1,2 mg DNAse I, 7,8 mg sojabønne-trypsininhibitor og 150 μl 3,82% Mg2SO4-opløsning i 15 ml dissektionsopløsning. Blandes fuldstændigt ved vortexing. Steriliser ved filtrering.
  6. Til rør 4 tilsættes 5 ml af opløsningen fra rør 3. Tilsæt 10,5 ml dissektionsopløsning. Steriliser ved filtrering.
  7. Til rør 5 tilsættes 100 μl 3,82% Mg2S04-opløsning og 15 μl 1,2% CaCl2-opløsning i 12,5 ml dissektionsopløsning. Blandes fuldstændigt ved vortexing. Steriliser ved filtrering.
  8. Opbevar alle rør ved 4 ° C inden brug.

3. Coating Cell Culture Plates

BEMÆRK: Gør dette 1 d før dissektion.

  1. Tilsæt 1 ml PLL stamopløsning til 100 ml ddH20 (slutkoncentration: 5 μg / ml). Frakke plast6-brønds eller 12-brønds cellekulturplader (2 ml pr. Brønd til 6-brønds cellekulturplader eller 1 ml pr. Brønd til 12-brønds cellekulturplader) ved tilsætning af 5 μg / ml poly-L-lysinopløsning.
  2. Inkuber ved stuetemperatur i 1 dag (eller ved 37 ° C i 2 timer). 1-2 timer før dissektion, fjern opløsningen ved hjælp af en pipette. Vask en gang med ddH20 og tør i cellekulturhætten.

4. Behandling af væv til 8 dages gamle Sprague-Dawley rotter.

  1. Sæt en 100 mm skål på isen. Dekapiter rottepupperne i fadet ved hjælp af et par steriliserede saks.
  2. Sæt saks i foramen magnum og skær de to sider af kraniet, fra ørerne til øjnene. Løft kraniet med et par tang. Sørg for, at hele hjernen er i kraniet. Isolér cerebellum og sæt det i ovennævnte 35 mm fad med et par tang.
  3. Arbejde under et dissekeringsmikroskop. Fjern meninges og blodkar med to par tænger.
  4. Hak vævene med et blad. Sæt vævene i rør 1. Centrifuge i 5 minutter ved stuetemperatur og 1.500 x g.
  5. Aspirere supernatanten. Gem pellet.
  6. Tilsæt opløsningen i rør 2 til pellet. Resuspenderes ved omrystning forsigtigt.
  7. Anbring røret i et 37 ° C vandbad i 15 minutter. Skud forsigtigt hver 3. minut.
  8. Tilsæt opløsningen i rør 4 til denne opløsning. Ryst og centrifuger i 5 minutter ved stuetemperatur og 1500 x g.
  9. Aspirere supernatanten. Gem pellet.
  10. Tilsæt opløsningen i rør 3 for at resuspendere pelleten.
  11. Klargør to 15 ml rør. Placer halvdelen af ​​cellerne i hvert rør. Pipetter op og ned 60-70x ved hjælp af en bomuldsstoppet Pasteur pipette for at homogenisere cellerne.
  12. Tilsæt 3 ml af opløsningen i rør 5 til hvert 15 ml rør. Lad dem sidde ved stuetemperatur i 10 minutter, og fjern derefter supernatanten forsigtigt med en bomuldskoblet Pasteur pipette. Placer supernatanten i nye 15 ml rør og centrifuge i 5 minutter ved stuetemperatur og 1500 x g.
  13. ENSpirere supernatanten. Gem pellet.
  14. Tilsæt dyrkningsmedium i pelleten for at opnå en celletæthed på ca. 1,5 x 106 celler / ml (ca. 100 ml for 10 pupper).
  15. Sæt cellerne i kulturplader og dyrk dem i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.

5. Tilsætning af Ara-C og D-glucose under dyrkning

  1. Efter 24 timer tilsættes Ara-C stamopløsning (10 μl / brønd til 12-brønds cellekulturplader eller 20 μl / brønd til 6-brøndcellekulturplader; slutkoncentration: 1 mM) for at inhibere væksten af ​​glialcellerne.
  2. På dag 7 tilsættes 50 μl D-glucose stamopløsning pr. Brønd til 12 brønde cellekulturplader eller 100 μl pr. Brønd til 6-brøndcellekulturplader, så den endelige koncentration er 1 mM.

6. FDA-PI dobbeltfarvning og FDA-PI-Hoechst Triple-farvning i CGN-kultur

  1. Forbered FDA-PI-arbejdsløsning ved at tilføje 20 μl FDA stamopløsning (Slutkoncentration: 10 μg / ml) og 50 μl PI stamopløsning (slutkoncentration: 50 μg / ml) i 10 ml PBS. Bland ved vortexing og læg det på is.
    1. Til FDA-PI-Hoechst-arbejdsløsningen tilsættes 20 μL FDA stamopløsning (slutkoncentration: 10 μg / ml), 50 μl PI stamopløsning (slutkoncentration: 50 μg / ml) og 10 μl Hoechst stamopløsning (Slutkoncentration: 5 μg / ml) i 10 ml PBS. Bland ved vortexing og læg det på is.
      BEMÆRK: Friskbered FDA-PI-arbejdsløsning og FDA-PI-Hoechst-arbejdsløsning lige før brug.
  2. Tag cellekulturpladen ud af inkubatoren. Sæt den på is.
  3. Aspirere dyrkningsmediet og erstat det med koldt PBS.
    BEMÆRK: Ændring af opløsning skal ske langsomt og omhyggeligt. Undgå at berøre cellerne med pipettespidser.
  4. Aspirer det kolde PBS og erstat det med kold FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst arbejdsløsning (500 μl / viLl til 12-brønds cellekulturplader eller 1 ml / brønd til 6-brøndcellekulturplader). Forlad på is i 5 min.
  5. Aspirere FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst-arbejdsløsningen og tilsæt kold PBS (100 μl / brønd til 12-brønds cellekulturplader eller 50 μl / brønd til 6-brøndcellekulturplader).
    BEMÆRK: Celler må ikke tørre, når de tager billeder.
  6. Tag billeder ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Brug et excitationsfilter med et passbånd på 450 - 490 nm. Påvisning af fluorescensemissionerne for henholdsvis FDA, PI og Hoechst ved henholdsvis 520, 620 og 460 nm. Under de samme betingelser skal du tage et billede under normalt lys ved hjælp af fasekontrastfunktionen for fluorescerende mikroskopi.
    BEMÆRK: Tag billeder inden for 15 minutter efter FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst farvning. Eksponeringstiden er 100-300 ms, og den analoge forstærkning er 2,8x.

7. Vurdering af neuronal levedygtighed

  1. Til FDA-PI dobbelt farvning overlejres billederne af cellerne, der er opdaget efter filtreringVed forskellige fluorescensfiltre ved at trække det FDA-positive lag på det PI-positive lag i en grafikredigeringssoftware.
    1. Juster opaciteten af ​​det FDA-positive lag ved at indtaste "50%" i feltet "Opacitet" på panelet "Lag". Flet to lag ved at klikke på knappen "Flet synlig" i menuen "Layer". Indstil kontrasten af ​​overlejringsbillederne ved at indtaste "50" i "Kontrast" -feltet under "Billede" | "Justeringer" | "Lys / Kontrast." Sørg for, at der ikke er nogen FDA- og PI-dobbelt-positiv celle i overlejringsbillederne.
  2. For FDA-PI-Hoechst tredobbelt farvning overlejres billederne af cellerne, der er detekteret efter filtrering af forskellige fluorescensfiltre, ved at trække det FDA-positive lag på det PI-positive lag i en grafikredigeringssoftware. Juster opaciteten af ​​det FDA-positive lag ved at indtaste "50%" i feltet "Opacitet" i "Lag og #34; panel.
    1. Flet to lag ved at klikke på knappen "Flet synlig" i menuen "Layer". Træk Hoechst-positivt lag på det fusionerede lag. Juster opaciteten af ​​Hoechst-positivlaget ved at indtaste "50%" i feltet "Opacitet" på panelet "Lag". Flet de to lag ved at klikke på knappen "Flet synlig" i menuen "Layer".
  3. Visuelt skelne store, uregelmæssige glialceller fra CGN'er ved at sammenligne billederne taget under fluorescerende tilstand med dem, der er taget under fasekontrastmodus - celler med diametre tre gange større end CGN'er betragtes som glialceller og bør udelukkes.
  4. Tæl antallet af levedygtige neuroner og døde neuroner henholdsvis ved at bruge et celle-tæller-plugin i et billedbehandlingsprogram ( fx ImageJ) 4 .
    1. Til FDA-PI dobbeltfarvning markeres manuelt små FDA-positive celler somLevedygtige neuroner. Markér manuelt PI-positive celler som døde neuroner. Til FDA-PI-Hoechst tredobbelt farvning markerer man manuelt små FDA- og Hoechst-dobbelt-positive celler som levedygtige neuroner. Markér manuelt PI- og Hoechst-dobbelt-positive celler som døde neuroner.
  5. Beregn procentdelen af ​​neuronal levedygtighed ved brug af følgende ligning:% af neuronal levedygtighed = [antal levedygtige neuroner / (antal døde neuroner + antal levedygtige neuroner)] x 100%. For hver brønd skal du vælge fem tilfældige felter og gennemsnitlige procentdelen af ​​neuronal levedygtighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den dobbelte immunostaining af GAP43 (rød) og GFAP (grøn) blev brugt til at analysere formen af ​​neuroner og glialceller henholdsvis 2 , 5 . Både neuroner og glialceller er til stede i CGN-kultur. De GFAP-positive glialceller er store og uregelmæssige i form, som angivet ved pilene i billederne ( Figur 1 ). Traditionelle assays for celle vitalitet kan ikke skelne glialceller fra neuroner, når de bruges til at måle neuronal levedygtighed. Derfor er FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farvning, som kan skelne glialceller fra neuroner, fordelagtige til den nøjagtige evaluering af neuronal levedygtighed i CGN-kultur.

Lavkaliumudfordringen blev anvendt til at inducere neuronal død i en CGN-kultur. De repræsentative billeder viser CGN-kulturen udfordret med et lavt kaliummedium (5K), normalt medium (25K) eller origiNal medium, som analyseret ved FDA-PI dobbeltfarvning ( Figur 2A ) eller FDA-PI-Hoechst triple-farvning ( Figur 2B ). Neuronal levedygtighed målt ved forskellige metoder er vist i figur 3 (middel ± SEM). Celleviabiliteterne målt ved FDA-PI dobbeltfarvning i kontrol-, 25K- og 5K-grupperne var henholdsvis 99,8 ± 4,2%, 98,2 ± 2,9% og 43,9 ± 8,6% ( Figur 3A ). Celleviabiliteterne målt ved FDA-PI-Hoechst tredobbelt farvning i kontrol-, 25K- og 5K-grupperne var henholdsvis 99,8 ± 1,6%, 96,7 ± 4,4% og 48,3 ± 4,4% ( Figur 3B ). Celleviabiliteterne målt ved MTT-assay i kontrol-, 25K- og 5K-grupperne var henholdsvis 102,1 ± 3,9%, 96,5 ± 1,7% og 57,5 ​​± 5,7% ( Figur 3C ). Procentdelene af lactisk dehydrogenase (LDH) frigivelse i kontrol-, 25K- og 5K-grupperne var henholdsvis 100,0 ± 5,5%, 94,5 ± 11,2% og 202,1 ± 15,3% (henholdsvis 2 . MTT-assayet vurderer aktiviteten af ​​NADPH-afhængig cellulær oxidoreduktase, som afspejler antallet af levedygtige celler 2 . Denne metode kunne imidlertid ikke skelne glialceller fra neuroner, når de blev brugt til at måle neuronal levedygtighed i CGN-kultur. Ved anvendelse af FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farvning kunne antallet af glialceller udelukkes, og neuronal levedygtighed kunne måles nøjagtigt. Desuden var den neuronale levedygtighed i 5K mediumbehandlede CGN'er målt ved FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst-farvning en smule mindre end den målt ved MTT-assay. Dette kan skyldes, at de fleste glialceller, der ikke var følsomme for 5K-medium-induceret neurotoksicitet, blev udelukket ved FDA-PI eller FDA-PI-Hoechst-farvning, men ikke ved MTT-analysen.

figur 1
Figur 1: Både små neuroner og store, uregelmæssige glialceller er til stede i CGN-kultur. På dag 8 i vitr var CGN'er dobbeltimmunfarvet med henholdsvis GAP43 (rød) og GFAP (grøn) for neuroner og gliaceller. Fasekontrastbillederne viser cellernes morfologi. Traditionelle assays for celle vitalitet kan ikke skelne glialceller fra neuroner, når de bruges til at måle neuronal levedygtighed. Derfor er FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farvning, som kan skelne glialceller fra neuroner, fordelagtige til den nøjagtige evaluering af neuronal levedygtighed i CGN-kultur. Skalestang: 100 μm. Blå pil: Typiske neuroner; Hvid pil: typiske glialceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
FDA-PI dobbeltfarvning og FDA-PI-Hoechst Triple-farvning demonstrerer lavkaliuminduceret neuronal død i CGN-kultur. På dag 8 i vitr blev CGN-kulturer skiftet til 5K eller 25K medium. Mediet i kontrolkulturerne blev ikke ændret. Efter 24 timers udfordring blev CGN-kulturerne analyseret ved ( A ) FDA-PI dobbeltfarvning eller ( B ) FDA-PI-Hoechst tredobbelt farvning. Målestang = 100 μm. Pil: typiske glialceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Kvantificering af neuronal levedygtighed i CGN-kultur. På dag 8 i vitr blev CGN-kulturer skiftet til 5K eller 25K medium. Mediet i kontrolkulturenS blev ikke ændret. Efter 24 timers udfordring blev cellelevedygtighed analyseret ved ( A ) FDA-PI dobbelt farvning, ( B ) FDA-PI-Hoechst triple farvning og ( C ) MTT assay. ( D ) LDH-frigivelsen blev analyseret ved LDH-assay. Dataene udtrykkes som middel ± SEM. ** p <0,01 kontra kontrol (ANOVA, Tukey's test). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol blev modificeret fra procedurer, der er blevet beskrevet tidligere 6 , 7 . Forskere har brugt tid på at forsøge at reducere ikke-neuronal cellevækst ved at forbedre betingelserne ved dyrkning af primære neuroner in vitro 8 . Men selv med forbedrede kulturbetingelser forbliver nogle glialceller. Desuden er ikke-neuronale celler nødvendige i primære neuronkulturer, fordi de hjælper med neuronal vækst og modning 9 . I dette studie blev Ara-C brugt til at minimere væksten af ​​glialceller, selvom der stadig var omkring en 1-5% tilstedeværelse af glialceller i CGN-kulturen. Dette problem er også præsenteret i andre gruppers undersøgelser 10 . I CGN-kultur er størrelserne og formerne af glialceller stort set forskellige fra neuroner. CGN'ernes diameter er ca. 10 μm, og modne CGN'er har rige processer, som forbinder neuronerne. HoweVer, diameteren af ​​glialceller i kultur er relativt stor, ca. 30-100 μm, så det er nemt at skelne glialceller fra neuroner i billeder. Derfor er en fordel ved FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farvning nøjagtigt at måle neuronal levedygtighed i primære neuronkulturer, hvor ikke-neuronal cellevækst ikke forhindres af dyrkningsteknikkerne.

Lavkaliuminduceret apoptose i CGN-kulturer, med 25K mediumbehandlede celler som kontrol, repræsenterer en fremragende model til undersøgelse af neuronal apoptose. Mange grupper, herunder vores laboratorium, har brugt denne klassiske model undersøgelse de underliggende apoptotiske mekanismer i neuroner 2 , 11 . Derfor blev denne model brugt til at inducere neuronal død. Koncentrationen af ​​farvestoffer og varigheden af ​​farvning anvendt i denne protokol er blevet optimeret. Lav koncentration af farvestoffer og korte varianter af farvning kan forårsage utilstrækkelig farvning, hvilket fører til den unøjagtige kuNting af døde neuroner. Imidlertid kan høje koncentrationer af farvestoffer og langvarige farvningstider yderligere fremkalde neuronal død og forårsage en bias ved estimeringen af ​​cellelevedygtighed. Derfor bør billederne tages så hurtigt som muligt efter at farverne er tilføjet. I FDA-PI-dobbeltfarvningsbillederne er små FDA-positive celler markeret som levedygtige neuroner. Celleorganer har imidlertid tendens til at gruppere sig i CGN-kultur. Derfor kan det være svært at adskille levedygtige celler ved FDA-farvning. I denne undersøgelse blev Hoechst, en nuklear plet, brugt til at forbedre nøjagtigheden. Små celler med FDA-positive cellekroppe og Hoechst-positive kerner kan betragtes som levedygtige neuroner i FDA-PI-Hoechst triple-farvningsbilleder.

Sammenlignet med kolorimetriske cytotoksicitetsanalyser kræver FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farvning mere tid til evaluering af neuronal levedygtighed i CGN-kultur. Derfor er den nuværende protokol muligvis ikke egnet til at screene neuroprotektive lægemidler. Men denne begrænsningKan løses ved at bruge et billedbehandlingssystem med høj indhold. En anden begrænsning af denne teknik er, at CGN og glial ikke kan diskrimineres af PI. Men fordi neuroner er mere modtagelige for neurotoksiner end glialceller, er PI-positive døde celler hovedsagelig neuroner 12 .

Udover FDA, PI og Hoechst anvendes andre farvestoffer, såsom MTT, SYTO13 og SYBR14, også til måling af cellelevedygtighed 13 , 14 . Til MTT-analysen kan glialceller, der ikke er følsomme for neurotoksiner, omdanne MTT til formazan, hvilket fører til overestimering af neuronal levedygtighed. SYTO13 er cellepermeabel og har et højt grønt fluorescerende udbytte, når det er bundet til DNA eller RNA. En tidligere undersøgelse foreslog, at SYTO13-farvning primært indikerer apoptotiske celler i CGN-kultur, men skelner ikke glialceller fra neuroner 13 . SYBR14 er et membran-permanent nukleinsyrefarvestof. SYBR14-PI dobbelt farvning er osEd til at måle cellelevedygtighed, fordi begge farvestoffer mærker DNA og derved omgår tvetydigheden 14 . Imidlertid kan SYBR14-PI dobbeltfarvning ikke effektivt skelne glialceller fra neuroner i CGN-kultur. Derfor er FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farvning, som kan skelne glialceller fra neuroner, fordelagtige til den nøjagtige evaluering af neuronal levedygtighed i CGN-kultur.

Endelig er FDA-PI og FDA-PI-Hoechst-farvning ikke begrænset til analysen af ​​neuronal levedygtighed i CGN-kulturer. Mange blandede cellekulturer ( f.eks. Primære kortikale kulturer og primære hippocampalkulturer) indeholder også neuroner og glialceller. Derfor kan en lignende strategi anvendes på de blandede cellekulturer for nøjagtigt at analysere neuronal levedygtighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af stipendier fra Zhejiang-provinsens naturvidenskabelige institut (LY15H310007), Det Anvendte Forskningsprojekt om Nonprofit Technology of Zhejiang-provinsen (2016C37110), National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407), Ningbo International Science and Technology Cooperation Project (2014D10019), Ningbo Kommunale Innovation Team af Life Science and Health (2015C110026), Guangdong Provincial International Cooperation Projekt for Videnskab og Teknologi (nr. 2013B051000038), Shenzhen Basic Research Program (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong Kong Technologies Cooperation Funding Scheme (GHP / 012 / 16GD), Hong Kong Universitets Forskningsråd (15101014), Hongkong Polytechnic University (G-YBGQ) og KC Wong Magna Fund ved Ningbo Universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Tags

Neurovidenskab Udgave 123 Cerebellar Granule-neuroner Fluoresceindiacetat Propidiumiodid Cellelevbarhed Glialceller Fluorescensmikroskopi
Vurdering af neuronal levedygtighed ved anvendelse af fluoresceindiacetat-propidiumiodid dobbeltfarvning i cerebellar granulærneuronkultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, … More

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter