Summary
이 프로토콜은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 체외 모델로 사용되는 배양 소뇌 과립 뉴런 (neuronal culture)의 Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색을 사용하여 신경 생존력을 정확하게 측정하는 방법을 설명합니다.
Abstract
일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 시험 관내 모델로서 널리 사용되어왔다. 그러나, CGN 배양에서 신경 교세포와 뉴런의 공존은 신경 세포 생존 능력의 정확한 평가에서 편차를 유발할 수있다. Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색법은 생존 및 사멸 세포를 동시에 평가함으로써 세포 생존력을 측정하는 데 사용되었습니다. 우리는 비색 분석법의 민감도를 향상시키고 CGNs의 신경 생존 능력을 평가하기 위해 FDA-PI 이중 염색법을 사용했습니다. 또한 정확도를 높이기 위해 청색 형광 DNA 얼룩 ( 예 : Hoechst)을 추가했습니다. 이 프로토콜은 CGN 문화에서 이러한 방법을 사용하여 연결 가능성의 평가의 정확성을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 형광 현미경을 사용하여 glial 세포의 수를 제외 할 수 있습니다. 비슷한 전략을 적용하여 원치 않는 gli를 구별 할 수 있습니다.대뇌 피질의 배양 및 해마 배양과 같은 다양한 혼합 세포 배양에서 뉴런의 알 세포.
Introduction
3- (4,5- 디메틸 -2- 티아 졸릴) -2,5- 디 페닐 -2-H- 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석과 같은 비색 세포 독성 분석은 일반적으로 시험 관내에서 세포 생존력을 측정하는 데 사용됩니다. 쥐의 일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 이온, 과산화수소 및 글루 탐 산염 1,2를 비롯한 다양한 신경 독소에 민감합니다. 따라서 CGN 배양 물은 신경 과학 분야 의 시험 관내 모델로 사용될 수 있습니다. CGN 배양 물은 CGN 배양에서 총 세포의 약 1 %를 차지할 수있는 뉴런 및 신경교 세포를 포함하는 다양한 세포를 함유 할 수있다. 그러나 신경 교세포는 뉴런에 비해 신경 독소에 다르게 반응하여 비색 분석 3 에 의해 측정 된 신경 세포 생존력에 편향을 일으 킵니다.
살아있는 세포에서 Fluorescein diacetate (FDA)는 에스 테라 제에 의해 플루 오레 신으로 전환 될 수 있습니다.Propidium Iodide (PI)는 죽은 세포를 통과 한 후 DNA와 상호 작용할 수 있으며 배양 물 내에서 세포 사멸을 나타내는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 FDA-PI 이중 염색은 생존 가능한 세포와 죽은 세포를 동시에 평가할 수있어 비색법을 결합하여 세포 생존력을보다 정확하게 측정 할 수 있음을 시사합니다. 또한 핵에 파란색 형광 염료 인 Hoechst를 추가하여 세포 생존력의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 FDA-PI 이중 염색법과 FDA-PI-Hoechst triple 염색법을 설명하며, 일차 배양 CGN에서의 신경 생존력을 정확하게 분석하는데 사용될 수 있습니다.
이 프로토콜은 다른 크기와 모양으로 CGN과 glial 세포를 시각화하고 구별하는 것을 이용합니다. 염색 후, 생존 가능한 뉴런과 죽은 뉴런의 수는 형광 현미경으로 촬영 한 대표 이미지로부터 계산됩니다. 대형 glial 세포는 전형적인 CGNs의 비교에 의해 제외됩니다형광등 모드에서 위상차 모드로 촬영 한 것입니다. 유사한 전략은 일차 피질 문화와 해마 문화와 같은 뉴런과 glial 세포를 포함하는 혼합 세포 배양에서의 연결 생존 능력을 측정하기 위해 수행 할 수 있습니다.
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Protocol
모든 절차는 실험실 동물의 관리와 사용을위한 국립 보건원 (NIH) 안내서 (NIH Publications No. 80-23, 1996 년 개정)를 따르고 Ningbo University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) SYXK-2008-0110).
1. 솔루션 및 문화 미디어의 준비
참고 : 시약 및 스톡은 무균 조건에서 준비해야합니다. 구멍 크기가 0.22 μm 인 필터를 사용하여 필터링하여 소독하십시오.
- 이중 증류수 (ddH 2 O) 10 ML에 PLL 5 MG를 추가하여 Poly-L-Lysine (PLL) 스톡 솔루션을 준비하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오. 분주하고 -20 ° C에서 PLL 스톡 솔루션을 몇 달 동안 저장하십시오.
- Krebs 완충액에 NaCl 7.25g, KCl 0.4g, NaH2PO4 0.14g, D- 글루코스 2.6g 및 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 5.94g을 100mL의 ddH2 </ sub> O. 필터링을 통해 소독하십시오. 한 달 동안 4 ℃에서 Krebs 완충액을 보관하십시오.
- Mg2SO4 3.82 g을 ddH 2 O 100 mL에 넣고 3.82 % Mg 2 SO 4 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 개월 동안 4 ℃에서 Mg 2 SO 4 용액을 보관하십시오.
- CaCl 2 1.2 g을 ddH 2 O 100 mL에 넣고 1.2 % CaCl 2 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 개월 동안 4 ℃에서 CaCl 2 용액을 보관하십시오.
- 100mL의 ddH 2 O에 KCl 15g을 가하여 2M KCl 용액을 조제한다. 여과하여 소독한다. 몇 달 동안 4 ℃에서 KCl 용액을 보관하십시오.
- D - 글루코스 1.8g을 ddH 2 O 100mL에 넣고 D- 글루코스 스톡 용액을 준비한다. 여과하여 소독한다. D- 글루코오스 용액을 나누어서 4 ℃에서 1 개월 동안 보관하십시오.
- Cytosine β-D-Arabinofuranoside (Ara-C) 스톡 솔톨 준비이온은 0.24 g의 Ara-C를 10 mL의 ddH 2 O에 첨가하여 제거한다. 여과하여 소독한다. 몇 분 동안 4 ℃에서 분주하고 Ara-C 보관 용액을 보관하십시오.
- FBS (Fetal Bovine Serum) 25 mL, 100x 글루타민 2.5 mL, 2M KCl 용액 2.78 mL, 기본 중 독수리 (BME)의 100x 항생제 2.5 mL를 사용하여 250 mL의 배지 (25-30 새끼) . 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다.
- 2.5x 100x 글루타민 용액, 2.78ml 2M KCl 용액 및 2.5x 100x 항생제를 사용하여 25K 배지를 BME에 준비한다. 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다.
- BME에서 2.5x 100x 글루타민과 2.5x 100x 항생제를 사용하여 5K 배지를 준비한다. 250 mL로 부피를 조절하고 여과하여 멸균한다.
참고 : 배양 배지, 25K 배지 및 5K 배지는 새로 준비해야합니다 - 1 mL의 아세톤에 5 mg의 FDA를 첨가하여 FDA 저장 용액을 준비한다. 장기 보관을 위해서는 4 ℃에서 FDA 보관 용액을 보관하십시오. </ li>
- 1 mL의 ddH 2 O에 1 mg의 PI를 첨가하여 PI 저장 용액을 준비하십시오. 몇 달 동안 4 ℃에서 PI 저장 용액을 보관하십시오.
- Hoechst 33342 5 mg을 ddH 2 O 1 mL에 넣고 Hoechst 원액을 준비하십시오. 몇 달 동안 4 ℃에서 Hoechst 원액을 보관하십시오.
2. 해 해제의 준비
참고 : 해부하기 전에 1 일하십시오.
- 해파드 용액을 150 ML의 ddH 2 O에 Krebs 버퍼 15 ML, 3.82 % Mg 2 SO 4 솔루션 1.2 ML 및 소 혈청 알부민 (BSA) 0.45 g을 추가하여 준비합니다. NaOH를 사용하여 7.4로 산도를 조정합니다.
- 다음과 같이 5 x 50 mL 튜브에 라벨을 붙이십시오 : 1, 2, 3, 4 및 5.
- 필터가있는 50 mL 주사기에 절개 용액 40 mL를 넣으십시오. 튜브 1에 해부 용액 30 mL를 여과하고 조직을 처리하는 데 사용되는 몇 가지 35 mm 세포 배양 접시에 각각 2 mL 씩 넣습니다.
- ~까지ube 2, 해부 용액 50 mL에 12.5 mg의 트립신을 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오.
- 3 관에 해부액 15 mL에 1.2 mg의 DNAse I, 7.8 mg의 대두 트립신 저해제, 150 mL의 3.82 % Mg 2 SO 4 용액을 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오.
- 튜브 4에 튜브 3의 용액 5 mL를 넣는다. 해파 용액 10.5 mL를 넣는다. 필터링을 통해 소독하십시오.
- 튜브 5에 해부 용액 12.5 mL에 3.82 % Mg 2 SO 4 용액 100 μL와 1.2 % CaCl 2 용액 15 μL를 넣는다. 볼 텍싱으로 완전히 혼합하십시오. 필터링을 통해 소독하십시오.
- 사용 전에 모든 튜브를 4 ° C에 보관하십시오.
3. 세포 배양 판 코팅
참고 : 해부하기 전에 1 일하십시오.
- 100 mL의 ddH 2 O (최종 농도 : 5 μg / mL)에 PLL 원액 1 mL를 넣는다. 플라스틱 코팅poly-L-lysine 용액 5 μg / mL를 첨가하여 6- 웰 또는 12 웰 세포 배양 플레이트 (6 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 2 mL 또는 12 웰 세포 배양 플레이트의 웰당 1 mL)를 첨가 하였다.
- 실온에서 1 일 동안 (또는 37 ° C에서 2 시간 동안) 배양하십시오. 해부하기 전에 1-2 시간, 피펫을 사용하여 솔루션을 제거합니다. ddH 2 O로 한 번 씻고 세포 배양 후드에서 말립니다.
4. 8 일 된 Sprague-Dawley Rats에 대한 조직 처리.
- 얼음에 100mm 접시를 놓으십시오. 한 켤레의 소독 가위를 사용하여 쥐 새끼를 접시에 처치하십시오.
- 구멍이있는 매그넘에 가위를 삽입하고 귀에서 눈으로 두개골의 양면을 자릅니다. 한 쌍의 포셉을 사용하여 두개골을 들어 올리십시오. 전체 뇌가 두개골에 있는지 확인하십시오. 소뇌를 분리하고 포셉 한 켤레를 사용하여 위에서 언급 한 35mm 요리에 넣어.
- 해부 현미경으로 작업하십시오. 두 쌍의 포셉으로 수막과 혈관을 제거하십시오..
- 칼로 티슈를 자른다. 튜브를 튜브에 넣으십시오. RT와 1,500 x g에서 5 분간 원심 분리하십시오.
- 뜨는을 대기음. 펠렛을 저장하십시오.
- 튜브 2의 용액을 펠렛에 넣는다. 부드럽게 흔들어서 Resuspend.
- 튜브를 37 ° C의 수 욕조에 15 분간 놓습니다. 부드럽게 3 분마다 흔들어.
- 튜브 4의 용액을이 용액에 첨가한다. 흔들어서 실온에서 5 분간 원심 분리하고 1,500 x g.
- 뜨는을 대기음. 펠렛을 저장하십시오.
- 튜브 3에 솔루션을 추가하여 펠렛을 resuspend.
- 두 개의 15 mL 튜브를 준비하십시오. 각 튜브에 세포의 절반을 배치하십시오. 셀을 균질화하기 위해 목화 플러그 파스퇴르 피펫을 사용하여 60-70x 위아래로 피펫.
- 튜브 15에 3 mL의 용액을 각 15 mL 튜브에 첨가한다. RT에서 10 분간 앉아서 면봉으로 된 파스퇴르 (Pasteur) 피펫으로 조심스럽게 상등액을 제거하십시오. 상등액을 새로운 15 mL 튜브에 넣고 RT와 1,500 x g에서 5 분간 원심 분리합니다.
- 에이상층 액을 증발시킨다. 펠렛을 저장하십시오.
- 펠렛에 배양 배지를 넣어 약 1.5 x 106 세포 / mL (10 마리의 새끼를 약 100 mL)의 세포 밀도를 얻습니다.
- 세포를 문화 플레이트에 넣고 37 ° C 및 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양하십시오.
5. 배양 중 Ara-C와 D-glucose의 첨가
- 24 시간 후, 신경 세포의 성장을 억제하기 위해 Ara-C 저장 용액 (12- 웰 세포 배양 플레이트 또는 10- 웰 세포 배양 플레이트에 대해 20 μL / 웰, 최종 농도 : 1 mM)을 첨가한다.
- 7 일에, 최종 농도가 1 MM되도록 12 잘 세포 배양 플레이트 또는 6 잘 세포 배양 플레이트에 대한 우물 당 100 μL에 대한 우물 당 50 μL D- 포도당 스톡 솔루션을 추가합니다.
6. CGN 배양에서의 FDA-PI 이중 염색 및 FDA-PI-Hoechst 삼중 염색
- 20 μL의 FDA 저장 용액을 첨가하여 FDA-PI 작업 용액 준비최종 농도 : 10 μg / mL)와 10 mL의 PBS에 50 μL의 PI 스톡 용액 (최종 농도 : 50 μg / mL)을 넣었다. 볼 텍싱 (vortexing)하여 섞어 얼음 위에 놓습니다.
- FDA-PI-Hoechst 작업 용액의 경우 FDA 저장 용액 (최종 농도 : 10 μg / mL) 20 μL, PI 저장 용액 (최종 농도 : 50 μg / mL) 50 μL, Hoechst 원액 10 μL (최종 농도 : 5 μg / ML) 10 ML PBS에. 볼 텍싱 (vortexing)하여 섞어 얼음 위에 놓습니다.
참고 : 사용 직전에 FDA-PI 작업 솔루션 및 FDA-PI-Hoechst 작업 솔루션을 새로 준비하십시오.
- FDA-PI-Hoechst 작업 용액의 경우 FDA 저장 용액 (최종 농도 : 10 μg / mL) 20 μL, PI 저장 용액 (최종 농도 : 50 μg / mL) 50 μL, Hoechst 원액 10 μL (최종 농도 : 5 μg / ML) 10 ML PBS에. 볼 텍싱 (vortexing)하여 섞어 얼음 위에 놓습니다.
- 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 꺼냅니다. 얼음에 올려 놓으십시오.
- 배양기를 대기음으로 감기는 PBS로 교체하십시오.
참고 : 솔루션 변경은 천천히 그리고 조심스럽게 이루어져야합니다. 피펫 팁으로 세포를 만지지 마십시오. - 차가운 PBS를 대기음으로 옮겨 차가운 FDA-PI 또는 FDA-PI-Hoechst 작업 용액으로 교체하십시오 (500 μL / 우리12 웰 세포 배양 플레이트 또는 6 웰 세포 배양 플레이트에 대해 1㎖ / 웰). 얼음 위에서 5 분간 방치한다.
- FDA - PI 또는 FDA - PI - Hoechst 작업 솔루션을 대기음과 차가운 PBS (12 잘 세포 배양 플레이트 또는 잘 쥐 세포 배양 플레이트 50 μL / 잘 100 μL /)를 추가합니다.
참고 : 이미지를 촬영할 때 셀을 건조시키지 마십시오. - 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하십시오. 통과 대역이 450 - 490 nm 인 여기 필터를 사용하십시오. FDA, PI 및 Hoechst의 형광 방출을 각각 520, 620 및 460 nm에서 감지합니다. 동일한 조건에서 형광 현미경의 위상차 모드를 사용하여 정상 광선 아래에서 이미지를 찍습니다.
참고 : FDA-PI 또는 FDA-PI-Hoechst 염색 후 15 분 이내에 이미지를 촬영하십시오. 노출 시간은 100-300ms이고 아날로그 게인은 2.8x입니다.
7. 신경 생존력의 평가
- FDA-PI 이중 염색의 경우, 여과 후 검출 된 세포의 이미지를 오버레이그래픽 편집기 소프트웨어에서 PI 양성 층에있는 FDA- 양성 층을 드래그하여 다른 형광 필터로.
- "레이어"패널의 "불투명도"필드에 "50 %"를 입력하여 FDA 양성 레이어의 불투명도를 조정합니다. "Layer"메뉴에서 "Merge Visible"버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. "이미지"아래의 "대비"필드에 "50"을 입력하여 오버레이 이미지의 대비를 설정하십시오 | "조정"| "밝기 / 대비" 오버레이 이미지에 FDA 및 PI 이중 긍정 셀이 없는지 확인하십시오.
- FDA-PI-Hoechst 3 중 염색의 경우 그래픽 편집기 소프트웨어에서 PI 양성 층의 FDA 양성 층을 끌어 다른 형광 필터를 필터링 한 후 검출 된 세포의 이미지를 오버레이합니다. "레이어 & # 0"레이어의 "불투명도"필드에 "50 %"를 입력하여 FDA- 포지티브 레이어의 불투명도를 조정합니다.34; 패널.
- "Layer"메뉴에서 "Merge Visible"버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. 병합 된 레이어에서 Hoechst 양성 레이어를 드래그합니다. "레이어"패널의 "불투명도"필드에 "50 %"를 입력하여 Hoechst- 포지티브 레이어의 불투명도를 조정합니다. "Layer"메뉴에서 "Merge Visible"버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다.
- 형광 모드에서 촬영 한 이미지와 위상차 모드에서 촬영 한 이미지를 비교하여 대형의 불규칙한 glial 세포를 CGN과 구별합니다. CGN보다 3 배 큰 직경을 가진 세포는 glial 세포로 간주되므로 제외해야합니다.
- 이미지 처리 프로그램 ( 예 : ImageJ)에서 세포 카운터 플러그인을 사용하여 실행 가능한 뉴런과 죽은 뉴런의 수를 각각 계산합니다.
- FDA-PI 이중 염색의 경우, 작은 FDA 양성 세포를 수동으로 표시한다.생존 가능한 뉴런. PI 양성 세포를 죽은 뉴런으로 수동으로 표시하십시오. FDA-PI-Hoechst triple staining의 경우, 작은 FDA- 및 Hoechst- 이중 양성 세포를 생존 가능한 뉴런으로 수동으로 표시하십시오. 수동으로 PI- 및 Hoechst- 이중 양성 세포를 죽은 뉴런으로 표시하십시오.
- 다음 방정식을 사용하여 연결 세포 생존율을 계산하십시오 : 연결 생존율 % = [생존 가능한 뉴런의 수 / (죽은 뉴런의 수 + 생존 가능한 뉴런의 수)] × 100 %. 각 우물에 대해 5 개의 무작위 필드를 선택하고 뉴런 생존율을 평균합니다.
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Representative Results
GAP43 (적색)과 GFAP (녹색)의 이중 immunostaining는 각각 신경 세포와 glial 세포의 모양을 분석하는 데 사용되었다 2 , 5 . 두 뉴런과 glial 세포는 CGN 문화에 존재합니다. GFAP 양성 glial 세포는 이미지의 화살표로 표시된대로 크고 불규칙한 모양입니다 ( 그림 1 ). 세포 활력에 대한 전통적인 분석은 신경 생존력을 측정하는 데 사용되는 경우 신경 세포와 신경 세포를 구별 할 수 없습니다. 따라서, 신경 세포와 구강 세포를 구별 할 수있는 FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색은 CGN 배양에서의 신경 생존 능력의 정확한 평가에 유리하다.
낮은 칼륨 도전은 CGN 문화에서의 연결의 죽음을 유도하는 데 사용되었습니다. 대표적인 이미지는 저 칼륨 배지 (5K), 보통 배지 (25K), 또는 오리 지날FDA-PI 이중 염색 ( 그림 2A ) 또는 FDA-PI-Hoechst 삼 염색 ( 그림 2B )으로 분석 한 결과, 다양한 방법으로 측정 한의 연결 생존 능력은 그림 3 (평균 ± SEM)에 표시됩니다. 대조군, 25K 및 5K 군에서 FDA-PI 이중 염색으로 측정 한 세포 생존도는 각각 99.8 ± 4.2 %, 98.2 ± 2.9 % 및 43.9 ± 8.6 %였다 ( 그림 3A ). 대조군, 25K 및 5K 군에서 FDA-PI-Hoechst 3 중 염색으로 측정 한 세포 생존도는 각각 99.8 ± 1.6 %, 96.7 ± 4.4 % 및 48.3 ± 4.4 %였다 ( 그림 3B ). 대조군, 25K 및 5K 군에서 MTT 분석으로 측정 한 세포 생존율은 각각 102.1 ± 3.9 %, 96.5 ± 1.7 % 및 57.5 ± 5.7 %였다 ( 그림 3C ). 대조군, 25K 군 및 5K 군에서 유산 탈수소 효소 (LDH) 방출의 백분율은 각각 100.0 ± 5.5 %, 94.5 ± 11.2 % 및 202.1 ± 15.3 %였다 2 에 의해 직접적으로 계산 될 수 없었다. MTT 분석은 생존 가능한 세포의 수를 반영하는 NADPH 의존성 세포 산화 환원 효소의 활성을 평가합니다 2 . 그러나,이 방법은 CGN 배양에서 신경 세포의 생존력을 측정하는데 사용될 때 신경 세포로부터 신경 세포를 구별 할 수 없었다. FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색법을 사용함으로써 신경아 교세포의 수를 배제하고 신경 생존력을 정확하게 측정 할 수있었습니다. 또한, FDA-PI 또는 FDA-PI-Hoechst 염색에 의해 측정 된 5K 배지 CGN에서의 뉴런 생존도는 MTT 분석에 의해 측정 된 것보다 약간 작았 다. 이것은 5K 배지에서 유도 된 신경 독성에 민감하지 않은 대부분의 신경아 교세포가 FDA-PI 또는 FDA-PI-Hoechst 염색법에 의해 제외되었지만 MTT 분석에서는 제외되지 않았기 때문일 수 있습니다.
그림 1 : 작은 뉴런과 대형 불규칙한 신경아 교세포가 CGN 배양에 존재합니다. vitr o 에서 8 일째 에, CGN 은 뉴런 및 글 리알 세포에 대해 각각 GAP43 (적색) 및 GFAP (녹색)로 이중 면역 염색되었다. 위상 대비 이미지는 세포의 형태를 보여줍니다. 세포 활력에 대한 전통적인 분석은 신경 생존력을 측정하는 데 사용되는 경우 신경 세포와 신경 세포를 구별 할 수 없습니다. 따라서, 신경 세포와 구강 세포를 구별 할 수있는 FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색은 CGN 배양에서의 신경 생존 능력의 정확한 평가에 유리하다. 스케일 바 : 100 μm. 파란색 화살표 : 일반적인 뉴런; 백색 화살표 : 전형적인 신경 교세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FDA-PI 이중 염색 및 FDA-PI-Hoechst Triple Staining은 CGN 배양에서 낮은 칼륨 유도 신경 세포 죽음을 증명합니다. vitr o 에서 8 일째 에 , CGN 배양 물을 5K 또는 25K 배지로 전환시켰다. 대조 배양 배지는 변경되지 않았습니다. 도전 24 시간 후, CGN 배양 물은 ( A ) FDA-PI 이중 염색 또는 ( B ) FDA-PI-Hoechst 삼중 염색에 의해 분석 하였다. 스케일 바 = 100 μm. 화살표 : 전형적인 신경아 교세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : CGN 문화의 연결성 생존 능력의 부량. vitr o 에서 8 일째 에 , CGN 배양 물을 5K 또는 25K 배지로 전환시켰다. 대조 배양 배지s는 변경되지 않았습니다. 도전 24 시간 후, 세포 생존력을 ( A ) FDA-PI 이중 염색, ( B ) FDA-PI-Hoechst 삼중 염색 및 ( C ) MTT 분석으로 분석 하였다. ( D ) LDH 방출은 LDH 분석에 의해 분석되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. ** p <0.01 대 대조군 (ANOVA, Tukey 's test). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 앞에서 설명한 절차 6 , 7 에서 수정되었습니다. 연구원은 체외에서 일차 뉴런 을 배양 할 때 조건을 개선하여 비 신경 세포 성장을 줄이기 위해 시간을 보냈습니다. 그러나, 개선 된 배양 조건으로도, 일부의 신경아 교세포가 남아있다. 또한, 그들은 신경 세포의 성장과 성숙을 도와주기 때문에 비 연결 세포가 기본 신경 세포 배양에 필요합니다. 이 연구에서, Ara-C는 glial 세포의 성장을 최소화하는 데 사용되었지만, CGN 배양에서 여전히 glial 세포의 존재가 약 1 ~ 5 %는 있음에도 불구하고. 이 문제는 다른 그룹의 연구에서도 나타난다 10 . CGN 문화에서 glial 세포의 크기와 모양은 크게 뉴런과 다릅니다. CGN의 직경은 약 10 μm이며, 성숙한 CGN은 뉴런을 연결하는 풍부한 과정을 가지고 있습니다. 하우ver에서 배양 된 glial 세포의 지름은 약 30-100 μm 크기로 상대적으로 크기 때문에 이미지에서 신경 세포와 신경 세포를 구별하기 쉽습니다. 따라서 FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색의 한 가지 이점은 비 신경 세포 성장이 배양 기술에 의해 예방되지 않는 일차 신경 배양 물에서의 신경 생존력을 정확하게 측정하는 것이다.
대조군으로 25K 배지 처리 된 세포를 가진 CGN 배양에서 낮은 칼륨 유도 된 세포 사멸은 신경 세포 사멸을 연구하는 훌륭한 모델이다. 우리 연구실을 포함한 많은 그룹이이 고전적 모델 연구에 뉴런 2 , 11 의 기본 apoptotic mechanism을 사용했습니다. 따라서,이 모델은의 연결을 사망을 유도하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜에 사용 된 염료의 농도와 염색의 지속 시간이 최적화되었습니다. 염료의 농도가 낮고 오염 시간이 짧으면 불충분 한 얼룩이 생겨 정확하지 않을 수 있습니다.죽은 뉴런의 관찰. 그러나, 높은 농도의 염료 및 염색의 연장 된 지속 시간은 신경 세포 사멸을 유도하고 세포 생존력의 평가에 편향을 야기 할 수있다. 따라서 염료를 추가 한 후 가능한 빨리 이미지를 가져와야합니다. FDA-PI 이중 염색 이미지에서 작은 FDA 양성 세포는 생존 가능한 뉴런으로 표시됩니다. 그러나 세포체는 CGN 배양에서 집단화되는 경향이 있습니다. 따라서 FDA 염색으로 생존 세포를 분리하는 것이 어려울 수 있습니다. 이 연구에서 Hoechst, 핵 얼룩은 정확도를 높이기 위해 사용되었습니다. FDA 양성 세포체와 Hoechst 양성 핵을 가진 작은 세포는 FDA-PI-Hoechst 삼중 염색 이미지에서 생존 가능한 뉴런으로 간주 될 수 있습니다.
비색 세포 독성 분석과 비교하여, FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색은 CGN 배양에서의 신경 생존 능력의 평가에 더 많은 시간을 요구한다. 따라서 현재의 프로토콜은 신경 보호 약물을 스크리닝하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 그러나이 제한고화질 이미징 시스템을 사용하여 해결할 수 있습니다. 이 기술의 또 다른 한계는 CGN과 glial이 PI에 의해 구별 될 수 없다는 것입니다. 그러나 뉴런은 신경 교세포보다 신경독에 더 민감하기 때문에 PI 양성 세포는 주로 뉴런 12 입니다.
FDA, PI 및 Hoechst 외에도 MTT, SYTO13 및 SYBR14와 같은 다른 염료도 세포 생존력을 측정하는 데 사용됩니다 13 , 14 . MTT 분석의 경우 신경 독에 민감하지 않은 신경 교세포는 MTT를 포르 마잔으로 전환시켜 연결 가능성을 지나치게 추정 할 수 있습니다. SYTO13은 세포 투과성이 있으며 DNA 나 RNA와 결합 할 때 높은 녹색 형광성을 나타냅니다. 이전의 연구는 SYTO13 염색이 주로 CGN 배양에서 세포 사멸 세포를 나타내지 만 신경 세포와 신경 세포를 구별하지 않는다고 제안했다. SYBR14는 막에 영구적 인 핵산 염료입니다. SYBR14-PI 이중 염색은 우리입니다이 두 염료가 DNA를 라벨링하여 모호성을 우회하기 때문에 세포 생존력을 측정한다. 그러나, SYBR14-PI 이중 염색은 CGN 배양에서 뉴런과 신경 교세포를 효과적으로 구별 할 수 없다. 따라서, 신경 세포와 구강 세포를 구별 할 수있는 FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색은 CGN 배양에서의 신경 생존 능력의 정확한 평가에 유리하다.
마지막으로, FDA-PI 및 FDA-PI-Hoechst 염색은 CGN 배양에서의 신경 생존 능력의 분석에 국한되지 않는다. 많은 혼합 세포 배양 물 ( 예, 1 차 피질 배양 및 1 차 해마 배양)은 또한 뉴런 및 신경 교세포를 함유한다. 따라서 유사한 전략이 뉴런 생존 능력을 정확하게 분석하기 위해 혼합 세포 배양에 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 절강 성 자연 과학 재단 (LY15H310007), 절강 성 비영리 기술 응용 연구 프로젝트 (2016C37110), 중국 국립 자연 과학 재단 (U1503223, 81673407), 닝보 국제 과학 기술 협력 프로젝트 (2014D10019), 닝보시 생명 과학 및 건강 혁신 팀 (2015C110026), 과학 기술 광동성 국제 협력 프로젝트 (2013B051000038), 심천 기본 연구 프로그램 (JCYJ20160331141459373), 광동 홍 (GHP / 012 / 16GD), 홍콩 연구 기금위원회 (15101014), 홍콩 폴리 테크닉 대학 (G-YBGQ), 닝보 대학의 KC 웡 마그나 기금 등이있다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P2636 | |
D-glucose | Sigma | G8270 | |
Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
100x glutamine | Gibco | 25030081 | |
100x antibiotics | Gibco | 15240062 | |
Basal Medium Eagle (BME) | Gibco | 21010046 | |
Fluorescein diacetate (FDA) | Sigma | F7378 | |
Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sangon Biotech | A602440 | |
Trypsin | Sigma | T4665 | |
DNAse | Sigma | D5025 | |
Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
Filter | Millipore | SLGP033RB | |
Pipet 5 mL | Excell Bio | CS017-0003 | |
Pipet 10 mL | Excell Bio | CS017-0004 | |
Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
Image processing software | NIH | ImageJ |
References
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