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Neuroscience

Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive come misurare con precisione la vitalità neuronale utilizzando la doppia colorazione di Fluorescein diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) nei neuroni granulari cerebellari coltivati, una coltura neuronale primaria utilizzata come modello in vitro nella ricerca neuroscienza e neurofarmacologia.

Abstract

I neuroni granulari cerebrali coltivati ​​primari (CGNs) sono stati ampiamente usati come un modello in vitro nella ricerca neuroscienze e neurofarmacologica. Tuttavia, la coesistenza di cellule gliali e neuroni nella cultura CGN potrebbe portare a pregiudizi nella valutazione accurata della vitalità neuronale. La misurazione della resistenza cellulare è stata utilizzata con la doppia acetato di fluoresceina (FDA) e Propidium Iodide (PI), valutando simultaneamente le cellule vitali e morte. Abbiamo utilizzato FDA-PI duplice macchia per migliorare le sensibilità dei test colorimetrici e per valutare la vitalità neuronale nei CGNs. Inoltre, abbiamo aggiunto macchie di DNA fluorescenti blu ( ad esempio, Hoechst) per migliorare l'accuratezza. Questo protocollo descrive come migliorare l'accuratezza della valutazione della vitalità neuronale utilizzando questi metodi nella cultura CGN. Utilizzando questo protocollo, il numero di cellule gliali può essere escluso utilizzando la microscopia a fluorescenza. Una strategia analoga può essere applicata per distinguere gli indesideratiAl cellule da neuroni in varie colture cellulari miste, come la coltura corticale primaria e la coltura ippocampale.

Introduction

I test di citotossicità colorimetrica, come il saggio di bromuro di 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolium bromuro (MTT), sono comunemente usati per misurare la vitalità cellulare in vitro . I neuroni granulari cerebrali coltivati ​​primari (CGNs) dai ratti sono sensibili a varie neurotossine, tra cui l'ione 1-metil-4-fenilpiridina, il perossido di idrogeno e il glutammato 1,2 . Pertanto, le culture CGN possono essere utilizzate come un modello in vitro nel campo della neuroscienza. Le colture CGN possono contenere una varietà di cellule, compresi i neuroni e le cellule gliali, che possono rappresentare circa l'1% delle cellule totali nella coltura CGN. Tuttavia, le cellule gliali rispondono in modo diverso alle neurotossine rispetto ai neuroni, portando ad una bias nella vitalità neuronale misurata dai test colorimetrici 3 .

Nelle cellule vitali, il fluorescein diacetato (FDA) può essere convertito in fluoresceina mediante esterasi.Propidio Ioduro (PI) può interagire con il DNA dopo penetrare le cellule morte e può essere utilizzato per indicare l'apoptosi all'interno della cultura. Pertanto, la duplice colorazione FDA-PI può contemporaneamente valutare le cellule vitali e le cellule morte, suggerendo che la vitalità delle cellule può essere misurata più accuratamente combinando entrambi i metodi colorimetrici. Inoltre, aggiungendo Hoechst, una macchia fluorescente blu per i nuclei, l'accuratezza della vitalità cellulare potrebbe essere ulteriormente migliorata. Il protocollo qui presentato descrive la duplice colorazione FDA-PI e la tripla colorazione FDA-PI-Hoechst, che può essere utilizzata per analizzare accuratamente la vitalità neuronale in CGN coltivate in primari.

Questo protocollo sfrutta la visualizzazione e la distinzione di CGN e cellule gliali per le loro diverse dimensioni e forme. Dopo la colorazione, i numeri di neuroni vitali e neuroni morti sono contati da immagini rappresentative prese da microscopia fluorescente. Le cellule gliali di grandi dimensioni sono escluse dal confronto di tipiche CGNs tAken in modalità fluorescente con quelli presi in modalità di contrasto di fase. Una strategia simile può essere eseguita per misurare la vitalità neuronale in colture cellulari miste contenenti neuroni e cellule gliali, come le colture corticali primarie e le colture ippocampali.

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Protocol

Tutte le procedure sono state seguite dalla guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazioni NIH n. 80-23, riveduta nel 1996) e sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) all'Università di Ningbo SYXK-2008-0110).

1. Preparazione di soluzioni e mezzi di cultura

Nota: i reagenti e le scorte devono essere preparati in condizioni sterili. Sterilizzare filtrando utilizzando un filtro con una porosità di 0,22 μm.

  1. Preparare la soluzione di stock di poli-L-lisina (PLL) aggiungendo 5 mg di PLL a 10 ml di acqua doppia distillata (ddH2O). Sterilizzare filtrando. Aliquota e conserva la soluzione di riserva PLL a -20 ° C per diversi mesi.
  2. Preparare il tampone di Krebs con l'aggiunta di 7,25 g di NaCl, 0,4 g di KCl, 0,14 g di NaH2P04, di 2,6 g di D-glucosio e di 5,94 g di acido 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico a 100 ml di DdH 2 </ Sub> O. Sterilizzare filtrando. Conservare la soluzione di tampone Krebs a 4 ° C per un massimo di un mese.
  3. Preparare la soluzione 3,82% di Mg 2 SO 4 aggiungendo 3,82 g di Mg 2 SO 4 a 100 ml di ddH 2 O. Sterilizzare filtrando. Conservare la soluzione Mg 2 SO 4 a 4 ° C per diversi mesi.
  4. Preparare la soluzione di CaCl2 1,2% con l'aggiunta di 1,2 g di CaCl 2 a 100 ml di ddH2O. Sterilizzare filtrando. Conservare la soluzione CaCl2 a 4 ° C per diversi mesi.
  5. Preparare la soluzione 2M KCl aggiungendo 15 g di KCl a 100 mL di ddH 2 O. Sterilizzare filtrando. Conservare la soluzione KCl a 4 ° C per diversi mesi.
  6. Preparare la soluzione di stock di D-glucosio aggiungendo 1,8 g di D-glucosio a 100 ml di ddH2O. Sterilizzare filtrando. Aliquota e conservare la soluzione D-glucosio a 4 ° C per un massimo di un mese.
  7. Preparare la cellula della citosina β-D-Arabinofuranoside (Ara-C)Ione aggiungendo 0,24 g di Ara-C a 10 ml di ddH2O. Sterilizzare filtrando. Aliquota e conservare la soluzione di riserva Ara-C a 4 ° C per diversi mesi.
  8. Preparare 250 ml di mezzo di coltura (per 25-30 cuccioli) utilizzando 25 ml di Fetal Bovine Serum (FBS), 2,5 ml di glutammina 100x, 2,78 ml di soluzione 2M KCl e 2,5 ml di antibiotici 100x in Basal Medium Eagle (BME) . Regolare il volume a 250 ml e sterilizzare filtrando.
  9. Preparare il mezzo 25K usando 2,5 ml di glutammina 100x, 2,78 ml di soluzione 2M KCl e 2,5 ml di antibiotici 100x in BME. Regolare il volume a 250 ml e sterilizzare filtrando.
  10. Preparare il medium di 5K usando 2.5 mL di glutammina 100x e 2.5 mL di antibiotici 100X in BME. Regolare il volume a 250 ml e sterilizzare filtrando.
    NOTA: Il mezzo di coltura, mezzo medio 25K e 5K deve essere preparato di recente
  11. Preparare la soluzione di stock FDA aggiungendo 5 mg di FDA a 1 mL di acetone. Conservare la soluzione di riserva FDA a 4 ° C per il magazzinaggio a lungo termine. </ Li>
  12. Preparare la soluzione di riserva PI aggiungendo 1 mg di PI a 1 mL di ddH 2 O. Conservare la soluzione di riserva PI a 4 ° C per diversi mesi.
  13. Preparare la soluzione di magazzino Hoechst aggiungendo 5 mg di Hoechst 33342 a 1 mL di ddH 2 O. Conservare la soluzione di riserva di Hoechst a 4 ° C per diversi mesi.

2. Preparazione di soluzioni di dissezione

NOTA: fare questo 1 d prima della dissezione.

  1. Preparare la soluzione di dissezione aggiungendo 15 ml di buffer Krebs, 1,2 ml di soluzione Mg 2 SO 4 di 3,82% e 0,45 g di albumina Bovine Serum (BSA) a 150 ml di ddH2O. Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
  2. Etichetta 5 tubi da 50 ml come segue: 1, 2, 3, 4 e 5.
  3. Mettere 40 ml di soluzione di dissezione in una siringa da 50 ml con un filtro. Filtrare 30 mL di soluzione di dissezione nel tubo 1 e 2 mL ciascuno a più piatti da 35 mm di colture di cellule, che saranno utilizzati per la lavorazione dei tessuti.
  4. Per tUbe 2, aggiungere 12,5 mg di tripsina in 50 ml di soluzione di dissezione. Mescolare completamente vorticando. Sterilizzare filtrando.
  5. Al tubo 3, aggiungere 1, 2 mg di DNAse I, 7,8 mg di inibitore della soia trypsina e 150 μl di soluzione Mg 2 SO 4 del 3,82% in 15 ml di soluzione di dissezione. Mescolare completamente vorticando. Sterilizzare filtrando.
  6. Al tubo 4, aggiungere 5 ml della soluzione dal tubo 3. Aggiungere 10,5 ml di soluzione di dissezione. Sterilizzare filtrando.
  7. Al tubo 5, aggiungere 100 μl di soluzione Mg 2 SO 4 del 3,82% e 15 μl di 1,2% CaCl2 in 12,5 ml di soluzione di dissezione. Mescolare completamente vorticando. Sterilizzare filtrando.
  8. Conservare tutti i tubi a 4 ° C prima dell'uso.

3. Rivestimento delle piastre di coltura cellulare

NOTA: fare questo 1 d prima della dissezione.

  1. Aggiungere 1 mL di soluzione di stock PLL a 100 mL di ddH2O (concentrazione finale: 5 μg / mL). Plastica del cappottoPiastre di coltura a 6 pozzetti oa 12 pozzetti (2 mL per pozzetto per piastre di coltura a 6 pozzetti o 1 mL per pozzetto per piastre di coltura a 12 pozzetti) aggiungendo 5 μg / mL di soluzione di poli-L-lisina.
  2. Incubare a temperatura ambiente per 1 giorno (oa 37 ° C per 2 ore). 1-2 h prima della dissezione, rimuovere la soluzione usando una pipetta. Lavare una volta con ddH 2 O e asciugare nel cappuccio della coltura cellulare.

4. Trattamento di tessuti per 8 settimane Sprague-Dawley Rats.

  1. Mettere un piatto da 100 mm sul ghiaccio. Decapitate i cuccioli di ratto nel piatto utilizzando una coppia di forbici sterilizzate.
  2. Inserire le forbici nel magnum foramen e tagliare i due lati del cranio, dalle orecchie agli occhi. Sollevare il cranio usando un paio di pinze. Assicurarsi che l'intero cervello sia nel cranio. Isolare il cervelletto e inserirlo nel suddetto piatto da 35 mm utilizzando una coppia di pinze.
  3. Lavorare sotto un microscopio di dissezione. Rimuovere le meningi ei vasi sanguigni con due coppie di pinze.
  4. Tagliate i tessuti con una lama. Mettere i tessuti nel tubo 1. Centrifugare per 5 minuti a RT e 1.500 x g.
  5. Aspirare il surnatante. Salva la pellet.
  6. Aggiungere la soluzione nel tubo 2 al pellet. Risospendere agitando dolcemente.
  7. Mettere il tubo in un bagno d'acqua di 37 ° C per 15 minuti. Scuotere delicatamente ogni 3 min.
  8. Aggiungere la soluzione nel tubo 4 a questa soluzione. Agitare e centrifugare per 5 minuti a RT e 1.500 x g.
  9. Aspirare il surnatante. Salva la pellet.
  10. Aggiungere la soluzione nel tubo 3 per risospendere il pellet.
  11. Preparare due tubi da 15 ml. Mettere metà delle cellule in ogni tubo. Pipette su e giù per 60-70 volte utilizzando una pipetta Pasteur a cotone per homogenizzare le cellule.
  12. Aggiungere 3 ml della soluzione nel tubo 5 ad ogni tubo da 15 ml. Lasciarli sedere a RT per 10 min e quindi rimuovere con cura il surnatante con una pipetta Pasteur a cotone. Posizionare il surnatante in nuovi tubi da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a RT e 1.500 x g.
  13. UNSpira il surnatante. Salva la pellet.
  14. Aggiungere un mezzo di coltura nella pellet per ottenere una densità di cellule di circa 1,5 x 10 6 cellule / ml (circa 100 ml per 10 cuccioli).
  15. Mettete le cellule in piastre di coltura e li coltivate nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 .

5. Aggiunta di Ara-C e D-glucosio durante la coltura

  1. Dopo 24 h, aggiungere la soluzione di base Ara-C (10 μL / pozzetto per le piastre di coltura a 12 pozzetti o 20 μL / pozzetto per piastre di coltura a 6 pozzetti, concentrazione finale: 1 mM) per inibire la crescita delle cellule gliali.
  2. Il giorno 7, aggiungere 50 μL di soluzione di D-glucosio per pozzetto per le piastre di coltura a 12 pozzetti o 100 μl per pozzetto per le piastre di coltura a 6 pozzetti in modo che la concentrazione finale sia di 1 mM.

6. FDA-PI Double Staining e FDA-PI-Hoechst Triple colorazione in CGN Culture

  1. Preparare la soluzione di lavoro FDA-PI aggiungendo 20 μL di soluzione di stock FDA (Concentrazione finale: 10 μg / mL) e 50 μL di soluzione acquosa di PI (concentrazione finale: 50 μg / mL) in 10 mi di PBS. Mescolare vorticando e posizionarlo su ghiaccio.
    1. Per la soluzione di lavoro di FDA-PI-Hoechst, aggiungere 20 μL di soluzione di stock FDA (concentrazione finale: 10 μg / mL), 50 μL di soluzione batterica PI (concentrazione finale: 50 μg / mL) e 10 μL di soluzione di magazzino Hoechst (Concentrazione finale: 5 μg / mL) in 10 mi di PBS. Mescolare vorticando e posizionarlo su ghiaccio.
      NOTA: Preparare di recente la soluzione di lavoro FDA-PI e la soluzione di lavoro FDA-PI-Hoechst prima dell'uso.
  2. Prendere la piastra di coltura cellulare dall'incubatrice. Mettilo in ghiaccio.
  3. Aspirare il mezzo di coltura e sostituirlo con PBS freddo.
    NOTA: La modifica della soluzione deve essere effettuata lentamente e con attenzione. Evitare di toccare le celle con le punte pipetta.
  4. Aspirare il freddo PBS e sostituirlo con soluzione fredda FDA-PI o FDA-PI-Hoechst (500 μL / noiLl per le piastre di coltura a 12 pozzetti o 1 mL / pozzetto per le piastre di coltura a 6 pozzetti). Lasciare in ghiaccio per 5 min.
  5. Aspirare la soluzione di lavoro FDA-PI o FDA-PI-Hoechst e aggiungere PBS freddo (100 μL / pozzetto per le piastre di coltura a 12 pozzetti o 50 μL / pozzetto per piastre di coltura a 6 pozzetti).
    NOTA: Le cellule non devono essere lasciate asciugare quando si scattano le immagini.
  6. Prendere le immagini utilizzando la microscopia fluorescente. Usare un filtro di eccitazione con una banda passante di 450 - 490 nm. Rileva le emissioni di fluorescenza per FDA, PI e Hoechst rispettivamente a 520, 620 e 460 nm. Nelle stesse condizioni, scattare una foto in luce normale utilizzando la modalità di contrasto di fase della microscopia fluorescente.
    NOTA: Prendere le immagini entro 15 minuti dopo la colorazione FDA-PI o FDA-PI-Hoechst. Il tempo di esposizione è 100-300 ms e il guadagno analogico è 2.8x.

7. Valutazione della vitalità neuronale

  1. Per la duplice colorazione FDA-PI, sovrapporre le immagini delle celle rilevate dopo il filtraggioDa diversi filtri di fluorescenza trascinando il livello FDA-positivo sul livello PI-positivo in un software di editor grafico.
    1. Regolare l'opacità del livello FDA-positive immettendo "50%" nel campo "Opacità" del pannello "Livelli". Unire due livelli facendo clic sul pulsante "Unisci visibile" nel menu "Livello". Impostare il contrasto delle immagini sovrapponi digitando "50" nel campo "Contrasto" sotto "Immagine" | "Regolazioni" | "Luminosità / Contrasto". Assicurarsi che non ci sia FDA e PI celle doppie positive nelle immagini sovrapposte.
  2. Per la tripla colorazione FDA-PI-Hoechst, sovrapporre le immagini delle celle rilevate dopo filtrare diversi filtri di fluorescenza trascinando il livello FDA-positivo sul livello PI-positivo in un software di editor grafico. Regolare l'opacità del livello FDA-positive immettendo "50%" nel campo "Opacità" dei "Livelli &34; pannello.
    1. Unire due livelli facendo clic sul pulsante "Unisci visibile" nel menu "Livello". Trascinare il livello Hoechst-positive sul livello unito. Regolare l'opacità del livello Hoechst-positive immettendo "50%" nel campo "Opacità" del pannello "Livelli". Unire i due livelli facendo clic sul pulsante "Unisci visibile" nel menu "Livello".
  3. Separare visivamente le cellule gliali grandi e irregolari da CGN confrontando le immagini scattate in modalità fluorescente con quelle effettuate in modalità di contrasto di fase - le cellule con diametri tre volte più grandi di CGNs sono considerate cellule gliali e vanno escluse.
  4. Contare il numero di neuroni vitali e dei neuroni morti, rispettivamente, utilizzando un plugin di contatore cellulare in un programma di elaborazione delle immagini ( ad esempio, ImageJ) 4 .
    1. Per la duplice colorazione FDA-PI, contrassegnare manualmente le piccole cellule FDA-positive comeNeuroni vitali. Segnare manualmente le cellule PI-positive come neuroni morti. Per la tripla colorazione FDA-PI-Hoechst, contrassegnare manualmente le piccole cellule FDA- e Hoechst-double-positive come neuroni validi. Evidenziare manualmente le cellule PI- e Hoechst-double-positive come neuroni morti.
  5. Calcolare la percentuale di vitalità neuronale usando la seguente equazione:% della vitalità neuronale = numero di neuroni vitali / numero di neuroni morti + numero di neuroni vitali) x 100%. Per ogni pozzo, scegliere cinque campi casuali e mediare la percentuale di vitalità neuronale.

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Representative Results

La doppia immunostaining di GAP43 (rosso) e GFAP (verde) è stata usata per analizzare la forma dei neuroni e delle cellule gliali rispettivamente di 2 , 5 . Entrambi i neuroni e le cellule gliali sono presenti nella coltura CGN. Le cellule gliali GFAP positive sono grandi e irregolari in forma, come indicato dalle frecce nelle immagini ( Figura 1 ). I saggi tradizionali per la vitalità delle cellule non possono distinguere le cellule gliali dai neuroni quando vengono utilizzati per misurare la vitalità neuronale. Pertanto, la colorazione FDA-PI e FDA-PI-Hoechst, che possono distinguere le cellule gliali dai neuroni, sono vantaggiosi per la valutazione accurata della vitalità neuronale nella coltura CGN.

La sfida a basso contenuto di potassio è stata usata per indurre la morte neuronale in una cultura CGN. Le immagini rappresentative mostrano la coltura CGN sfida con un medium di potassio basso (5K), mezzo normale (25K) o origi( Figura 2A ) o la tripla colorazione FDA-PI-Hoechst ( Figura 2B ). La vitalità neuronale misurata con vari metodi è presentata in Figura 3 (media ± SEM). La viabilità delle cellule misurate con la doppia colorazione FDA-PI nei gruppi di controllo, 25K e 5K erano rispettivamente 99,8 ± 4,2%, 98,2 ± 2,9% e 43,9 ± 8,6% ( Figura 3A ). La viabilità delle cellule misurate con FDA-PI-Hoechst triple colorazione nei gruppi di controllo, 25K e 5K, erano rispettivamente 99,8 ± 1,6%, 96,7 ± 4,4% e 48,3 ± 4,4% ( Figura 3B ). Le cellule di viabilità misurate dal test MTT nei gruppi di controllo, 25K e 5K, erano rispettivamente 102,1 ± 3,9%, 96,5 ± 1,7% e 57,5 ​​± 5,7% ( Figura 3C ). Le percentuali di rilascio di deidrogenasi lattica (LDH) nei gruppi di controllo, 25K e 5K sono stati rispettivamente pari a 100,0 ± 5,5%, 94,5 ± 11,2% e 202,1 ± 15,3% 2 . Il dosaggio MTT valuta l'attività di ossidoreductasi cellulare dipendente da NADPH, che riflette il numero di cellule vitali 2 . Tuttavia, questo metodo non ha potuto distinguere le cellule gliali dai neuroni quando viene utilizzato per misurare la vitalità neuronale nella coltura CGN. Utilizzando la colorazione FDA-PI e FDA-PI-Hoechst, il numero delle cellule gliali potrebbe essere escluso e la vitalità neuronale potrebbe essere misurata con precisione. Inoltre, la vitalità neuronale in CGN mediamente trattate da 5K misurate con la colorazione FDA-PI o FDA-PI-Hoechst era leggermente più piccola di quella misurata con il dosaggio MTT. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che la maggior parte delle cellule gliali non sensibili alla neurotossicità mediata da 5K sono state escluse dalla colorazione FDA-PI o FDA-PI-Hoechst, ma non dal test MTT.

Figura 1Figura 1: Entrambi i piccoli neuroni e grandi e irregolari cellule gliali sono presenti nella cultura CGN. Al giorno 8 in vitro, i CGNs sono stati doppio immunostained con GAP43 (rosso) e GFAP (verde) per i neuroni e le cellule gliali, rispettivamente. Le immagini di contrasto di fase mostrano la morfologia delle cellule. I saggi tradizionali per la vitalità delle cellule non possono distinguere le cellule gliali dai neuroni quando vengono utilizzati per misurare la vitalità neuronale. Pertanto, la colorazione FDA-PI e FDA-PI-Hoechst, che possono distinguere le cellule gliali dai neuroni, sono vantaggiosi per la valutazione accurata della vitalità neuronale nella coltura CGN. Barra di scala: 100 μm. Freccia blu: neuroni tipici; Freccia bianca: cellule gliali tipiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
FDA-PI Double Staining e FDA-PI-Hoechst Triple Coloring dimostrano la morte neuronale indotta dal basso potassio nella cultura CGN. Al giorno 8 in vitro , le colture CGN sono state commutate a 5K o 25K di media. Il mezzo nelle colture di controllo non è stato modificato. Dopo 24 ore di sfida, le colture CGN sono state analizzate mediante una doppia colorazione FDA-PI o una tripla colorazione ( B ) FDA-PI-Hoechst. Barra di scala = 100 μm. Freccia: cellule gliali tipiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Quantificazione della vitalità neuronale nella cultura CGN. Al giorno 8 in vitro , le colture CGN sono state commutate a 5K o 25K di media. Il mezzo nella coltura di controlloNon è cambiato. Dopo 24 ore di sfida, la vitalità cellulare è stata analizzata mediante la doppia colorazione FDA-PI ( B ), la colorazione tripolare di FDA-PI-Hoechst e il dosaggio ( C ) MTT. ( D ) La liberazione di LDH è stata analizzata mediante analisi LDH. I dati sono espressi come mezzo ± SEM. ** p <0.01 contro il controllo (ANOVA, test di Tukey). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo è stato modificato da procedure precedentemente descritte 6 , 7 . I ricercatori hanno trascorso il tempo cercando di ridurre la crescita delle cellule non neuronali migliorando le condizioni di coltura dei neuroni primari in vitro 8 . Tuttavia, anche con condizioni di coltura migliorate, alcune cellule gliali rimangono. Inoltre, le cellule non neuronali sono necessarie nelle colture neuronali primarie perché aiutano con la crescita e la maturazione neuronale 9 . In questo studio, Ara-C è stato usato per ridurre al minimo la crescita delle cellule gliali, anche se la coltura CGN era ancora di circa una percentuale di cellule gliali. Questo problema viene presentato anche negli studi di altri gruppi 10 . Nella coltura CGN, le dimensioni e le forme delle cellule gliali sono in gran parte diverse dai neuroni. Il diametro di CGNs è di circa 10 μm, e le mature CGN hanno processi ricchi che collegano i neuroni. HoweIl diametro delle cellule gliali nella coltura è relativamente grande, circa 30-100 μm, per cui è facile distinguere le cellule gliali dai neuroni nelle immagini. Pertanto, un vantaggio della colorazione FDA-PI e FDA-PI-Hoechst è quello di misurare con precisione la vitalità neuronale nelle colture neuronali primarie in cui la crescita delle cellule non neuronali non viene impedita dalle tecniche di coltura.

L'apoptosi indotta da basso potassio nelle colture CGN, con 25K di cellule trattate medie come il controllo, rappresenta un modello eccellente per studiare l'apoptosi neuronale. Molti gruppi, tra cui il nostro laboratorio, hanno utilizzato questo studio classico di studio i meccanismi apoptotici sottostanti dei neuroni 2 , 11 . Pertanto, questo modello è stato usato per indurre la morte neuronale. La concentrazione dei coloranti e la durata della colorazione utilizzata in questo protocollo sono stati ottimizzati. Basse concentrazioni di coloranti e brevi durate di colorazione possono provocare una insufficiente colorazione, portando alla coppia non accurataNting dei neuroni morti. Tuttavia, elevate concentrazioni di coloranti e prolungate durate di colorazione possono ulteriormente indurre la morte neuronale e causare una polarizzazione nella stima della vitalità cellulare. Pertanto, le immagini devono essere prese il più presto possibile dopo che i coloranti vengono aggiunti. Nelle immagini FDA-PI doppie di colorazione, le piccole cellule FDA-positive sono contrassegnate come neuroni vitali. Tuttavia, i corpi cellulari tendono a raggrupparsi nella cultura CGN. Pertanto, può essere difficile separare le cellule vitali dalla colorazione FDA. In questo studio, Hoechst, una macchia nucleare, è stata utilizzata per migliorare l'accuratezza. Le piccole cellule con corpi cellulari FDA-positivi e nuclei Hoechst-positivi possono essere considerati come neuroni vitali nelle immagini triple colorazione FDA-PI-Hoechst.

Rispetto ai test di citotossicità colorimetrica, la colorazione FDA-PI e FDA-PI-Hoechst richiedono più tempo per la valutazione della vitalità neuronale nella coltura CGN. Pertanto, il protocollo attuale potrebbe non essere adatto per la screening di farmaci neuroprotettivi. Tuttavia, questa limitazionePuò essere risolto utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto. Un'altra limitazione di questa tecnica è che CGNs e glial non possono essere discriminati da PI. Tuttavia, poiché i neuroni sono più sensibili alle neurotossine rispetto alle cellule gliali, le cellule morte PI-positive sono principalmente neuroni 12 .

Oltre a FDA, PI e Hoechst, altri coloranti, come MTT, SYTO13 e SYBR14, sono anche utilizzati per misurare la vitalità cellulare 13 , 14 . Per il dosaggio MTT, le cellule gliali che non sono sensibili alle neurotossine possono convertire il MTT in formazano, portando alla sovra-stima della vitalità neuronale. SYTO13 è cellulo-permeabile e ha un elevato rendimento fluorescente verde quando legato a DNA o RNA. Uno studio precedente ha suggerito che la colorazione SYTO13 indica prevalentemente le cellule apoptotiche nella coltura CGN, ma non distingue le cellule gliali dai neuroni 13 . SYBR14 è un colorante acido nucleico permanente a membrana. La doppia colorazione SYBR14-PI è noiPer misurare la vitalità cellulare perché entrambi i coloranti marcano il DNA, evitando così l'ambiguità 14 . Tuttavia, la doppia colorazione SYBR14-PI non può effettivamente distinguere le cellule gliali dai neuroni nella coltura CGN. Pertanto, la colorazione FDA-PI e FDA-PI-Hoechst, che possono distinguere le cellule gliali dai neuroni, sono vantaggiosi per la valutazione accurata della vitalità neuronale nella coltura CGN.

Infine, la colorazione FDA-PI e FDA-PI-Hoechst non si limitano all'analisi della vitalità neuronale nelle colture CGN. Molte colture miste di cellule ( es. Colture corticale primarie e colture primarie ippocampali) contengono anche neuroni e cellule gliali. Pertanto, una simile strategia può essere applicata a quelle colture cellulari miste per analizzare accuratamente la vitalità neuronale.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione della Scienza Naturale della Provincia di Zhejiang (LY15H310007), del Progetto Applicato di Ricerca sulla Tecnologia Nonprofit della Provincia di Zhejiang (2016C37110), della National Science Foundation della Cina (U1503223, 81673407), della Ningbo International Science and Progetto di cooperazione tecnologica (2014D10019), Ningbo Municipal Innovation Team di Life Science and Health (2015C110026), del Guangdong Provincial International Cooperation Project di scienza e tecnologia (No. 2013B051000038), del programma di ricerca di base di Shenzhen (JCYJ20160331141459373), del Guangdong-Hong (GHP / 012 / 16GD), il Consiglio di Grants per Ricerche di Hong Kong (15101014), l'Università Politecnica di Hong Kong (G-YBGQ) e il fondo KC Wong Magna presso l'Università di Ningbo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

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References

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

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Neuroscienza Edizione 123 neuroni granulari cerebrali fluoresceina diacetato ioduro propidio vitalità cellulare cellule gliali microscopia a fluorescenza
Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture
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Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, … More

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

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