Summary
Detta papper presenterar ett högt innehållsmikroskopi-arbetsflöde för samtidig kvantifiering av intracellulära ROS-nivåer, såväl som mitokondriell membranpotential och morfologi - gemensamt betecknad som mitokondriell morfofunktion - i levande vidhäftande celler med användning av cell-permeant fluorescerande reportermolekyler 5- (och- 6) -klorometyl-2 ', 7'-diklorodihydrofluoresceindiacetat, acetylester (CM-H2 DCFDA) och tetrametylrhodamin-metylester (TMRM).
Abstract
Reaktiva syrearter (ROS) reglerar väsentliga cellulära processer inklusive genuttryck, migration, differentiering och proliferation. Överdrivna ROS-nivåer inducerar emellertid ett tillstånd av oxidativ stress, som åtföljs av irreversibel oxidativ skada på DNA, lipider och proteiner. Således ger kvantifiering av ROS en direkt proxy för cellulärt hälsotillstånd. Eftersom mitokondrier är bland de huvudsakliga cellulära källorna och målen för ROS är gemensam analys av mitokondriell funktion och ROS-produktion i samma celler avgörande för att bättre förstå sammankopplingen i patofysiologiska förhållanden. Därför utvecklades en mikroskopibaserad strategi med hög innehåll för samtidig kvantifiering av intracellulära ROS-nivåer, mitokondriellmembranpotential (ΔΨ m ) och mitokondriell morfologi. Den är baserad på automatiserad widefield fluorescensmikroskopi och bildanalys av levande vidhäftande celler, odlade i flera brunnsplattor och staineD med de cellgenomsläppliga fluorescerande reportermolekylerna CM-H2 DCFDA (ROS) och TMRM (A ^ m och mitokondriellmorfologi). I motsats till fluorimetri eller flödescytometri möjliggör denna strategi kvantifiering av subcellulära parametrar vid nivån hos den individuella cellen med hög spatiotemporal upplösning, både före och efter experimentell stimulering. Viktigt är att den bildbaserade naturen av metoden möjliggör extraktion av morfologiska parametrar utöver signalintensiteter. Den kombinerade funktionssatsen används för explorativ och statistisk multivariabel dataanalys för att detektera skillnader mellan subpopulationer, celltyper och / eller behandlingar. Här tillhandahålls en detaljerad beskrivning av analysen tillsammans med ett exempelxperiment som visar sin potential för entydig diskriminering mellan cellulära tillstånd efter kemisk störning.
Introduction
Koncentrationen av intracellulär ROS regleras noggrant genom ett dynamiskt samspel mellan ROS-producerande och ROS-defusionssystem. Ojämlikhet mellan de två provocerar ett tillstånd av oxidativ stress. Bland de viktigaste källorna till ROS är mitokondrier 1 . Med tanke på deras roll i cellulär andning är de ansvariga för huvuddelen av intracellulära superoxid (O 2 • - ) molekyler 2 . Detta resulterar främst från elektronläckage till O2 vid komplex 1 av elektrontransportkedjan under förhållanden med stark negativ inre mitokondriell membranpotential (ψψm), dvs mitokondriell hyperpolarisation. Å andra sidan har mitokondriell depolarisering också korrelerats med ökad ROS-produktion som pekar på flera sätt av åtgärd 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Vidare samverkar ROS genom redoxmodifieringar i proteiner i fission-fusionsmaskineriet med mitokondriell morfologi 9. Exempelvis är fragmentering korrelerad med ökad ROS-produktion och apoptos 10 , 11 medan filamentösa mitokondrier har kopplats till näringshämning och skydd mot Mitofagi 12 . Med tanke på det invecklade förhållandet mellan cellulär ROS och mitokondriell morfofunktion, borde båda idealt kvantifieras samtidigt i levande celler. För att göra exakt detta utvecklades en höghaltig bildningsanalys baserad på automatiserad widefieldmikroskopi och bildanalys av vidhäftande cellkulturer färgade med fluorescerande sonder CM-H 2 DCFDA (ROS) och TMRM (mitokondriell ψψ m och morfologi). Högbildningsavbildning avser extraktion av spAtiotemporalt rik ( dvs stort antal beskrivande egenskaper) information om cellulära fenotyper med multipla komplementära markörer och automatiserade bildanalyser. När de kombineras med automatiserad mikroskopi kan många prover siktas parallellt ( dvs. hög genomströmning), vilket ökar analysens statistiska kraft. En viktig egenskap i protokollet är faktiskt att det möjliggör simultan kvantifiering av flera parametrar i samma cell, och detta för ett stort antal celler och villkor.
Protokollet är uppdelat i 8 delar (beskrivs i detalj i protokollet nedan): 1) Fröskivor i en 96-brunnsplatta; 2) Framställning av stamlösningar, arbetslösningar och bildningsbuffert; 3) Inställning av mikroskopet; 4) Laddning av cellerna med CM-H2 DCFDA och TMRM; 5) Första levande bildrundan för att mäta basala ROS-nivåer och mitokondriell morfofunktion; 6) Andra levande bildningsrunda efter tillsats av tert -butylPeroxid (TBHP) för att mäta inducerade ROS-nivåer; 7) Automatiserad bildanalys; 8) Dataanalys, kvalitetskontroll och visualisering.
Analysen utvecklades ursprungligen för normala humana dermala fibroblaster (NHDF). Eftersom dessa celler är stora och plana, är de väl lämpade för bedömning av mitokondriell morfologi i 2D widefieldbilder 13 , 14 . Med mindre ändringar är denna metod dock tillämplig på andra vidhäftande celltyper. Vidare uppfyller arbetsflödet bredvid kombinationen av CM-H 2 DCFDA och TMRM ett flertal fluorescerande färgpar med olika molekylspecifikationer 1 , 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet nedan beskrivs som utfört för NHDF-celler och med användning av multiwellplattorna som anges i materialfilen. Se Figur 1 för en generell översikt över arbetsflödet.
1. Framställning av reagens
- Förbered fullständigt medium genom att komplettera Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% v / v fetalt bovint serum (FBS) och 100 IE / ml penicillin och 100 IE / ml streptomycin (PS). För 500 ml komplett medium tillsätt 50 ml FBS och 5 ml PS till 445 ml DMEM.
- Förbered HBSS-HEPES (HH) bildbuffert genom att komplettera Hanks balanserade saltlösning (med magnesium och kalcium, men utan fenolröd) med 20 mM HEPES. För 500 ml HH tillsätt 10 ml 1 M HEPES stamlösning till 490 ml HBSS. Verifiera pH och vid behov justera till pH 7,2.
- Förbered 1 mM CM-H2 DCFDA stamlösning genom att lösa 50 μg CM-H2 DCFDA lyofiliserat pulver i 86,5 &# 181; L vattenfritt DMSO. Blanda genom vortexing eller pipettering upp och ner och gör 20 μl alikvoter i bruna mikrocentrifugrör. Förvara i mörkret vid -20 ° C och använd inom 1 vecka. Om den lagras under N 2- atmosfär kan hållbarheten ökas upp till minst 1 månad.
- Förbered 1 mM TMRM stamlösning genom att lösa 25 mg TMRM-pulver i 50 ml vattenfri DMSO. Blanda genom vortexing eller pipettering upp och ner och gör 10 μl alikvoter i bruna mikrocentrifugrör. Förvara i mörker vid -20 ° C. Denna lösning är stabil i minst ett år.
- Förbereda en ny alikvot av Tert -butylperoxid (TBHP) lager (~ 7 M) för varje experiment genom att direkt pipettera en volym från 70% stamlösning (10 μl / 96 brunnsplatta). Håll denna alikvot vid 4 ° C tills vidare användning.
- Förbered antikroppslösning (AB) genom att späda två sekundära antikroppar (Alexa Fluor 488 åsna anti-kanin och CY3-åsna anti-kanin) 1000 gånger i 1x HH-buffer.
2. Inställning av mikroskop och förvärvsprotokoll (± 15 min)
OBS! Bildförvärv utförs med ett brettfältmikroskop utrustat med automatiserade scener och fönsterluckor samt ett maskinbaserat autofokussystem med ett 20X luftplanriktat mål (NA = 0.75) och en EM-CCD-kamera. Vid inrättandet av analysen för första gången används en testplatta som innehåller kontrollceller, färgade enligt protokollets instruktioner, för att kalibrera XY-scenen och för att optimera förvärvsinställningarna. Om inköpsinställningarna redan har bestämts kan kalibreringen göras med en tom skylt.
- Sänk objektivet till den absoluta basnivån och kalibrera XY-scenen enligt programvaruanvisningarna.
- Se till att rätt filterkubar är installerade. För att visualisera CM-H 2 DCFDA använd en vanlig GFP filterkub med ett 472/30 nm exciteringsbandpassfilter, en 495 nm cutoff dichroIc-spegel och ett 520/35 nm bandpassutsläppsfilter. För TMRM, använd en filterkub för TRITC med ett 540/25 nm bandpass excitationsfilter, en 565 nm cutoff dikroisk spegel och ett 605/55 nm bandpass emissionsfilter.
- Skapa ett bildprotokoll med hjälp av förvärvsprogrammet.
- Välj rätt typ av multiwellplatta (tillverkare och kod) från listan över tillgängliga plattor som finns i programvaran. Alternativt definierar du ditt eget multiwellplattformat med hjälp av platta och brunnsdimensioner.
- Justera brunnskivan enligt programmets instruktioner, t.ex. genom att definiera två hörn av de fyra yttre hörnbrunnarna. Detta steg täcker för variation av kameroröring.
- Välj brunnar som måste förvärvas. Om det här alternativet inte är tillgängligt i programvaran, använd en uppsättning manuellt definierade XY-platser som motsvarar de valda brunnarna.
- Optimera förvärvsinställningarna (exponeringstid, lampintensitet, EM-förstärkning) för thE två kanaler separat med hjälp av testplattan. Minimera exponering och intensitet som fluorescens excitationsljus i sig inducerar ROS. Men se till att signalen till bakgrundsförhållandet är minst 2 för basal CM-H 2 DCFDA och 3 för TMRM före TBHP-behandling, och att det inte finns någon mättnad efter TBHP-behandling. Förvärvsinställningarna beror väldigt på mikroskopi-inställningen och den celltyp som används, men som referens är de vägledande inställningarna vid användning av en metallhalogenlampa på 130 W som ljuskälla och NHDF-celler färgade enligt protokollets instruktioner följande: för båda CM- H 2 DCFDA och TMRM används en exponeringstid på 200 ms och ND-filter 8, kombinerat med en EM-förstärkning av 15 (13 MHz, 14 bit) respektive 4 (27 MHz, 14-bit). En gång optimerad för en viss inställning och celltyp kan detta steg hoppas över.
OBS! Det är viktigt att anskaffningsinställningarna hålls desamma under hela bildprocessen. För storskaliga, flerdagars experiment, lamp staFörmåga bör garanteras med regelbunden kvalitetskontroll. - Definiera ett förvärvsprotokoll, bestående av ett sekventiellt lambda (våglängd) förvärv. Välj CM-H 2 DCFDA-kanalen som ska förvärvas först för att minimera ljusexponering före mätningen.
- Definiera en brunnplansslinga för att skaffa 4 regelbundna, icke-överlappande bilder placerade runt mitten av varje brunn i brunnsvalet med hjälp av förvärvsprotokollet definierat i 2.3.4. Välj böjande bildförvärv, dvs först från vänster till höger, från brunn B02 till B11, sedan tillbaka, från höger till vänster, från brunn C11 till C02 och så vidare ( Figur 2A ). Detta sparar tid jämfört med vänster-till-höger bildupptagning. Om det här alternativet inte är tillgängligt i programvaran, justera den anpassade uppsättningen XY-platser som skapats i 2.3.3 för att ta på detta bildmönster.
- Spara XY-koordinaterna för bildhanteringspositionerna ( t.ex. i en separat xml-fil), så att det blir lätt att se överNg vid omkalibrering av mikroskop. Detta är särskilt viktigt om avläsningen från denna analys måste korreleras med en post-hoc immunofluorescens (IF) -färgning för samma celler.
3 . Seedceller i en 96-brunnsplatta (45 - 90 min beroende på antalet olika celllinjer)
- Arbeta i steril miljö, såsom ett klass 2 biosäkerhetsskåp och slithandskar.
- Dekontaminera alla ytor och material med 70% volym / volym etanol i destillerat vatten.
- Ta en cellodlingskolv med en 90% konfluent cellkultur från inkubatorn och placera den i biosäkerhetskåpan.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS 1x.
- Tillsätt lämplig mängd 0,05% trypsin-EDTA-lösning på cellerna, se till att den fullständiga cellytan är täckt ( t ex 1 ml för en T25-kolv) och inkubera i 2 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
- Om alla celler lossnar (kontrollera med ett mikroskop ), Tillsätt odlingsmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin; ± 4 ml i en T25-kolv) för att inaktivera trypsin-EDTA-lösningen.
- Centrifugera i 5 minuter vid 300 xg vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i odlingsmedium. Bestäm mängden medium för varje celltyp för att erhålla en cellkoncentration som är kompatibel med cellräkning. Typiskt innehåller en 90% konfluent T25-kolv av NHDF cirka 1-1,5 miljoner celler, som resuspenderas i 3-4 ml odlingsmedium.
- Räkna cellerna med hjälp av en cellräkningskammare eller Coulter-räknare.
- Säd 8 000-10 000 celler i var och en av de inre 60 brunnarna i en svart 96-brunnsplatta med en tunn kontinuerlig polystyren eller glasbotten (svart för att undvika spridning och korsprutning mellan närliggande brunnar under bildbehandling). Vid användning av olika förhållanden / behandlingar / cellinjer, fördela sina såddplatser homogent på plattan för att minimera plattaffekter (Fig.> Figur 2A). De yttre brunnarna, med undantag för brunn B01 och A01, används inte eftersom de är mer benägna att kanten effekter.
- Säd 8 000-10 000 celler i B01. Denna brunn kommer att användas för fokusjustering, precis före bildförvärvet.
- Fyll de tomma yttre brunnarna med medium för att minimera gradienterna (temperatur, fuktighet etc. ) mellan brunnarna och miljön.
- Tryck försiktigt på tallriken tre gånger innan du placerar den tillbaka i inkubatorn för att undvika att celler växer i fläckar.
- Kultur cellerna i 24 timmar, eller upp till en sammanflödesgrad på ca. 70%.
- Spara behandlingsinformationen för experimentet i ett kalkylblad som heter "Setup.xlsx". Filen ska innehålla fyra kolumner och kommer att användas för att länka behandlingar med brunnar och bildinformation under dataanalys. De fyra kolumnerna är: "Nå", "Behandlingsnummer", "Behandling" och "Kontroll" (en rad per brunn). Varje behandling är koppladMed ett unikt behandlingsnummer, som används vid datavisualisering för att bestämma ordningen för behandlingarna på plotens X-axel. Kontrollkolumnen anger den behandling som fungerar som kontroll för behandlingen i nuvarande rad. Illustrationer av en typisk experimentell layout och motsvarande installationsfil visas i Figur 2 .
4. Laddning av cellerna med CM-H 2 DCFDA och TMRM (± 45 min)
OBS! Hantering av cellerna på experimentens dag kan utföras i en steril miljö (biosäkerhetskåpa), men detta är inte obligatoriskt eftersom cellerna kommer att kasseras eller fixeras direkt efter analysen.
- Värm HH-bufferten till 37 ° C.
- Förbered en 20 μM TMRM-arbetslösning genom att späda 1 mM stamlösningen 50 gånger i HH-buffert (tillsätt 490 μL HH-buffert till 1 alikvot av 10 μl TMRM stamlösning).
- Förbered en belastningLösning med 2 | im CM-H2 DCFDA och 100 nM TMRM. För detta ändamål späd ut 1 mM CM-H2 DCFDA stamlösning 500x och 20 μM TMRM arbetslösning 200x i HH-buffert.
- Typiskt, för 60 brunnar, framställa 7,5 ml laddnings-lösning genom tillsats av 15 pl CM-H2 DCFDA och 37,5 μl TMRM-lösning till 7447,5 μL HH.
- Kassera odlingsmediet från cellerna genom att vrida plattan upp och ner i en rörlig rörelse.
- Tvätta varma cellerna två gånger med HH-buffert med hjälp av en flerkanalspipett (100 μl / brunn). Kassera HH-bufferten mellan tvättstegen genom att vrida plattan upp och ner i en rörlig rörelse.
- Ladda cellerna med CM-H 2 DCFDA och TMRM genom att tillsätta 100 μL av laddningslösningen till varje brunn igen med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera i 25 minuter i mörkret vid rumstemperatur. Glöm inte väl B01.
- Under dessa 25 min ska du förbereda arbetslösningar för oxidationsmedlet TBHP och se till att mikroskopet och tillbehörsmaskinen är påslagen.
- Förbered arbetslösning I: Späd 7M stamlösningen 70x till 100 mM (10 μl lager i 690 μL HH-buffert).
- Förbered arbetslösning II: Späd WS I 100x till 1 mM (10 μl WS I i 990 μL HH-buffert).
- Förbered arbetslösning III: Späd WS III 25x till 40 μM (för 60 brunnar tillsätt 300 μL WS II i 7200 μL HH-buffert).
- Efter 25 min, tvätta cellerna igen två gånger med 100 | il HH-buffert som beskrivet tidigare.
- Tillsätt 100 μl HH-buffert till alla 60 inre brunnar.
5. First Live Imaging Round för att mäta basala ROS-nivåer och mitokondriell morphofunktion (± 15 min)
- Se till att förvärvsprogrammet är i drift och bildprotokollet laddas.
- Installera plattan på mikroskopet, sätt på maskinvaran baSed autofokus-systemet och använd brunn B01 för att justera autofokusförskjutningen med hjälp av TMRM-kanalen. Eftersom denna procedur inducerar en ökning i CM-H2 DCFDA-signalintensitet utesluts denna brunn från nedströms bildanalys.
- Kör bildbehandling protokollet.
6. Second Live Imaging Round efter tillsats av TBHP för att mäta inducerade ROS-nivåer (± 20 min)
- Ta försiktigt bort 96-brunnsplattan från mikroskopet.
- Tillsätt 100 μl TBHP WS III (40 μM) till varje brunn med en flerkanalspipett (Detta resulterar i en 20 μM TBHP-koncentration i brunnarna). Denna förening används som en intern positiv kontroll för CM-H 2 DCFDA-färgning (signalen bör stiga) såväl som ett sätt att mäta inducerade ROS-nivåer.
OBS: H 2 O 2 kan också användas istället för TBHP, men denna förening är mindre stabil och därför mindre tillförlitlig. - Vänta minst 3 minuter för att tillåta fullständig reaktion av TBHP wI CM-H 2 DCFDA.
- Under denna tid tillsätt 100 μL antikropps-arbetslösning (1/1000) till brunn A01.
- Montera plattan tillbaka på mikroskopet och kontrollera fokus igen med brunn B01.
- Få samma positioner som i den första bildrundan med samma bildprotokoll.
- Exportera de förvärvade datauppsättningarna i en enda mapp som enskilda tiff-filer med hjälp av standardiserade nomenklaturer som inkluderar hänvisning till plattan, före eller efter TBHP-behandling, brunn, fält och kanal, åtskilda med understreck, t.ex. 'P01_Pre_B02_0001_C1' för platta 1, pre-TBHP-behandling, brunn B02, fält 1 och kanal 1. Denna information kommer att användas under bildanalys ( t.ex. för att välja lämpliga segmenteringsinställningar), liksom vid dataanalys (för att ansluta analysdata Med rätt behandlingar).
- Skaffa platta bilder för båda kanalerna på alla fyra positionerna runt mitten av brunn A01 med anskaffningsprotokollet. Spara thEm som enskilda tiff-filer i samma mapp som de andra bilderna med följande standardiserade nomenklatur: 'P01_FF_A01_0001_C1' för platta 1, fält 1 och kanal 1. Se till att signalerna ligger bra inom det dynamiska området. Vid mättnad, använd en lägre koncentration av antikropps arbetslösning.
- Kassera plattan eller spara för vidare bearbetning.
OBS! Istället för att ta bort plattan från mikroskopet och använda en flerkanalspipett för att lägga till TBHP-lösningen, kan en automatiserad pipett installeras på mikroskopsteget och anslutas till förvärvsprogrammet för att fungera vid mottagning av en trigger. Detta möjliggör för TBHP att läggas till varje brunn direkt efter det första förvärvet innan de flyttas till nästa brunn. På det här sättet, när den första avbildningsrundan är färdig, kan den andra starta direkt och alla brunnar har haft en jämn inkubationstid med TBHP.
7. Bildbehandling och analys (± 30 min per96-brunnsplatta)
OBS! All bildbehandling utförs i FIJI (http://fiji.sc), en förpackad version av ImageJ freeware. Ett dedikerat skript skrevs för automatisk analys av intracellulära ROS- och mitokondriala signaler, liksom morfologiska parametrar (RedoxMetrics.ijm, tillgänglig på begäran). De underliggande algoritmerna beskrivs i Sieprath et al. 1 .
- Se till att FIJI är installerad och fungerande.
- Starta FIJI och installera makrouppsättningen (Plugins -> Macros -> Install ...). Detta kommer att påkalla ett antal nya makrokommandon samt en uppsättning handlingsverktyg för att optimera analysinställningarna, som visas i figur 3A .
- Öppna inställningsgränssnittet för att ställa in analysinställningarna genom att klicka på "S" -knappen ( Figur 3B ).
- Välj bildtyp, antal kanaler och brunnen som användesFör att förvärva platta bilder.
- Ange vilken kanal som innehåller celler (CM-H 2 DCFDA-kanal) eller mitokondrier (TMRM-kanal) och justera förbehandlings- och segmenteringsparametrarna för varje kanal beroende på bildkvaliteten ( Figur 3B ). Markera kryssrutorna "Bakgrund" och "Kontrast" för att utföra bakgrunds subtraktion eller kontrastbegränsad adaptiv histogramutjämning 16 . Definiera en sigma för Gaussian suddning av celler och Laplacian förbättring av mitokondrier. Välj en automatisk tröskelalgoritm och fyll i gränserna för begränsning av storlek (i pixlar). Om en bestämd tröskel väljs istället för en automatisk tröskelalgoritm, fyll i övre tröskeln.
- Testa segmenteringsinställningarna på några få markerade bilder av de förvärvade dataseten genom att öppna dem och klicka på "C" eller "M" -knapparna i menyn för cell- eller mitokondrier-segmentering,Och justera inställningarna om det behövs. Ett exempel resultat visas i figur 3C .
- Kör batchanalysen på den eller de intressanta mapparna genom att klicka på knappen "#" och välj mappen med bilderna. Per mapp skapar detta en ny "Output" -katalog som innehåller enskilda ROI-satser (zip-filer) och resultatfiler (.txt) per bild. För båda kanalerna innehåller resultatfilen intensitet och morfologiska deskriptorer. CM-H 2 DCFDA-kanalens (cells) resultatfil innehåller per beskrivning medelvärdet för de kombinerade ROI-värdena inom en bild. För TMRM-kanalen innehåller resultatfilen per beskrivning värdet för varje individuellt segmenterad mitokondriell ROI.
- Efter batchanalys, verifiera segmenteringsprestandan visuellt på en "Verifieringsstack", en hyperstack av alla bilder med respektive ROI-överlagring genom att klicka på "V" -knappen. På detta sätt kan artefakter som över-/ Undersegmentering, bilder utan bild eller dammpartiklar / fibrer i bilder kan redan ses snabbt. Ytterligare kurering kan göras under datakvalitetsstyrning (se §8).
8. Dataanalys, kvalitetskontroll (QC) och visualisering
Bearbetning och analys av rådata görs med hjälp av R statistiskt freeware (http://www.rproject.org - version 3.3.2) och RStudio (http://www.rstudio.com/ - version 1.0.44). För att snabbt få fram och visualisera resultaten har en intuitiv glänsande applikation 17 (tillgänglig på förfrågan) blivit uppfattad som integrerar och visualiserar data i värmekartor och boxplots och utför även statistiska analyser. I allmänhet består arbetsflödet av två på varandra följande steg. Först behandlas data och inspekteras per 96-brunnsplatta för att upptäcka avvikande datapunkter. För det andra kombineras kurerade data från alla plattor av ett givet experiment och analyseras med användning av icke parametrisk multiVariatortest 18 och en huvudkomponentanalys.
- Se till att R och RStudio är installerade och funktionsdugliga.
- Starta RStudio.
- Öppna den glänsande applikationen RedoxMetrics och kör appen (välj att köra den i en extern webbläsare).
- På sidan "Inmatning" väljer du katalogen där resultatfilerna från RedoxMetrics.ijm finns.
- Se till att 'Setup.xlsx' (skapad i steg 3.15) också finns i den här katalogen.
- Resultatfilerna och installationsinformationen importeras automatiskt, omarrangeras och visualiseras.
- Sidan "Experimentell inställning" visar experimentets layout. Använd den här sidan för verifiering.
- Nästa sida, "resultat per platta" visar data för varje platta separat i en färgkodad flerväggsplattform samt i boxplots med outliers märkta med brunnnamn och bildnummer. Den senare möjliggör enkel inspektion och identOmgivning av avvikande datapunkter (extremt höga eller låga värden jämfört med de genomsnittliga värdena som uppmätts för den specifika behandlingen - se Figur 4 för ett exempel).
Använd denna information genom att verifiera bilderna som motsvarar avvikande punkter. Om avvikelser upptäcks måste de avlägsnas från analysen. De flesta avvikelser orsakas av felaktig segmentering när (del) av bilden är out of focus, eller när starkt fluorescerande dammpartiklar stör ordentlig segmentering. Extrema fall kan redan upptäckas snabbt med Verktygsstabilitetsverktyget (steg 7.5), men mer subtila händelser upptäcks vid detta steg. När ingen uppenbar eller teknisk orsak kan hittas för avvikande värde ska bilden inte tas bort från analys. - Valfritt: skapa ett nytt kalkylblad som heter "Drop.xlsx" med endast en kolumn som heter "Drop". I denna kolumn, lista filnamnen (inklusive ".tif" -tillägg) av alla bilderSom måste avlägsnas från analysen (identifierad i steg 7.5 eller steg 8.6.2). Ladda upp den här filen med hjälp av sidan "inmatning".
- Resultatet av hela experimentet visar resultaten från alla plattor i kombination. Om en droppfil har laddats upp, används den här filen för att ta bort de angivna datapunkterna från analysen.
För varje parameter individuellt normaliseras data per plåt enligt deras respektive kontroller. Data från alla plattor kombineras därefter, följt av icke parametriska multivariata tester från nparcomp-paketet 18 . Om endast 2 behandlingar jämförs görs två provprov för det icke-parametriska Behrens-Fisher-problemet. För mer än 2 behandlingar används ett icke-parametriskt kontrastbaserat multipla jämförelsetest. Resultaten visualiseras med hjälp av rutplotter. - "Cluster Analysis" -sidan visar resultaten från en huvudkomponentanalys (PCA-R-kärnstatistikpaketet). Data från 5 parametrar (baSal och inducerad ROS och mitokondriell membranpotential, storlek och cirkularitet) kombineras för att diskriminera de olika behandlingarna baserat på en känslig redoxprofil. För detta ändamål utförs en huvudkomponentanalys (PCA) (R-kärnstatistik). Resultaten visualiseras med hjälp av en biplot (ggbiplot-paketet - http://github.com/vqv/ggbiplot).
- Använd sidan för nedladdningsdata för att ladda ner de bakåtliggande datarammerna som innehåller bearbetade och omarrangerade data så att de kan återanvändas för mer avancerad datavisualisering eller statistiska analyser.
OBS: Typiska fallgropar och potentiella lösningar finns listade i Tabell 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen har benchmarkats med användning av flera kontrollexperiment, vars resultat beskrivs i Sieprath et al. 1 . I korthet har fluorescensresponsen hos CM-H2 DCFDA och TMRM till externt inducerade förändringar i intracellulär ROS respektive Avm kvantifierats för bestämning av det dynamiska området. För CM-H2 DCFDA visade NHDF en linjär ökning av fluorescenssignalen när den behandlades med ökande koncentrationer av TBHP mellan ett intervall av 10 | im till 160 | im. På samma sätt demonstrerade NHDF-celler för en TMRM en linjär ökning av mitokondriell fluorescens när de behandlades med ökande koncentrationer av oligomycin (vilket inducerar Δψm-hyperpolarisering) inom ett område av 1 till 10 μg / μl. Omvänt resulterade realtidstillägg av valinomycin, ett antibiotikum som inducerar Δψm depolarisering, i en gradvis kvantOmöjlig minskning av TMRM-fluorescens .
Analysen har också använts i ett flertal experiment för att avslöja skillnader i redoxstatus mellan celltyper eller behandlingar 1 , 15 . För att illustrera detta visas resultaten av ett experiment där NHDF behandlades med HIV-proteashämmaren Saquinavir (SQV) ( Figur 5 ). Med användning av det beskrivna protokollet detekterades en signifikant ökning för både basala och inducerade ROS-nivåer jämfört med kontrollceller behandlade med DMSO ( Figur 5B ). SQV-behandling påverkade också signifikant mitokondriell morfofunktion. Morfologiskt förvärvade mitokondrier ett mycket fragmenterat mönster, vilket också bekräftades av en högre cirkularitet och mindre medelstorlek hos de enskilda mitokondrierna. Funktionellt, Δψ m , uppmätt som genomsnittlig TMRM-signal per mitokOndrial pixel ökade också signifikant ( Figur 5A ). När man kombinerar data för de 5 parametrar som beskrivits ovan kan de två tillstånden (kontroll och SQV) tydligt separeras från varandra genom huvudkomponentanalys. Data från tre oberoende biologiska replikat visas i en 2D-biplot som visar de två första huvudkomponenterna, vilket förklarar 81,4% av den totala variansen ( Figur 5C ). Detta visar analysens robusthet och föreslår att den kombinerade avläsningen kan fungera som en känslig indikator för cellulär hälsotillstånd.
Figur 1 : Allmän översikt över analysen med hög innehållsimaging för samtidig mätning av intracellulära basala och inducerade ROS-nivåer och mitokondriell morfofunktion. ( A ) SKemisk representation av de viktigaste verksamhetsblocken. ( B ) Illustrerat exempel: celler utsöndras i flera identiska 96-brunnsplattor. En standard brunnplatta layout visas mer i detalj i Figur 2A . Efter färgning förvärvas 4 bilder per kanal runt mitten av varje brunn, både före och efter TBHP- behandling, vilket illustreras av de stora montagen med insats. Efter bildanalysen visualiseras intensitetsresultat med hjälp av en intuitiv värmekarta som projiceras på brunnskivans layout. Detta medger snabb detektering av plattaffekter eller avvikande brunnar. Efter härdning av de fullständiga experimentella datasætten utförs slutdataanalys som resulterar i enstaka och flera parametervärden. (Den här siffran ändrades från referens 1 , med tillåtelse från Springer) Vänligen klicka här för att se ett större versioN av denna figur.
Figur 2 : En typisk experimentell 96-brunns layout och motsvarande "Setup" -fil. ( A ) 4 olika förhållanden fördelas homogent över plattans inre 60 brunnar. Tja B01 innehåller också celler, men används bara för att justera den ursprungliga PFS-förskjutningen strax före bildbehandling. De andra yttre brunnarna fylls endast med odlingsmedium för att minimera gradienter (temperatur, fuktighet etc. ) under cellodling. Bildförvärv sker på ett meanderande sätt, dvs först från vänster till höger, från brunn B02 till B11, sedan tillbaka, från höger till vänster, från brunn C11 till C02 och så vidare. Efter bildförvärv förvärvas platta bilder i brunn A01, som används för att korrigera rumslig heterogenitet under bild och ALYS. ( B ) Den motsvarande installationsfilen (Setup.xlsx) är ett kalkylblad som innehåller information om experimentets layout. Det specificerar läget för varje behandling i multiwellplattan och deras respektive kontroller. Varje rad representerar en brunn. Varje behandling har sitt eget unika behandlingsnummer, vilket används för att specificera ordningen för behandlingarna på X-axeln hos de genererade tomterna under dataanalys. Kolumnen "Kontroll" innehåller den behandling som ska användas som en kontroll för normalisering av data för behandlingen som anges i samma rad. I exemplet är behandling 1 behandlingen som används som kontroll för normalisering av data från alla andra behandlingar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
9 / 55449fig3.jpg "/>
Figur 3 : RedoxMetrics Macro-set, Layout och Setup Interface. ( A ) När Macroset för RedoxMetrics för FIJI är installerat, skapas ett antal nya makrokommandon samt en uppsättning handlingsverktyg för att testa och optimera analysinställningarna i menyraden. 'S' kallar inställningsgränssnittet. 'F' utför en flatfältkorrigering på en öppen bild. 'C' och 'M' utför en testsegmentering för cellulära områden ("Cell", CM-H2DCFDA-kanalen) och mitokondriella regioner ("Mito", TMRM-kanaler) respektive på en enda öppnad bild med de analysinställningar som valts i inställningen Gränssnitt, vilket ger en överlagring av de segmenterade regionerna av intresse (ROI). '#' Utför batchanalys i en mapp med bilder med de inställningar som anges i installationsgränssnittet (vanligtvis efter verifiering på ett eller några bilder). 'V' skapar en verifieringsstapel usinG utgångsdata från batchanalysen. Denna hyperstack är en sammansatt bild av alla råbilder som finns i mappen och deras respektive regioner av intresse (ritad i en andra kanal). 'O' kan klickas för att visa eller dölja överlagringen i segmentområdet. ( B ) Setup-gränssnitt. Här väljs alla analysinställningar, inklusive allmän information som bildtyp (förlängning), antal kanaler (våglängder) och brunnen som användes för flatfältkorrigering. Därefter finns inställningar som är specifika för bildinnehållstypen (Cell eller Mito). I båda fallen finns det alternativ (kryssrutor) för att inkludera en bakgrundskorrigering ("bakgrund") och lokal kontrastförbättring ("kontrast"). För cellsegmentering finns det möjlighet att definiera en gaussisk suddradius (sigma) för att minska bruset. För mito segmentering finns det möjlighet att definiera radien hos en Laplacian operatör för selektiv förbättring av mitokondrier. Efterföljande segmentering är pFormateras med en automatisk (eller fast) tröskelmetod som kan definieras per innehållstyp. När ett fast tröskelvärde väljs kan det övre gränsvärdet tillhandahållas manuellt. Slutligen kan analysen begränsas till ett urval av objekt som faller inom ett minimum och en maximal storlek. ( C ) Ett exempel på ett segmenteringsresultat som körs med kommandot "C" (topp) eller "M" (nederst), som visas som den råa bilden i grått överlagrad med de regioner som är intresserade av gult. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Illustrerat exempel på mellanliggande datavisualiseringar. ( A ) Multiwellplatta visualisering där brunnar B02 och D07 uppträdermisstänksam. ( B ) Boxplot som representerar samma data, med outliers märkt med brunnnamn och bildnamn. Tillsammans med F03_0003 återkommer bilder från B02 och D07 som outliers. ( C ) Visuell inspektion av dessa bilder visar att B02_0000 och D07_0001 bör avlägsnas från ytterligare analys eftersom det finns segmenteringsfel (illustrerad av den röda "X"). F03_0003 bör hållas eftersom det inte finns någon tydlig segmentering eller ett tekniskt fel. (Om ingen teknisk orsak finns för avvikelsen, ska data inte tas bort). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5 : Effekt av Saquinavir (SQV; 20 uM) på primär human FibrOblasts (kontroll är DMSO). ( A ) Mitokondriell membranpotential (ΔΨ m ) och mitokondriell morfologi (cirkuläritet och medelstorlek hos enskilda mitokondrier), mätt med TMRM ( B ) Ökade basala nivåer av intracellulär ROS, mätt med CM-H 2 DCFDA och respons mot inducerad ROS, uppmätt Som relativ förstärkning i intensitet efter tillsats av 20 ^ M TBHP tillsats. ( C ) 2D-scatterplot av de första 2 huvudkomponenterna (PC) från en PCA-analys på de 5 variablerna som beskrivits ovan (basala och inducerade ROS-nivåer, genomsnittlig mitokondriellstorlek, cirkuläritet och ΔΨ m ). De svarta pilarna representerar anvisningarna för de ursprungliga 5 variablerna med avseende på huvudkomponenterna. (Oberoende replikar är plottade med en annan färg; Alla data normaliseras med avseende på DMSO-kontrollen; * = p-värde <0,05; ** = p-värde <0,01; *** = p-värde <0,001; Y -Axlar har anpassats för att optimalt visa skillnaderna; Denna siffra ändrades från referens 1 , med tillåtelse från Springer) Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Problem | Potentiell anledning | Möjlig lösning |
| För få celler i brunnarna under bildbehandling | För få celler utsäde | Säd flera celler 24 timmar före bildbehandling |
| Dålig celltillväxt | Kontrollera odlingsförhållandena (medium, temperaturstabilitet, CO 2 -kontroll) | |
| För våldsamma tvättsteg | Undvik att tvätta cellerna bort, pipett försiktigt | |
| För många celler i brunnarna under bildbehandling | FörMånga celler utsäde | Frö mindre celler 24 timmar före bildbehandling |
| Svaga signaler eller icke-linjärt svar på CM-H 2 DCFDA-fluorescens till stimulans | Används för låg / hög färgkoncentration | Om man använder andra än NHDF-celler måste optimala belastningskoncentrationer bestämmas empiriskt |
| Färgbelastningen är otillräcklig | Tillsätt 0,02% vikt / volym av surfaktanten Pluronic-127 till laddningslösningen för att öka upptagningen. | |
| CM-H 2 DCFDA-signalen ökar visuellt under exponeringstiden | För hög färgkoncentration | Minska färgkoncentrationen |
| Exciteringsintensiteten är för hög | Minska exciteringsintensiteten genom att använda ND-filter och / eller minska exponeringstiden | |
| CM-H2 DCFDA-intensiteten minskar under förvärv av brunnplattan | CM-H 2 DCFDA läcker ut urCellen. | Använd 2 mM probenicid (anionspumpinhibitor). Lägg till laddningslösningen, liksom bildbildningsbufferten för att minska läckaget |
| Det finns ingen ökning av CM-H 2 DCFDA-signalintensitet efter tillsats av TBHP | TBHP är inte aktiv | Använd färsk TBHP |
| CM-H 2 DCFDA läcker ut ur cellen. | Använd probenicid som beskrivet ovan. | |
| (Några av de) förvärvade bilderna ser out-of-focus, medan fokus verkar ok när det kontrolleras. | Plattan är monterad lutad vilket medför att fokuset sträcker sig bortom PFS-förskjutningen | Kontrollera monteringen av plattan och scenen, Placera plattan |
| Plattans botten innehåller damm eller oegentligheter | Rengör botten på plattan med ett etanolvättat linspapper | |
| Celler dör under bildbehandling | Minska exciteringsintensiteten eller få färre bilder per brunn. | |
| Felaktig bildningsbuffertkomposition | Remake imaging-buffert | |
| Det finns inga fluorescerande fläckar i bilderna | Friliggande celler flyter ur fokus | Tvätta mer försiktigt under laddningsprotokollet |
| En eller flera kolumner har en lägre lägre intensitet än de andra brunnarna på plattan | En eller flera tips från flerkanalspipetten var inte ordentligt fästa och därför tillsattes mindre reporter till dessa brunnar | Kontrollera noggrant om alla tips är fyllda perfekt när du använder en flerkanalig pipett. |
| Fokus driver dramatiskt under bildförvärv | Polystyrenbotten på plattan kan reagera med nedsänkningsolja vid användning av en oljelins | Använd en torr lins, eller använd en multiwellplatta med ett glasögonSs botten |
| TMRM-signalintensiteten ökar mellan avbildning av den första och sista brunnen | Reporter laddningstid var inte tillräckligt länge, TMRM är fortfarande jämviktande | Öka reporterens laddningstid |
| CM-H 2 DCFDA-signal efter TBHP-behandling ökar under förvärv av brunnplattan | Tiden mellan behandling med TBHP och början på den andra bildrundan var inte tillräckligt länge, TBHP oxiderar fortfarande CM-H2 DCFDA. | Öka inkubationstiden mellan behandlingen med TBHP och den andra bildrundan. (Börja med minst 3 min) |
| Plana fältbilder är mättade | Antibody arbetslösning är att koncentrera | Använd en lägre koncentration av antikroppsbetslösning |
| Förvärvsinställningarna är inte optimerade (exponeringstid till hög, ND-filter till låg, ...) | Optimera förvärvsinställningar,Signalen måste ligga i sensorens dynamiska område | |
| Plana fältbilder är mörka | Antibody-arbetslösningen är utspädd | Använd en högre koncentration av antikroppsbetslösning |
| Förvärvsinställningarna är inte optimerade (exponeringstid till hög, ND-filter till låg, ...) | Optimera uppköpsinställningar, signal måste ligga i sensorens dynamiska område | |
| Över / Undersegmentation artefakter | Tröskeln är inte korrekt inställd | Justera tröskelvärdet |
| Storleksfilter har inte justerats korrekt | Justera min- och maxstorlekskriterierna för bildanalys | |
| Cellkonfluens är för hög | Den korrekta konfluensnivån är mycket viktig för tillförlitlig bildanalys. För andra celltyper än NHDF måste den optimala sådddensiteten bestämmas empiriskt | |
| Den glänsande applikationen fungerar inte | Fel katalog vald | Välj rätt katalog på ingångssidan. |
| Saknade filer i katalog | Se till att alla nödvändiga filer (utmatning från makro- och installationsfilen imagej) finns i den valda katalogen | |
| Saknade paket | Normalt kontrollerar appen och installerar alla nödvändiga paket, men när det misslyckas, kontrollera manuellt för följande paket: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, glänsande, glänsande filer, pbapply Och shinyjs inklusive alla beroenden. |
Tabell 1: Typiska fallgropar och potentiella lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta dokument beskrivs en mikroskopi med hög innehåll för samtidig kvantifiering av intracellulära ROS-nivåer och mitokondriell morfofunktion i NHDF. Dess prestanda demonstrerades med en fallstudie på SQV-behandlad NHDF. Resultaten stöder tidigare bevis från litteraturen där ökad ROS-nivå eller mitokondriell dysfunktion har observerats efter behandling med HIV-proteashämmare av typ 1, om än i separata experiment 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Den viktiga skillnaden är att den beskrivna analysen kan mäta dessa parametrar samtidigt, i samma levande celler, tillsammans med morfologiska data. Den stora fördelen med detta tillvägagångssätt är dess entydiga bestämning av båda faktorerna i rymden och tIme, vilket gör det möjligt att fastställa orsakssamband. En huvudkomponentanalys utförs som möjliggör generering av en känslig redoxprofil av specifika störningar. Men mer avancerade data miningstekniker och (övervakade) klusteralgoritmer kan också användas på den extraherade data för att möjliggöra predictive redox profilering. Detta kan vara en värdefull funktion för diagnostiska eller prognostiska klassificeringsverktyg i digital patologi, liksom vid screening för terapeutiska mål, t.ex. när en gång har skapats starka klassificeringsmodeller kan små molekylbibliotek screenas för att hitta terapeutiska kandidater för att motverka oxidativ stress, analog med En ny skärm för lovande led i terapiutveckling för mänskliga mitokondriella störningar 26 .
Analysen var tänkt för NHDF, men kan anpassas till andra vidhäftande celltyper. Detta kräver optimalisering av färgningsprotokollet och reporterfärgkoncentrationerna. Mängden r Eporter färgämne måste minimeras eftersom överbelastning kan orsaka olinjära effekter på grund av släckning eller till och med bli cytotoxisk 27 . Förlängning av analysen till suspensionsceller är mindre uppenbar på grund av svårigheter med montering och observation av sådana celler på ett fysiologiskt sätt. De kan vara cytospun på en täckglas eller odlas i serumfritt media för att inducera vidhäftning, men båda dessa processer störa fysiologiska förhållanden 28 , 29 . Dessa begränsningar kan emellertid övervinnas med användning av mikropatenta cellodlingsbärare som håller enskilda celler (vidhäftande eller icke-vidhäftande) infångade i små mikrobrunnar med bibehållande av deras livskraft 30 eller genom användning av en termo-reversibel hydrogel till fällceller under bildbehandling 31 . Dessa metoder har redan använts för höghaltig screening av plasmamembranpotential, eller cellulärt syre i individuella suspensionsceller= "Xref"> 32 , 33 eller avbildningen av intracellulära markörer i de levande, högmotiva parasiterna 31 . Anpassningar skulle också behöva göras för bildbehandling, eftersom den morfologiska analysen av mitokondriella nätverket i dessa celler skulle kräva snabba 3D-förvärvskapacitet såsom spin-disk-confokal- eller Bessel-strål-ljusmikroskopi 34 , 35 , såväl som analysen Pipeline, för att inkludera Z-dimensionen när man beräknar morfologiska parametrar.
Analysen optimerades för plattor med 96 brunnar, men det är självklart möjligt att ytterligare uppskalning, t ex till 384 brunnsplattor. Huvudbegränsningsfaktorn är plåtansamlingstiden, det vill säga den tid det tar att skaffa bilder av alla brunnarna. De fluorescerande signalerna måste förbli stabila under denna tidsram så att de med säkerhet kan jämföra mätningar mellanEnskilda brunnar. Men eftersom färgningen är övergående och processen som undersöks är dynamisk, utgör detta en utmaning. Därför mättes de fluorescerande signalerna i en uppsättning replikerade experiment och detta visade att både CM-H2 DCFDA- och TMRM-signalerna förblir stabila från 7 till minst 50 min efter färgning (variationskoefficient <2%). Detta ger ett fönster på ca 40 min. En 96-brunnsplatta tar typiskt omkring 10 minuter. Sålunda skulle en extrapolering till plattor med 384 brunn hålla anskaffningsvaraktigheten inom den stabila tidsluckan. Med ett genomsnitt på 50 celler per bild (baserat på användningen av en 20X-objektiv och NHDF-celler) skulle detta resultera i data för cirka 30 000 celler per timme av screening, vilket väsentligt bidrar till analysens statistiska effekt. En annan faktor som påverkar fluorescerande signalstabilitet är temperaturen. För att undvika vakuolisering av CM-H 2 DCFDA (dvs färgämnesackumulering i intracellulära vesiklar), vilket skulle ge upphov till heteroGenös färgning och icke-linjära effekter, sker inkubationen vid rumstemperatur istället för 37 ° C. Förutom stabilitet är det viktigt att notera att exponeringen av levande celler till fluorescens exciteringsljus i sig inducerar ROS-produktion. Detta innebär att exponeringsförhållandena (exponeringstid och excitationsljusintensitet) bör hållas till ett absolut minimum. Det betyder också att alla brunnar endast ska exponeras när de faktiska bilderna förvärvas. Det här reglerar användningen av programvaruaktiverade autofokuseringsmetoder och garanterar användningen av ett maskinvarubaserat autofokussystem.
En fördel med den beskrivna metoden är dess generiska karaktär. Praktiskt taget vilken som helst kombination av spektral kompatibla fluorescerande reportrar kan användas. Detta visades genom att använda Calcein / MitoSOX-kombinationen för att mäta mitokondriell ROS per levande cell 1 , 15 . Dessutom är ansökningarna inte begränsade till int Egrated ROS / mitokondriell mätning. Analysen kan också förlängas med en post-hoc immunostaining (efter den andra avbildningsrundan). Eftersom de exakta bildställningsplatserna sparas kan redoxanalyser direkt korreleras med platsproteomik i samma celler. Detta ökar kraftigt molekyläravläsningen, vilket står i stark kontrast till andra metoder som ofta används för att bedöma redoxbiologi eller fluorescensintensiteter i allmänhet. Till exempel används fluorimetri (mikroplattläsare) på grund av sin relativt låga kostnad (grundläggande inställning tillgänglig för så lågt som 4000 euro) och grundlärande inlärningskurva, men är en svart låda, men är mer benägen att konfrontera faktorer som variationer i Celltäthet eller bakgrunds (auto-) fluorescens, t.ex. förorenande dammpartiklar. Dessutom tillåter inte plattläsare extraktionen av morfologiska parametrar, de kan inte mäta enskilda celler, och de är mindre känsliga och pålitliga för att mäta dynamiska eller transienta signalerLass = "xref"> 36 , 37 . Flödescytometrin har kapacitet att mäta enskilda celler och har fördelen av hastighet. Faktum är att en 384-brunnsplatta kan screenas på så lite som 12 minuter med hög känslighet för flera markörer 38 . Detta är mycket snabbare än vad som är möjligt med widefieldmikroskopi. Men det finns fortfarande inga spatiotemporala uppgifter ( dvs. subcellulär lokalisering, morfologiska data och / eller tidsberoende kinetik), och det tillåter inte heller att återkomma samma celler under eller efter en behandling (dvs. i fluxo) . Vidare måste celler vara i suspension, vilket gör flödescytometri mindre lämpat för att studera fysiologin hos vidhäftande celler. Stora nackdelar med mikroskopi med hög innehåll jämfört med de andra metoderna är behovet av stor bilddatalagring, intensiv bearbetningskraft och komplexa bildanalyser. Den presenterade analysen standardiserar bildförvärvsprocessen och effektiviserar analysenS för att minimera denna behandlingstid, öka användarvänligheten och göra analysen mer tillgänglig.
Sammanfattningsvis, och specifikt för användningen av CM-H 2 DCFDA och TMRM är den beskrivna redoxprofileringsmetoden robust, känslig och pålitlig. På grund av dess multiparametriska och kvantitativa natur är den överlägsen andra fluorescensbaserade metoder. På så sätt kan det bidra till att belysa sambandet mellan mitokondriell funktion och intracellulär ROS-signalering, vilket är avgörande för att bättre förstå ett brett spektrum av patologier där redox homeostas är störd. På grund av dess generiska karaktär tillåter analysen dessutom applikationer långt bortom sitt ursprungliga omfång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna anger att det inte finns några konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter. Den motsvarande författaren ser också till att alla författare har blivit ombedda att avslöja alla intressekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
