Summary
Hier beschreiben wir eine minimal-invasive laparoskopische Technik zur Serien Probenahme von Leber und mesenterischen Lymphknoten (MLN) bei Makaken, die für eine erhöhte Abtastfrequenz ermöglicht, und reduziert das Potential für chirurgische Komplikationen im Vergleich zu einer Laparotomie durchgeführt wird.
Abstract
Die mesenterischen Lymphknoten (MLN) und die Leber sind Mikroben und mikrobielle Produkte aus dem Magen-Darm-Trakt (GI) ausgesetzt, so dass sie immunologisch einzigartig. Die GI-Trakt und die damit verbundenen MLN sind Websites der frühen viralen Replikation in humanen Immundefizienz-Virus (HIV) Infektion und die MLN sind wahrscheinlich wichtige Reservoir-Sites, die latent infizierten Zellen auch nach längerer antiretrovirale Therapie (ART) beherbergen. Die Leber wurde eine bedeutende Rolle bei Immunantworten auf Lentiviren spielen gezeigt und scheint eine wichtige Rolle bei der Clearance des Virus aus dem Verkehr zu spielen. Nicht-menschlicher Primat (NHP) Modelle für HIV und Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) imitiert eng diese Aspekte der HIV-Infektion und serieller Längs Probenahme von primären Standorten der viralen Replikation und die damit verbundenen Immunantworten in diesem Modell kritische Ereignisse in Infektion aufzuklären helfen, Pathogenese und die Auswirkungen verschiedener Interventionsstrategien auf diese Ereignisse. current veröffentlichten Techniken Leber zu probieren und MLN zusammen beinhaltet eine große Operation und / oder die Obduktion, die die Fähigkeit begrenzt diese wichtigen Standorte auf serielle Weise in demselben Tiere zu untersuchen. Wir haben zuvor beschrieben eine laparoskopische Technik zur Sammlung von MLN. Hier beschreiben wir eine minimal-invasive laparoskopische Technik zur seriellen Längs Probenahme von Leber und MLN durch die beiden gleichen Anschlusspositionen für die Sammlung von MLN erforderlich. Die Verwendung der gleichen zwei Ports minimiert die Auswirkungen auf die Tiere, da keine zusätzlichen Einschnitte erforderlich sind. Diese Technik kann mit einem erhöhten Abtastfrequenz im Vergleich zu größeren Bauchoperationen und reduziert das Potential für chirurgische Komplikationen und die damit verbundene lokale und systemische Entzündungsreaktionen verwendet werden, die Interpretation der Ergebnisse erschweren könnte. Dieses Verfahren hat das Potenzial Studien zu erleichtern NHP-Modelle beteiligt, während den Tierschutz zu verbessern.
Introduction
Der Magen - Darm - Trakt (GI) ist der größte Schleimhautoberfläche des Körpers und ist mit einer Vielzahl von Antigenen aus der Nahrung, Pathogene und endosymbiotische Bakteriengemeinschaften allgemein bezeichnet als microbiome 1, 2 abgeleitet ausgesetzt. Mesenterischen Lymphknoten (MLN) säumen den GI-Trakt und sind ein Hauptstandort der Immunfunktion zur Behandlung von entzündlichen oder tolerogen Antworten auf diese verschiedenen Antigenen zu fördern. Die physische Organisation des MLN schafft ein compartmentalized System , die systemischen Reaktionen auf Antigene vor Ort reagieren zu können 3 ohne Hervorrufen. In ähnlicher Weise Blut aus den GI - Trakt Abflüsse in die Leber über die Pfortader vor dem Kreislauf zurückkehrt und damit zu Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt ist , die aus dem GI - Trakt in die Lamina propria und trat in den Blutkreislauf 4 transloziert haben. Die Leberfunktionen auch als sekundärer Lymphorgane and hat eine große Anzahl von Immunzellen, einschließlich spezialisierten Makrophagen, zu transloziert Mikroben 5 zu entfernen, 6. Somit sind die MLN und die Leber das primäre Immunorgane commensal und pathogene Bakterien aus dem Darm-Trakt ausgesetzt GI, sowie das Milieu von Antigenen aus anderen Quellen, so dass sie einzigartige und wichtige Aus immunologischer Sicht machen.
Die MLN sind kritische Stellen für die Bewertung der virologischen und immunologischen Auswirkungen des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder pathogenen Simian Immunodeficiency Virus (SIV) Infektion und sind in der frühen Verbreitung von SIV folgende intrarektale Herausforderung wahrscheinlich beteiligt. Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe ist bekannt , ein wichtiger Standort von persistenten HIV - Replikation sein, trotz wirksame Kontrolle der Virämie durch moderne antiretrovirale Therapien (ART) 7. In SIV-Infektion Modellen wurden MLN gezeigt wichtige Reservoire von latentem Virus zu sein und kannsein , das primäre Reservoir 8, 9. Die Leber ist auch wichtig , in lentivirale Infektion , wie durch die Anhäufung von SIV spezifischen CD8 + T - Zellen in der Leber von Makaken während eines akuten Infektion SIV 10 belegt. Ferner ist es das Hauptorgan für die verantwortliche 11 das Virus aus dem Verkehr zu löschen.
HIV und SIV - Infektion mit veränderter GI microbiota verbunden ist , gestört Integrität GI epitheliale und eine erhöhte Translokation von Mikroben und mikrobielle Produkten aus dem Darm in den Umfang und den Kreislauf 12, 13. Diese Verfahren sind im Zusammenhang mit lokalen und systemischen Immunaktivierung und einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei HIV - infizierten Personen 14. In SIV - Infektion haben transloziert Bakterien in MLN der 15, während die Anhäufung von mic beobachtetRobial Produkte in der Leber wurde in der Entzündung und Schädigung des Organs 16 führen , gezeigt. So wird im Kontext von HIV und SIV-Infektionen können die MLN und Leber sehr informativ für die entzündlichen Prozesse von GI-resident Bakterien angetrieben zu verstehen.
Hier präsentieren wir eine minimal-invasive laparoskopische Technik für die serielle Abtastung des MLN und Leber in nichtmenschlichen Primaten (NHP). Wir zeigen erfolgreiche Anwendung dieser Technik auf zwei gesunden weiblichen Rhesusaffen (rms), jedes Tier zweimal Abtasten, mit 160 Tage zwischen jeder Operation. Wir gehen auf diese Proben zu verwenden, um Schlüssel Leukozyten und Lymphozyten-Populationen zu bewerten und zu vergleichen, in jedem Organ Durchflusszytometrie mit und zeigen sehr konsistente Daten zwischen den beiden Zeitpunkten.
Protocol
Die Tiere wurden untergebracht und versorgt in Verbindung für die Evaluierung und Akkreditierung von Labortierpflege international (AAALACi) akkreditierten Einrichtungen und alle Tier Verfahren wurden nach Protokollen, die von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Universität von Washington genehmigt durchgeführt und Washington National Primate Research Center.
1. Chirurgische Vorbereitung, Anästhesie und Analgesie
- Sedation und Induktion
- Sedate die Makaken mit einer intramuskulären Injektion von 10 mg / kg Ketamin und 0,015 mg / kg Dexmedetomidin (in einer Spritze kombiniert). Stellen Sie sicher, ohne Entzug Reflexe vor der Entnahme aus dem Käfig.
- (- 2,5% 1,0) und 100% Sauerstoff unter Verwendung des Tieres in einer Ebene allgemeiner Anästhesie Isofluran intubieren das Tier, und aufrechtzuerhalten. Siehe Referenzen für weitere Informationen zur Intubation und Allgemeinanästhesie bei Makaken 17,ref "> 18, 19.
- Anesthesia Unterstützung und Überwachung
- Legen Sie eine periphere Venenkatheter und bieten intravenöse isotonische Flüssigkeiten (wie zum Beispiel Ringer-Laktat-Lösung) bei einer Rate von 5 ml / kg / h im gesamten Anästhesie und Chirurgie. Bewerben Augenspülflüssigkeit Schmiermittel zu Hornhauttrockenheit zu verhindern.
- Analgesie bereitzustellen, wie zum Beispiel eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung von Buprenorphin (0,2 mg / kg, subkutan).
HINWEIS: Ein NSAID (wie Meloxicam oder Ketoprofen) kann auch während der Aufwachphase, vorausgesetzt, dass das experimentelle Protokoll ermöglicht NSAID Verabreichung und das Tier wird normotensiven und gut hydratisiert während der Anästhesie zur Verfügung gestellt werden. - Überwachung der Narkosetiefe (zB Kiefers tone), Herzfrequenz, Atemfrequenz, EKG, Blutdruck, Puls Oxygenierung, endtidalen CO 2 und die Körpertemperatur während der Anästhesie und Chirurgie.
HINWEIS: Wenn der Bauch insufflated wird, kann das Tier hypoventilieren.Eine mechanische Beatmung , wenn die Atemfrequenz verringert, oder die endtidalen CO 2 -Gehalt liegt über 45 mmHg. - Nach der Operation verabreicht Atipamezol (0,15 mg / kg, intramuskulär) für Dexmedetomidin Umkehr.
- chirurgische Vorbereitung
- Führen Sie mehrere Warmwassereinläufe das Volumen des Kotes im Darm zu reduzieren Visualisierung und Darm-Manipulation während des Verfahrens zu unterstützen 20.
- Verwenden Knipser mit einer Reihe 40 Klinge Haare aus dem Operationsfeld zu entfernen. Rasur von der Costal Grat zum Schambein und von links nach rechts flankieren.
- Aseptisch bereitet das Operationsfeld entsprechendes Antiseptika verwendet, wie beispielsweise alternierenden Chlorhexidin-Alkohol oder Povidon-Iod-Alkohol scheuert.
- Positionieren Sie das Tier auf dem Operationstisch auf dem Rücken in einem Winkel auf halber Strecke zwischen dorsalen und rechten Seitenlage. Binden die Arme und Beine mit einem Seil in einer ausgefahrenen Position. Wir bieten Ihnen eine chlorhexiessen und Alkohol prep, sobald das Tier in den Operationssaal bewegt und für die Chirurgie positioniert.
2. Chirurgie
Hinweis: Weitere Informationen der Laparoskopie bei Kleintieren, siehe 21 verweisen.
- Laparoskopischen Instrumentenaufbereitung
- Drapieren das Tier mit einem sterilen Abdecktuch gefenstert.
- Mit Hilfe eines nicht-sterilen Assistenten, wickeln Sie die Digitalkamera mit der sterilen Kamera drapieren und schließen Sie das Kabel an den Turm. Bringen Sie den starren Rahmen an dem Kamerakopf.
- Bringen Sie das sterile Lichtleitkabel mit dem starren Rahmen und das Kabel an der Lichtquelle. Weißabgleich der Kamera gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Bringen Sie die sterile Insufflator Schlauch an den Insufflator.
- Die laparoskopische Eintrag
- Unter Verwendung einer # 15 Skalpell, machen ein ~ 5 mm Stichinzision durch die Haut bis zu der Tiefe der Bauchmuskulatur, approximately 1 - 2 cm nach links des Nabels.
- Unter Verwendung der nicht-dominanten Hand, heben die Bauchdecke cranial zu der Stelle des Stichinzision auf. Mit der dominanten Hand legt die Spitze der Veress-Nadel durch den Einschnitt und den Winkel der Spitze kranial.
HINWEIS: Die Penetrationswinkel der Veress-Nadel wird auf dem Körper des Tieres variiert. Zum Beispiel in einem Fett Tiere, muss die Veress-Nadel nahezu senkrecht zu der Bauchdecke eingeführt werden kann. In einem dünnen Tier sollte die Veress-Nadel kranial Risiko verringern des Kontaktierens der Eingeweide angewinkelt sein.- die Welle (nicht die Nabe) der Veress-Nadel zu halten, drücken Sie fest die Nadel die Bauchdecke in die Bauchhöhle eindringen. Eine deutliche „Klick“ und Abnahme des Widerstands wird gefühlt werden, wie die scharfe Spitze das Peritoneum und die stumpfe Spitze der Nadel nach vorne Federn Veress dringt in die Bauchhöhle.
HINWEIS: Wenn die Nadel geht in geeigneter Weise in the Bauchhöhle, wird es wenig Widerstand, wenn es erweitert und zurückgezogen ist 1 - 2 cm.
- die Welle (nicht die Nabe) der Veress-Nadel zu halten, drücken Sie fest die Nadel die Bauchdecke in die Bauchhöhle eindringen. Eine deutliche „Klick“ und Abnahme des Widerstands wird gefühlt werden, wie die scharfe Spitze das Peritoneum und die stumpfe Spitze der Nadel nach vorne Federn Veress dringt in die Bauchhöhle.
- Schließen Sie den CO 2 Insufflator Schlauch an der Nadel und dem Sperrhahn öffnen. Unter Druck setzen den Bauch nicht mehr als 10-12 mmHg ein Pneumoperitoneum zu erstellen.
HINWEIS: Der Bauch ist ideal Insufflation erreicht, wenn sie symmetrisch erweitert und es gibt einen Verlust der normalen scharfen Kontur der Costal Margen. Der Druck sollte ausreichend Platz bieten für das Einführen der Kanüle / Trokar ohne Risiko der Eingeweide Kontakt gebracht wird.
- Cannula Placement
- Sobald das Abdomen vollständig insuffliert ist, stellt einen ~ 5 bis 7 mm Einschnitt mit einer # 15 Skalpellklinge durch die Haut der linken kranialen Abdomen in der Bauchmuskulatur ~ 2 bis 4 cm kaudal die letzten Rippe.
- Legen Sie eine 5 mm Trokar-Kanülen-Baugruppe durch den Hautschnitt und den Winkel es ~ 45 - 60 Grad caudomedially. Dringen die Bauchhöhle zu einer Tiefe von 1-2 cm. Screw die Gewinde Kanüle in die Bauchhöhle durch die Kanüle dreht (~ 0,5-1 cm weiter) bis zu einer Tiefe von 1,5 bis 3 cm, und den Trokar entfernt werden.
- Entfernen Sie den Insufflator Schlauch von der Veress-Nadel, drehen den Hahn ab, und die Nadel entfernen. Schließen Sie den Insufflator Schlauch an der Kanüle und öffnet den Hahn ein Pneumoperitoneum bei nicht mehr als 10 zu halten - 12 mmHg.
- Setzen Sie den starren Rahmen durch die Kanüle und in die Bauchhöhle.
- Unter Kamera Visualisierungen, weiterhin mit einer # 15 Skalpellklinge durch die Bauchmuskulatur und Peritoneum beim vorherige Hautinzision verwendete für Veress-Nadel Einführen einen kleinen Einschnitt machen. Die Kamera wird verwendet, um die Bauchseite des Einschnitts zu visualisieren Gefäße zu vermeiden und Blutungen zu minimieren.
HINWEIS: Sicherstellen, dass der Schnitt durch den Muskel und Peritoneum ist groß genug, um Eintritt der Sonde und Exteriorisation des Mesenteriums zu erleichtern (~ 0,5 cm). Ein größerer Einschnitt kann erforderlich sein, um mesent exteriorisierenery bei Tieren mit einem übermäßigen mesenterialen Fett. - Legen Sie das Tier in die Trendelenburg - Position 21 mit den Füßen erhöht auf etwa 15 bis 30 Grad über dem Kopf. Dies ist optional, kann jedoch einen leichteren Zugang zu mesenterischen Lymphknoten des Darms, wie der kleine Darm-Trakt ermöglicht zu einer Schädel Position zu bewegen.
- Mesenteriallymphknoten Biopsy
- Kamera unter Visualisierungen, legt eine feste Sonde durch die abdominale Inzision in Schritt 2.3.5 hergestellt.
- Platzieren Sie die Sonde zwischen dem Omentum und Darm und eine Streichbewegung verwenden, um sanft das Omentum aus dem Darm zu fegen Visualisierung des zugrunde liegenden Mesenterium zu ermöglichen. Fortsetzung der Kehrbewegung von der kaudal Schädel Bauch zu verwenden. Die omentum kann in dem rechten Hirn Bauch gelegt werden, um sie aus dem Operationsfeld ist.
- Verwenden Sie die Sonde die Colon descendens nach links oder rechts Bauchwand zu bewegen. Dies ermöglicht eine bessere Visualisierung von t erlaubener Gekröse bei der Suche nach mesenterischen Lymphknoten zu unterstützen.
- Verwenden Sie die Sonde durch das Gekröse fegen die mesenterischen Lymphknoten entlang der Kolon und Mesenterialgefäße zu lokalisieren.
HINWEIS: Kolon-Knoten entlang der mesenterischen Grenze des Dickdarms führte, links Kolik-Knoten können in den Nähe der Verzweigungspunkte der Gefäße und die mesenterica inferior Knoten entlang der unteren Mesenterialgefäße gefunden werden können gefunden werden. Mesenterischen Lymphknoten sind gut sichtbar in mageren Tieren. Wenn in mesenterialen Fett begraben werden sie verleihen oft eine leicht angehoben, um die darüber liegende Gekröse glitzernde Erscheinung und können mehr eine graubraune Farbe dann mesenterialen Fett umgeben sein. Zudem neigen mesenterischen Lymphknoten entlang Lymphgefäße und mesenterialen Gefäße liegen. - Sobald ein Lymphknoten identifiziert wird, entfernen Sie die Sonde, und führen die Maryland ratcheted Zange in die Bauchhöhle. Verwenden der Zange das Mesenterium benachbart zu dem Zielknoten zu erreichen. Ziehen Sie die Gekröse in Richtung incision und den Umfang von der Kanüle entfernen.
- Schalten Sie den Insufflator aus und die Kanüle Hahn geöffnet lassen, den Bauch drucklos Exteriorisation des Mesenteriums zu erleichtern. Ziehen Sie den Mesenterium außerhalb des Körpers durch den Einschnitt. Sobald exteriorisiert, fasst das Mesenterium mit gebogenem Moskito Hämostatika oder Pinzette Zugang durch den Schnitt zu gewährleisten.
- Identifizieren der Lymphknoten (s) innerhalb des exteriorisierten Mesenterium durch den festere Lymphknoten Palpation und / oder direkte Visualisierung der grayer Farbe oder knotigen Aussehens des Lymphknotens.
- Einmal identifiziert, stellt eine kleine Öffnung (~ 3 bis 5 mm) in dem Mesenterium in der Nähe des Knotens gekrümmten Hämostatika verwenden. Freie Anlagen Mesenterium Verwendung stumpfe Dissektion mit dem gekrümmten Hämostatika. Ligieren die Vaskulatur mit 4-0 nicht absorbierbare Monofilament-Nahtmaterial nach Bedarf. Verwenden scharfe Dissektion mit einem Skalpell der Lymphknoten zu entfernen. Legen Sie die Knoten in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium aufEis.
- Untersuchen Sie die exteriorisierten Gekröse für Blutungen. Wenn die Blutung festgestellt wird, eine angemessene Hämostase durch die Gefäße mit Hämostatika oder Ligatur Okkludieren (4-0 nicht absorbierbare Monofilament-Nahtmaterial) oder durch Verwendung von Kauterisation. Lassen Sie das Mesenterium und insufflieren den Bauch 10 zurück - 12 mmHg das Mesenterium, damit die Bauchhöhle zurück.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1 bis 2.4.8 zusätzliche Lymphknotenbiopsien zu erhalten.
- Leber Biopsie
- Bringen Sie den Tisch in eine horizontale Position.
- Legen Sie eine Gewinde Kanüle in die Bauchhöhle durch den Einschnitt zuvor für Lymphknotenbiopsie Sammlung verwendet (Inzision in Schritt 2.3.5). Sicherstellen, dass der Einschnitt groß genug ist (~ 5 bis 7 mm) für die Kanüle zu ermöglichen, ohne die Platzierung Trokareinführung. Setzen Sie den starren Rahmen durch diese Kanüle in Richtung der kranialen Bauchhöhle und visualisieren die kranialen Abdomen und Leber.
- Unter Kamera Visualisierung, legen Sie die Biopsie forceps zuvor durch die Kanüle in dem linken Hirn Abdomens (Inzision in Schritt 2.3.1 hergestellt) gegeben.
- Zu erhalten Leberbiopsien, legt die Biopsiezangen unter dem ausgewählten Leberlappen Rand mit dem beweglichen Teil des Kiefers gegenüber der Leber, öffnet die Zange, und ermöglicht es dem Spielraum in die offenen Klemmbacken fallen. Stellen Sie sicher, dass kein Omentum zwischen der Leber und der Biopsiezange ist. Stellen Sie die Position der Zange und schließen Sie das Gerät über den gewünschten Probenbereich.
- Behalten Sie den Druck für etwa 20 - 30 s Hämostase zu gewährleisten. Mit der Zange geschlossen, entfernen Sie die Probe durch vorsichtige die Zange nach oben durch die Kanüle gezogen wird. Dies wird leicht die Biopsie aus der Leber reißen. Legen Leberbiopsien in RPMI 1640-Medium, auf dem Eis.
Hinweis: Die Größe der Leberbiopsie ist etwa 5 mm x 2 mm x 2 mm unter Verwendung von 5 mm Biopsiezange.
- Behalten Sie den Druck für etwa 20 - 30 s Hämostase zu gewährleisten. Mit der Zange geschlossen, entfernen Sie die Probe durch vorsichtige die Zange nach oben durch die Kanüle gezogen wird. Dies wird leicht die Biopsie aus der Leber reißen. Legen Leberbiopsien in RPMI 1640-Medium, auf dem Eis.
- Untersuchen Sie die Biopsiestelle für Blutungen mit Kamera-Visualisierung. Wenn Blutung beobachtet wird, legen Sie eine Kochsalzlösung moistened sterilen Wattestäbchen durch die Kanüle und Druck auf die Biopsiestelle gelten. Alternativ packt die Biopsiestellen mit sterilem Gelfoam Hämostase zu unterstützen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5.3 bis 2.5.5 zusätzliche Leberbiopsien zu erhalten.
HINWEIS: Hier 3 Biopsien pro Tier und Verfahren gesammelt wurden, die für alle Downstream-Analysen ausreicht.
- chirurgische Schließung
- Untersuchen Sie die Bauchhöhle für Blutungen.
HINWEIS: Das ist bisher nicht aufgetreten. Wenn jedoch exzessive Blutung festgestellt wird, bestimmt die Stelle der Blutung und eine angemessene Hämostase über Druck mit sterilen Wattetupfer oder der Verwendung von Gel-Schaum. - Schalten Sie den Insufflator aus und öffnen Sie die Kanüle Hähnen. Bewerben sanften manuellen Druck auf den Bauch zu voll die Bauchhöhle drucklos. Entfernen Sie die Kanülen.
- Schließen Sie jede der Bauchwand Einschnitte mit 1 bis 2 einfach unterbrochenen Nähten pro Standort. 4-0 resorbierbaren Naht wird empfohlen.
- Durchführen eines Spritzblock, indem 0,1-0,3 cc Bupivacain in jeder Einschnitt für lokale Analgesie vor der Hautverschluss.
- Schließen Sie die Haut mit 1 bis 2 vergrabene unterbrochen Nähte (4-0 resorbierbaren Naht wird empfohlen) pro Standort. Gewebekleber aufgebracht werden.
- Untersuchen Sie die Bauchhöhle für Blutungen.
3. Leberbiopsie Verarbeitung und Analyse Lymphocyte
- Speichern von mehreren Stücken von Lebergewebe (ca. 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm groß), in die Kryokonservierung Röhren in einer bevorzugten RNA-Speicherlösung und 10% igem Formalin für zukünftige Molekular- und histologische Analysen.
- Die restlichen Leberbiopsien in 50 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 1 × Penicillin / Streptomycin, 40 ug / ml eines kommerziell erhältlichen Kollagenase-Lösung, und 4 ug / ml DNAse in einem sterilen 250-ml-Kunststoffbecher mit einem Deckel. Rühre kräftig einen magnetischen Rührstab und unter Verwendung einer Rührplatte für 1 h bei 37 ° C.
- gleichmäßig verteilen, indem das verdaute Gewebe zu gießen. GRind die verdaute Gewebe (aus Schritt 3.1.1) über zwei 70 & mgr; m Filter passen in zwei 50 ml konischen Röhrchen in eine Einzelzellsuspension das Ende einer sterilen 5 ml-Spritze. Bringen Sie das Volumen der beiden Rohre zu 50 ml in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalen Rinderserum und 1 × Penicillin / Streptomycin (R10).
- Zentrifugieren der Zellen bei 840 x g für 6 Minuten bei 4 ° C. Man dekantiert die überstehende Flüssigkeit. Konzentrieren der Zellen in ein einzelnes 50 ml konischen Röhrchen von Zellen, die aus dem beiden Rohren in 5 mL R10 und Kombinieren in ein 50 ml konischen Röhrchen suspendieren. Bringen Volumen auf 50 ml unter Verwendung von R10. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers Zellausbeute zu bestimmen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 840 x g für 6 Minuten bei 4 ° C. Resuspendieren der Zellen in 1 ml R10, gleichmäßig verteilt in zwei 5 ml-Rundboden-Polystyrolröhrchen und bringt in jedem Rohr das Volumen jedes Rohres auf 4 ml mit R10, Targeting für> 500.000 Zellen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 840 x g für 6 Minuten bei 4 ° C. Umfüllen supernatant und das Zellpellet in 4 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) resuspendieren. Zentrifuge bei 840 × g für 6 Minuten bei 4 ° C.
- Man dekantiert den Überstand und resuspendiere die Zellen in 100 ul PBS durch vorsichtiges Vortexen. In 1,5 ul eines fixierbaren toten Zelle Fleck. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min.
- Fügen Sie die folgenden unverdünnte Oberflächenfärbung Antikörper in Titern vom Hersteller empfohlenen: CD45-PerCP (Klon D058-1283), CD3-PE-CF594 (Klon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (Klon 2H7), CD4-BV605 ( Klon OKT4), CD8-BV570 (Klon RPA-T8) und CD14-BV785 (Klon M5E2). für 20 min bei 4 ° C inkubieren.
- 4 ml PBS und Zentrifugation bei 840 x g für 6 Minuten bei 4 ° C. Man dekantiert den Überstand und resuspendiere die Zellen in 250 & mgr; l 1% Paraformaldehyd in PBS.
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. - Analyse der Zellpopulationen unter Verwendung einer Strömungs Zytometer , wie in Referenz 22 beschrieben.
Representative Results
Detaillierte Beschreibung der Methoden zur Verarbeitung von laparoskopisch MLN gesammelt sowie Zellausbeuten und Leukozyten - Frequenzen in diesen Organen wurden zuvor 13 gemeldet. 1 zeigt zelluläre Ausbeute und Lebensfähigkeit Daten die MLN und Leberbiopsien gesammelt zu zwei Zeitpunkten 160 Tage abgesehen von zwei gesunden weiblichen RMs Verwendung dieser laparoskopischen Technik vergleicht. Wir fanden , dass zelluläre Ausbeute der MLN war signifikant höher als in der Leber (P = 0,0021), mit einem Durchschnitt von 33,5 x 10 6 und 6,74 x 10 6 Zellen erhalten werden. Tote Zellfärbung und Analyse mittels Durchflusszytometrie zeigte, dass> 90% der von beiden Organen isolierten Zellen lebensfähig waren.
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wir ausgewertet und verglichen die Häufigkeit von Leukozyten und Lymphozyten in der MLN und Leber. Ein repräsentatives Gating-Schema für die Leber gezeigt in
Abbildung 1. Zelluläre Gesamt - Ausbeute (oben) und die Zelllebensfähigkeit (unten) von Serienmäßig Collected MLN und Leberbiopsien. Die MLN zeigten signifikant höhere Zellausbeuten als die Leber haben. Jedoch vorausgesetzt beide Probenarten genügend Zellen für die Downstream-Analysen. Die Lebensfähigkeit der Zellen, gemessen durch Strömungs cytometrically fixierbarer tote Zelle Amin stain Verwendung zeigte, dass beide Probenarten typischerweise ergab> 90% Lebensfähigkeit der Zellen nach Gewebedissoziation. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung zwischen den Proben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Durchflusszytometrie Gating - Strategie. Zunächst wurden aggregierte Zellen ausgeschlossen, gefolgt von einer Selektion von nur lebenden Zellen nach Färbung eines fixierbaren toten Zelle Amin Fleck mit. Als nächstes wurden CD45 + Leukozyten ausgewählt, durch die Auswahl der CD3 + T - Zellen gefolgt. Von der CD3 + Bevölkerung wurden CD4 + und CD8 + T - Zellen analysiert. Von der CD3 - Bevölkerung, CD14 + und CD20 + Zellen wurden analysiert. Thi s Gating-Strategie wurde auch für die MLN verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Durchflusszytometrie Plots von MLN und Leber von Zwei Tiere Longitudinal. MLN und Leberproben wurden auseinander 160 Tage gesammelt für beiden Tiere. (A). MLN CD45 + Zellen (Leukozyten); (B) Liver CD45 + Zellen (Leukozyten); (C) MLN + CD3 + -Zellen (T - Zellen); (D) Liver CD3 + -Zellen (T - Zellen). Bei beiden Tieren zeigte die MLN höhere Anteile von CD45 + und CD3 + -Zellen im Vergleich zu der Leber. Über Zeit waren die Frequenzen dieser Populationen ähnlich für beide Tiere.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg“target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Häufigkeiten von CD45 + Zellen (links) und verschiedene Leukozyten- und Lymphozyten - Subpopulationen (rechts) über 23 individuelle Samplings. Die MLNs angezeigt signifikant größere Frequenzen von CD45 +, CD3 + und CD4 + Zellen, während die Leber signifikant größere Frequenzen von CD14 + Leukozyten zeigte, die einzigartigen Funktionen jeden Organ zu demonstrieren. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung zwischen den Proben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Hier zeigen wir eine minimal-invasive Technik für die serielle Sammlung von MLN und Leberbiopsien, die eine 100% Erfolgsquote in diesen und anderen Tieren hatten in dieser Studie nicht beschrieben. Darüber hinaus hat die Verwendung dieser Technik auf den gleichen Tieren über die Zeit nicht mit unerwünschten Ereignissen in Verbindung gebracht worden. Tatsächlich gibt es keine Komplikationen durch Einsatz dieser Technik in anderen Kohorten von Tieren ergeben gewesen, die mit SIV, simian / Human Immunodeficiency Virus (SHIV) oder Zika-Virus (nicht veröffentlichte Daten) infiziert waren. In ähnlicher Weise hat diese Operation als erfolgreich erwiesen, auch bei Tieren, die zuvor große Bauchoperation unterzogen hatten, und in thrombozytopenische Tieren (nicht veröffentlichte Daten). Wir haben gezeigt, dass diese Proben können durch Umkehrung der Kameraposition durch die gleichen zwei Ports gesammelt werden, wenn von MLN Leberschalt die Notwendigkeit für zusätzliche Einschnitte zu vermeiden. Faktoren , die die Sammlung von MLN beeinflussen wurden bisher 13 gemeldet.
Das gesamte Verfahren dauert in der Regel 30 - 45 min zur Vervollständigung und wird durch zwei ~ 0,5 cm Einschnitte erreicht. Bei fettleibigen Tieren kann es notwendig sein, einen größeren Einschnitt zu machen (~ 1 bis 1,5 cm) MLN durch abrufen und zusätzliche Zeit erfordert können. Tiere mit umfangreichem mesenterialen Fett erfordern oft erhebliche Erfahrung auf differentiate MLN aus dem umgebenden Fett. MLN werden oft entlang der mesenterialen Gefäße und zu sein scheinen häufiger in der Nähe von Verzweigungspunkten in den Gefäßen gefunden. Ein kritischer Aspekt dieses Verfahrens ist, dass es die ausgewählte MLN erfordert eine ausreichende Mobilität im Mesenterium zu haben exteriorisiert Inzision durch die Bauch wird. Als Ergebnis kann diese Technik nicht zu sammeln MLN der Nähe der Wurzel des Mesenteriums verwendet werden. Aufgrund Vergrößerung ist es manchmal einfacher, MLN mit der Kamera zu identifizieren, und mit der Lokalisierung und Identifizierung des Knotens kann auf die MLN in enger Nähe zu erfassen helfen, sobald es exteriorisiert wird.
Die Nutzung der Trendelenburg-Position nicht immer für MLN Sammlung erforderlich sein, und wenn MLN leicht ohne die Verwendung von Trendelenburg-Position abgerufen werden können Leberbiopsien leichter machen, wie es die Organe verschieben kranial zu verhindern. Manchmal nach der Platzierung in Trendelenburg-Position wird die Leber nach oben verschoben gegen die Membran und Most werden vorsichtig wieder in Position vor der Biopsie Sammlung manipuliert. Da die Torplatzierung für die Sammlung MLN nach links, so werden Leberbiopsien typischerweise von den linken lateralen und medialen linken Leberlappen genommen, da sie näher an die Kanüle sind.
Gesammelte MLN und Leberbiopsien für eine Vielzahl von Downstream-Analysen reichlich Zellausbeuten zur Verfügung gestellt und zeigten eine hohe Lebensfähigkeit der gesammelten Zellen. Hier wurden die Zellen für die durchflusszytometrische Analyse von Leukozyten und Lymphozyten-Populationen gefärbt, und die wichtigsten Unterschiede zwischen diesen beiden wichtigen Immunorgane wurden aufgeklärt. Zum Beispiel wurden die MLN hoch angereicherte für CD4 + T - Zellen im Vergleich zur Leber, um die Bedeutung der MLN als Mittelpunkte für die Erfassung aufgrund und adaptive Immunantworten zu verbreiten, sowie die Bedeutung von CD4 + T für die Verwaltung von inflammatorischen und tolerogen Reaktionen auf das Milieu von Nahrungsaufnahme und GI-residente Mikroorganismen abgeleitete Antigenes = "xref"> 24. Jedoch wurde die Leber deutlich angereichert für CD14 + Leukozyten im Vergleich zu dem MLN. CD14 exprimiert überwiegend auf Monozyten und Makrophagen , und ist eine Schlüsselkomponente des Rezeptorkomplexes für bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) 25. Tatsächlich erhöhten Plasmakonzentrationen von löslichem CD14 sind mit mikrobiellem Translokation und Aktivierung des Immunsystems bei HIV und pathogenen SIV - Infektionen 26 verbunden. Somit höhere Frequenzen von CD14 + Leukozyten in der Leber wahrscheinlich aus einer größeren Bakterienbelastung in diesem Organe führen , wenn an den MLN verglichen.
Hier zeigen wir eine schnelle und minimal-invasive Operationstechnik zur Serien Sammlung von MLN und Leberbiopsien nur zwei kleine Schnitte für die laparoskopische Eintrag verwenden, die nicht auf irgendwelche negativen Ergebnissen geführt hat. Diese Proben stellen einen nützlichen Weg Schlüssel immunologische, virologische und mikrobiologische Prozesse zu bewerten, die pla nehmence in MLN und Leber, die aus systemischer Immunität getrennten und eindeutig sind. Ebenso sind kritische Leberbiopsien für die langfristige Bewertung der Auswirkungen von HIV / SIV, Drogentherapien und transloziert Mikroben, die oft erhebliche Leberschäden 16 induzieren kombinieren. Da ferner die MLN und Leber Immunorgane GI Mikrobiota ausgesetzt sind, die Fähigkeit, die Immunität in diesen Organen über die Zeit spielt die Rolle eine hervorragende Plattform bietet bewerten für das Verständnis, dass die microbiome Wirt Immunhomöostase aufrechtzuerhalten. Zusammengenommen Bewertung der Leber und MLN ist von großer Bedeutung im Zusammenhang mit der Vakzine und therapeutischer Wirksamkeiten, SIV viralen Clearance Reservoir und allgemeiner Schleimhaut-Immunität. Die Fähigkeit, diese Proben durch einen minimal-invasiven Ansatz zu sammeln bedeutet, dass es weniger Risiko einer Entzündung Zusammenhang mit dem Verfahren als mit dem derzeit veröffentlichten Techniken besteht und weniger Auswirkungen auf die Physiologie der Tiere. Im future, werden wir das Potenzial, zu kombinieren, um die Sammlung von MLN und Leber mit der Sammlung von Milz durch die gleichen zwei Hafenstandorte bewerten für die Probenahme von anderen wichtigen und deutlichen Teil des Immunsystems zu ermöglichen, die eine wichtige Rolle zu spielen hat sich gezeigt, in eine Reihe von Krankheitsmodellen.
Disclosures
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH Grant-Nummer P51OD010425 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
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