Summary
Her beskriver vi en minimal invasiv teknikk for laparoskopisk serie prøver av leveren og mesenteriske lymfeknuter (MLN) hos aper som gjør det mulig for øket samplingsfrekvens, og reduserer muligheten for kirurgiske komplikasjoner i forhold til å utføre en laparotomi.
Abstract
De mesenteriske lymfeknuter (MLN), og leveren blir utsatt for mikrober og mikrobielle produkter fra den gastrointestinale (GI), noe som gjør dem enestående immunologisk. Mage-tarmkanalen og tilhørende MLN er områder av tidlig viral replikasjon i humant immunsviktvirus (HIV) infeksjon, og den MLN er sannsynlige viktigste reservoar områder som havn latent-infiserte celler, selv etter langvarig antiretroviral behandling (ART). Leveren har vist seg å spille en betydelig rolle i immunresponser mot lentivirus, og ser ut til å spille en betydelig rolle ved fjerning av virus fra sirkulasjon. Human primat (NHP) modeller for HIV og ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) tett etterligne disse aspektene av HIV-infeksjon og serielangsgående sampling av primære områder for viral replikasjon og de tilhørende immunresponser i denne modellen vil bidra til å klargjøre kritiske hendelser i infeksjon, patogenese og effekten av ulike intervensjonsstrategier på disse hendelsene. current publiserte teknikker for å prøve leveren og MLN sammen involvere større kirurgiske inngrep og / eller obduksjon, noe som begrenser muligheten til å undersøke disse viktige områder i en seriell måte i det samme dyr. Vi har tidligere beskrevet en laparoskopisk teknikk for innsamling av MLN. Her beskriver vi en minimal invasiv teknikk for laparoskopisk serielangsgående sampling av leveren og MLN gjennom de samme port to steder som er nødvendige for oppsamling av MLN. Bruken av de samme to porter minimaliserer virkningen til dyrene ingen ytterligere snittene blir nødvendig. Denne teknikken kan brukes med øket samplingsfrekvens i forhold til større abdominal kirurgi og reduserer muligheten for kirurgiske komplikasjoner og tilhørende lokale og systemiske inflammatoriske responser som kan komplisere tolkningen av resultatene. Denne fremgangsmåten har potensial for å lette studier som involverer NHP modeller samtidig forbedre dyrevelferd.
Introduction
Den gastrointestinale (GI) er kroppens største slimhinneoverflate og er utsatt for en myriade av antigener som stammer fra mat, patogener, og endosymbiotic bakterielle samfunn ofte referert til som mikrobiomer 1, 2. Mesenteriske lymfeknuter (MLN) linje mage-tarmkanalen, og er en hoved område av immunfunksjon for å fremme inflammatoriske eller tolerogene responser mot disse forskjellige antigener. Den fysiske organiseringen av MLN skaper en compartmentalized system som kan svare på antigener lokalt uten å utløse systemiske responser 3. Tilsvarende blod fra mage-tarmkanalen drenerer til leveren ved hjelp av portvenen før retur til sirkulasjon, og er således utsatt for mikrober og mikrobielle produkter som har translokerte fra mage-tarmkanalen inn i lamina propria og kommet inn i blodbanen 4. Leveren fungerer også som et sekundært lymfeorganer ennd har et stort antall av celler i immunsystemet inkludert spesialiserte makrofager, for å fjerne translokerte mikrober 5, 6. Dermed blir MLN og leveren er de primære immun organer som er utsatt for kommensal og patogene bakterier fra mage-tarmkanalen, samt miljøet av antigener fra andre kilder, noe som gjør dem enestående og viktig fra et immunologisk perspektiv.
Den MLN er kritiske områder for evaluering av virologiske og immunologiske virkninger av humant immunsviktvirus (HIV) eller patogent simian immunsviktvirus (SIV) infeksjon, og er sannsynligvis involvert i tidlige formidling av SIV følgende intrarektal utfordring. Tarmassosiert lymfoid vev er kjent for å være et hovedsete for vedvarende HIV-replikasjon, til tross for effektiv kontroll av viremi ved moderne antiretroviral terapi (ART) 7. I SIV smittemodeller, har MLN vist seg å være viktige reservoarer av latent virus og kanvære hovedreservoaret 8, 9. Leveren er også viktig i lentiviral infeksjon som vist ved akkumulering av SIV spesifikke CD8 + T-celler i leveren hos aper under akutt infeksjon SIV 10. Videre er det viktig organ som har ansvar for å fjerne viruset fra sirkulasjon 11.
HIV og SIV-infeksjon er assosiert med endret GI bakterieflora, forstyrret GI epitelial integritet og øket translokasjon av mikrober og mikrobielle produkter fra tykktarmen inn i periferien og sirkulasjonen 12, 13. Disse prosessene er forbundet med lokal og systemisk immunaktivering, og økt sykelighet og dødelighet hos HIV-infiserte individer 14. I SIV-infeksjon, har translokerte bakterier blitt observert i MLN 15, mens akkumuleringen av mikrofonenrobial produkter i leveren er vist å resultere i inflammasjon og skade på organ 16. Således, i forbindelse med HIV og SIV-infeksjoner, kan de MLN og leveren være meget informative for å forstå de inflammatoriske prosesser som drives av GI-resident bakterier.
Her presenterer vi en minimal invasiv teknikk for laparoskopisk serie prøver av det MLN og leveren hos ikke-humane primater (NHPs). Vi viser vellykket gjennomføring av denne teknikken på to friske kvinnelige rhesusape (RMS), prøvetaking hvert dyr to ganger, med 160 dager i mellom hver operasjon. Vi går inn for å bruke disse prøvene for å evaluere og sammenligne viktige leukocytter og lymfocyttpopulasjonene innenfor hvert organ ved hjelp av flowcytometri, og viser svært konsistente data mellom de to tidspunktene.
Protocol
Dyrene ble holdt og tatt vare på i Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALACi) akkrediterte tjenester og alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra University of Washington og Washington National Primate Research Center.
1. Kirurgisk Fremstilling, anestesi og analgesi
- Sedasjon og induksjon
- Sedate den macaque med en intramuskulær injeksjon av 10 mg / kg ketamin og 0,015 mg / kg deksmedetomidin (til en sprøyte). Sikre fravær av abstinens reflekser forut for fjerning fra buret.
- Intubere dyret, og opprettholde dyret i et plan generell anestesi ved bruk av isofluran (1,0 til 2,5%) og 100% oksygen. Se referanser for ytterligere informasjon om intubasjon og generell anestesi hos aper 17,ref "> 18, 19.
- Anestesi Support og overvåking
- Sette inn en perifer venekateter og gi intravenøs isotoniske væsker (for eksempel laktat Ringers-oppløsning) ved en hastighet på 5 ml / kg / time i løpet anestesi og kirurgi. På steril øye smøremiddel for å hindre at hornhinnen tørrhet.
- Analgetikum, slik som en formulering med forlenget frigivelse av buprenorfin (0,2 mg / kg, subkutant).
MERK: En NSAID (for eksempel meloksikam eller ketoprofen) kan også være anordnet under bedøvelse utvinning, forutsatt at den eksperimentelle protokoll tillater NSAIDs og at dyret er normotensive og godt hydrert under anestesi. - Monitor bedøvelse dybde (f.eks kjeve tone), hjertefrekvens, respirasjonsgrad, EKG, blodtrykk, puls oksygenering, endetidale CO2, og kroppstemperaturen i hele anestesi og kirurgi.
MERK: Når magen er insuffleres, kan dyret hypoventilate.Gir mekanisk ventilasjon hvis respirasjon reduseres, eller ved slutten av utåndingen CO2-nivået er over 45 mmHg. - Etter kirurgi, administrere atipamezol (0,15 mg / kg, intramuskulært) for deksmedetomidin reversering.
- kirurgisk Forberedelse
- Utfører flere varme vann klyster for å redusere volumet av avføring i tykktarmen for å lette visualiseringen og intestinal manipulasjon under prosedyren 20.
- Bruk clippers med nummer 40 kniv for å fjerne hår fra operasjonsområdet. Shave fra kyst ryggen til pubis og fra venstre til høyre flanke.
- Aseptisk fremstille operasjonsfeltet ved hjelp av egnede antiseptiske midler, slik som vekselvis klorheksidin-alkohol eller povidon-jod-alkohol skrubb.
- Plasser dyret på operasjonsbordet på sin fotens rygg, med en vinkel midtveis mellom rygg- og høyre side recumbency. Bind armer og ben med tau i en utstrakt posisjon. Gi en endelig chlorhexispise og alkohol prep gang dyret beveger seg til operasjonsstuen og er posisjonert for operasjon.
2. kirurgi
Merk: For mer informasjon om laparoskopi i små dyr, se referanse 21.
- Laparoskopisk instrument Preparat
- Drapere dyret med en steril fenestrert drapering.
- Med hjelp av en ikke-steril assistent, vikle digitalkamera med den sterile kamera drapere og koble kabelen til tårnet. Feste den stive rammen til kamerahodet.
- Fest sterile lys kabelen til den stive ramme og koble kabelen til lyskilden. Hvitbalanse kameraet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fest sterile insufflator slangen til insufflator.
- laparoskopisk Entry
- Ved hjelp av en # 15 skalpell, lage en ~ 5 mm dolke snitt gjennom huden til dybden av magemuskulaturen, approximately 1 - 2 cm til venstre for navlen.
- Ved hjelp av den ikke-dominerende hånd, løft opp bukveggen cranial til området av den trykksnitt. Med den dominerende hånd, plasserer spissen av nålen Veress gjennom innsnittet og vinkelen spissen kranialt.
MERK: penetrasjon vinkelen på Veress nålen vil variere basert på kroppens tilstand til dyret. For eksempel, i en fett dyr, vil den Veress nålen må skyves nesten vinkelrett på bukveggen. I en tynn dyr, bør Veress nålen vinkles kranialt for å redusere risikoen for å kontakte den indre organer.- Holder akselen (ikke navet) av Veress nålen, skyv nålen til å trenge gjennom bukveggen inn i bukhulen. En distinkt "klikk" og minskning i motstanden vil bli følt som den skarpe spissen trenger gjennom bukhinnen og den butte tuppen av nålen Veress fjærene fremover inn i bukhulen.
MERK: Hvis nålen går riktig i the bukhulen, vil det være liten motstand når den føres frem og trekkes tilbake 1 - 2 cm.
- Holder akselen (ikke navet) av Veress nålen, skyv nålen til å trenge gjennom bukveggen inn i bukhulen. En distinkt "klikk" og minskning i motstanden vil bli følt som den skarpe spissen trenger gjennom bukhinnen og den butte tuppen av nålen Veress fjærene fremover inn i bukhulen.
- Koble CO 2 insufflator rør til nålen og åpner sperreventilen. Trykk magen til ikke mer enn 10-12 mmHg for å lage en pneumoperitoneum.
MERK: abdomen har oppnådd ideell innblåsning når det har ekspandert symmetrisk, og det er et tap av den normale skarpe konturen av det kyst marginer. Trykket bør gi tilstrekkelig plass for innføring av kanylen / trokaren uten risiko for å kontakte den indre organer.
- kanyle Place
- Når buken er fullt insuffleres, lage en ~ 5-7 mm snitt med en # 15 skalpellblad gjennom huden på den venstre hjerne magen til abdominalmuskulaturen ~ 2 - 4 cm kaudalt for den siste ribbe.
- Plasser en 5 mm trokar-kanylesammenstillingen gjennom huden innsnitt og vinkle den ~ 45 - 60 grader caudomedially. Trenge inn i bukhulen til en dybde på 1-2 cm. skruew gjenge kanylen inn i magen ved å rotere kanylen (~ 0,5 - 1 cm videre) til en dybde på 1,5 - 3 cm, og fjerne trokaren.
- Fjern insufflator slangen fra Veress nål, slå av stengeventilen, og fjerne nålen. Koble insufflator slangen til kanylen og åpner stengeventilen for å opprettholde en pneumoperitoneum på ikke mer enn 10 - 12 mmHg.
- Sett den stive rammen gjennom kanylen og inn i bukhulen.
- Under kamera visualisering, fortsette å lage et lite snitt med en # 15 skalpell blad gjennom magemuskulatur og peritoneum ved forrige huden snitt brukes for Veress nålen innsetting. Kameraet blir brukt til å visualisere buksiden av snittet for å unngå fartøy og minimalisere blødning.
MERK: Kontroller snittet gjennom muskelen og peritoneum er stor nok til å lette innføring av sonden og exteriorization av mesenteriet (~ 0,5 cm). En større innsnitt kan være nødvendig for å exteriorize mesenteri i dyr med overdreven mesentrialfett. - Plasserer dyret i Trendelenburg posisjon 21 med føttene forhøyede på omtrent 15 - 30 grader over hodet. Dette er valgfritt, men kan gi lettere tilgang til mesenteriske lymfeknuter i tykktarmen, som små tarmkanalen vil bevege seg til en mer cranial stilling.
- Mesenteric lymfekjertelbiopsi
- Under kameraet visualisering, sette inn en fast sonde gjennom abdominal innsnitt gjort i trinn 2.3.5.
- Plassere proben mellom omentet og tarm og bruke en feiende bevegelse for å feie forsiktig omentum av tarmen for å tillate visualisering av den underliggende mesenteriet. Fortsetter å bruke den feiende bevegelse fra hale til cranial magen. Omentum kan plasseres i den høyre hjerne buken slik at det er ute av det operative området.
- Bruk sonden til å bevege den synkende kolon mot venstre eller høyre abdominale vegg. Dette vil gi bedre visualisering av than mesentery til hjelp i jakten på mesenteriale lymfeknuter.
- Bruk proben til å sveipe gjennom mesenteriet å lokalisere de mesenteriske lymfeknuter langs kolon og tarmens fartøy.
MERK: Tykktarms noder går langs mesenteriumgrensen av tykktarmen, kan venstre kolikk noder bli funnet i nærheten av avdelings interessante skipene, og de mindreverdige mesenteric noder kan bli funnet langs underlegne mesenteric fartøy. Mesenteriske lymfeknuter er lett synlige hos slanke dyr. Når begravd i mesenteric fett vil de ofte gi en litt hevet, glinsende utseende til den overliggende mesenteriet og kan være mer en mer gråaktig brunfarge da rundt mesenteric fett. I tillegg, mesenteriske lymfeknuter har en tendens til å ligge langs lymfekar og mesenteriske vaskulatur. - Når en lymfeknute er identifisert, fjerne proben og sett Maryland sperret tang inn i bukhulen. Bruk tang for å gripe mesenteriet tilstøtende målet noden. Trekk mesentery mot INCIsjon, og fjerne rammen fra kanylen.
- Slå insufflatoren og la kanylen kranen åpen til trykkavlaste magen å lette exteriorization av mesenteriet. Trekk mesenteriet utsiden av legemet gjennom innsnittet. Når exteriorized, ta tak i mesenteriet med buede mygg hemostatene eller minne tang for å sikre tilgang gjennom innsnittet.
- Identifiser lymfeknute (e) i den utlagte mesenterium ved palpering av den fastere lymfeknute og / eller direkte visualisering av grayer farge eller nodulær utseende av lymfeknute.
- Når de er identifisert, få en liten åpning (~ orden 3 - 5 mm) i mesenteriet nær noden ved hjelp av buede hemostats. Frie vedlegg til mesenteriet ved hjelp stump disseksjon med den krumme hemostats. Ligere vaskulaturen med 4-0 ikke-absorberbare monofilament-sutur som er nødvendig. Bruk skarp disseksjon med en skalpell for å fjerne lymfeknute. Plasser nodene i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium påis.
- Undersøk exteriorized mesentery for blødning. Hvis blødningen skal bemerkes gi hensiktsmessig hemostase ved okkludering av fartøyene med hemostatene eller ligaturer (4-0 ikke-absorberbare monofilament sutur), eller ved bruk av kauteringsinstrument. Slipp mesenteriet og insufflate magen tilbake til 10 - 12 mmHg for å tillate mesenteriet å gå tilbake til bukhulen.
- Gjenta trinn 2.4.1 gjennom 2.4.8 å oppnå ytterligere Lymfeknutebiopsier.
- leverbiopsi
- Returner bordet til en horisontal posisjon.
- Plasser en gjenget kanyle inn i bukhulen gjennom innsnittet tidligere ble brukt for lymfekjertelbiopsi samling (innsnitt gjort i trinn 2.3.5). Sikre snittet er stor nok (~ 5-7 mm) for å tillate kanylen emisjon uten trocar innsetting. Sett den stive rammen gjennom denne kanylen mot kranie bukhulen og visualisere den kraniale magen og leveren.
- Under kameraet visualisering, sett biopsi forceps gjennom kanylen tidligere plassert i den venstre hjerne buk (innsnitt gjort i trinn 2.3.1).
- For å oppnå leverbiopsier, plassere en biopsitang under den valgte leverlapp margin med den bevegelige del av kjeven som vender mot leveren, åpner tang, og la margin for å falle inn i de åpne kjevene. Sikre at ingen omentum er mellom leveren og biopsitang. Justere plasseringen av tang og lukke apparatet over det ønskede prøveområdet.
- Opprettholde trykk i omtrent 20 - 30 s for å sørge for hemostase. Med pinsett lukket, fjerne prøven ved å dra tang opp gjennom kanylen. Dette vil forsiktig rive biopsi fra leveren. Plasser leverbiopsier i RPMI 1640 medium på is.
MERK: leverbiopsi størrelse er omtrent 5 mm x 2 mm x 2 mm ved hjelp av 5 mm biopsitang.
- Opprettholde trykk i omtrent 20 - 30 s for å sørge for hemostase. Med pinsett lukket, fjerne prøven ved å dra tang opp gjennom kanylen. Dette vil forsiktig rive biopsi fra leveren. Plasser leverbiopsier i RPMI 1640 medium på is.
- Undersøke biopsi nettstedet for blødning ved bruk av kamera visualisering. Hvis blødning er observert, plassere en salt moistened steril bomullspinne gjennom kanylen og gi trykk på biopsi området. Alternativt pakke biopsi områder med steril gel-skum for å hjelpe til hemostase.
- Gjenta trinn 2.5.3 gjennom 2.5.5 å oppnå ytterligere leverbiopsier.
MERK: Her ble 3 biopsier per dyr per prosedyre oppsamlet, noe som er tilstrekkelig for alle nedstrøms analyser.
- kirurgisk Closure
- Undersøke bukhulen for blødning.
MERK: Dette har ikke skjedd hittil. Imidlertid, hvis overdreven blødning er kjent, bestemme stedet for blødning, og gi nødvendig hemostase via trykk med sterilt bomullspinner, eller bruk av gel-skum. - Slå insufflatoren og åpne kanyle stoppekraner. Påfør forsiktig manuell press på magen for å fullt trykk fra bukhulen. Ta av kanyler.
- Lukke hver av bukveggen snittene med 1 til 2 enkle avbrutte suturer pr området. 4-0 absorberbare sutur anbefales.
- Utføre en splash blokk ved å plassere 0,1-0,3 cc bupivakain i hvert innsnitt for lokal analgesi før lukking av huden.
- Lukk huden med 1 - 2 begravet avbrutt sutur (4-0 absorberbare sutur anbefales) per område. Vevslim som kan anvendes.
- Undersøke bukhulen for blødning.
3. leverbiopsi Processing and Analysis Lymphocyte
- Lagre flere stykker av levervev (ca. 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm i størrelse) i nedfrysing rør, i en foretrukket RNA-lagringsløsning, og 10% formalin for senere histologisk analyse og molekyl.
- Plasser de gjenværende leverbiopsier i 50 ml RPMI 1640-medium supplert med 1 x penicillin / streptomycin 40 ug / ml av et kommersielt tilgjengelig kollagenaseoppløsning, og 4 ug / ml DNAse i en steril 250 ml plastbeger med lokk. Omrør kraftig ved bruk av en magnetisk rørestav og en røreplate i 1 time ved 37 ° C.
- Fordele ved å helle den fordøyde vevet. Grind fordøyde vevet (fra trinn 3.1.1) over to 70 um filtre passer inn i to 50 ml koniske rør til en enkelt cellesuspensjon ved hjelp av enden av en steril 5 ml sprøyte. Bring volumet til begge rør for å 50 ml i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1 x penicillin / streptomycin (R10).
- Sentrifuger cellene ved 840 x g i 6 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatanten. Konsentrer de celler i et enkelt 50 ml konisk rør ved å suspendere cellene fra begge rør i 5 ml R10 og å kombinere inn i en 50 ml konisk rør. Bringe volumet til 50 ml ved bruk av R10. Cellene telles ved bruk av et hemocytometer for å bestemme cellulær utbytte.
- Sentrifuger cellene ved 840 x g i 6 minutter ved 4 ° C. Resuspender cellene i 1 ml R10, fordele jevnt i to 5 ml rundbunnet polystyrenrør og bringe volumet av hvert rør til 4 ml med R10, rettet for> 500.000 celler i hvert rør.
- Sentrifuger cellene ved 840 x g i 6 minutter ved 4 ° C. Dekanter supernatant og cellepelleten suspenderes i 4 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS). Sentrifuger ved 840 x g i 6 minutter ved 4 ° C.
- Dekanter supernatanten og resuspender cellene i 100 ul PBS ved å virvle forsiktig. Tilsett 1,5 mL av en festbar dødt cellefarge. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Legg til følgende ufortynnet overflatefarging antistoffer i titere som er anbefalt av produsent: CD45-PerCP (klon D058-1283), CD3-PE-CF594 (klon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (klon 2H7), CD4-BV605 ( klon OKT4), CD8-BV570 (klon RPA-T8), og CD14-BV785 (klon M5E2). Inkuber ved 4 ° C i 20 min.
- Tilsett 4 ml PBS og sentrifuger ved 840 xg i 6 min ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og resuspender cellene i 250 pl av 1% paraformaldehyd i PBS.
Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr. - Analyser cellepopulasjoner ved hjelp av et strømningscytometer som beskrevet i referanse 22.
Representative Results
Detaljerte fremgangsmåter for behandling av laparoskopisk oppsamlet MLN, samt cellulære utbytter, og leukocytt-frekvenser i disse organene er tidligere blitt rapportert 13. Figur 1 viser cellulært utbytte og levedyktighet data som sammenligner den MLN og lever- biopsier tatt ved to tidspunkter 160 dager bortsett fra to friske kvinner RMer ved hjelp av denne laparoskopisk teknikk. Vi har funnet at celle utbytte fra MLN var betydelig høyere enn fra leveren (P = 0,0021), med et gjennomsnitt på 33,5 x 10 6 og 6,74 x 10 6 celler oppnådd, henholdsvis. Død celle farging og analyse ved strømningscytometri viste at> 90% av cellene isolert fra begge organer var levedyktige.
Ved hjelp av flowcytometri, vi evaluert og sammenlignet overflod av leukocytter og lymfocytter i MLN og leveren. En representativ gating ordning for leveren er vist i
Figur 1. Totalt Cellular Utbytte (øverst) og celleviabilitet (nederst) fra serielt Collected MLN og leverbiopsier. Den MLN viste signifikant høyere celleutbytte enn gjorde leveren. Men begge prøvetyper ga rikelig celler for nedstrøms analyser. Cellelevedyktigheten, målt ved flow cytometrically ved hjelp av en festbar død celle amin flekk, viste at begge prøvetyper har vanligvis ga> 90% av cellenes levedyktighet etter vev dissosiasjon. Feilstolpene representerer standardavviket mellom prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representant flowcytometrisystemer gating Strategy. Først ble aggregerte celler utelatt, fulgt av seleksjon av bare levedyktige celler etter farging ved hjelp av en festbar død celle amin flekk. Deretter ble CD45 + leukocytter utvalgt, fulgt av seleksjon av CD3 + T-celler. Fra CD3 + populasjonen, ble CD4 + og CD8 + T-celler analysert. Fra CD3 - befolkningen, ble CD14 + og CD20 + celler analysert. Thi s gating strategien ble også brukt for MLN. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Strømningscytometri plott fra MLN og Liver av to dyr langs. MLN og leverprøver ble oppsamlet 160 dagers mellomrom i begge dyr. (A). MLN CD45 + celler (leukocytter); (B) Liver CD45 + celler (leukocytter); (C) MLN + CD3 + celler (T-celler); (D) Liver CD3 + celler (T-celler). For både dyr, viste MLN høyere andeler av CD45 + og CD3 + celler sammenlignet med leveren. Tvers av tid, Frekvensen av disse populasjonene var tilsvarende for begge dyrene.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Frekvenser på CD45 + celler (til venstre) og forskjellige leukocytt- og lymfocytt-subpopulasjoner (til høyre) på tvers av 23 individuelle Prøvetakinger. De MLNer viste signifikant høyere frekvenser på CD45 +, CD3 +, og CD4 + celler, mens leveren viste signifikant høyere frekvenser av CD14 + leukocytter, noe som viser den unike funksjoner av hvert organ. Feilstolpene representerer standardavviket mellom prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her viser vi en minimal invasiv teknikk for serie samling av MLN og leverbiopsier som hadde en 100% suksessrate i disse og andre dyr som ikke er beskrevet i denne studien. Videre bruk av denne teknikken på de samme dyrene over tid har ikke vært assosiert med bivirkninger. Faktisk har det ikke vært noen komplikasjoner som resulterer av bruk av denne teknikken i andre kullet dyr som var infisert med SIV, Simian / humant immunsviktvirus (Shiv), eller Zika virus (upubliserte data). På samme måte har denne operasjonen vist seg vellykket, selv hos dyr som tidligere hadde gjennomgått store abdominal kirurgi, og i trombocytopeni dyr (upubliserte data). Vi demonstrerte at disse prøvene kan samles gjennom de samme to porter ved å reversere kamera ved veksling fra MLN til leveren å unngå behovet for ytterligere snitt. Faktorer som påvirker innsamling av MLN har tidligere blitt rapportert 13.
Hele prosedyren tar vanligvis 30 - 45 minutter for å fullføre og oppnås ved hjelp av to ~ 0,5 cm innsnitt. Hos overvektige dyr, kan det være nødvendig å foreta en større snitt (~ 1 til 1,5 cm) for å hente MLN gjennom og kan kreve ekstra tid til å fullføre. Dyr med omfattende mesenteric fett krever ofte betydelig erfaring til differentiate MLN fra den omgivende fett. MLN er ofte funnet langs mesenteric blodkar og ser ut til å være mer utbredt nær grenpunkter i skipene. Et kritisk aspekt ved denne teknikken er at den krever valgt MLN for å ha tilstrekkelig bevegelighet i mesenteriet å bli ført ut gjennom abdominal innsnitt. Som et resultat, kan denne teknikken ikke brukes til å samle MLN nær roten av mesenteriet. På grunn av forstørrelse, er det noen ganger lettere å identifisere MLN med kameraet, og gripe i umiddelbar nærhet til MLN kan hjelpe til med å lokalisere og identifisere den node når den er lagt utvendig.
Bruk av Trendelenburg stilling kan ikke alltid være nødvendig for MLN samlingen, og hvis MLN kan lett hentes uten bruk av Trendelenburg stilling kan det gjøre leverbiopsier lettere da det vil hindre organene fra å forskyve kranialt. Til tider, etter anbringelse i Trendelenburg stilling, blir leveren forskyves opp mot membranen og must være forsiktig manipulert tilbake til sin posisjon før biopsi samling. Ettersom porten plasseringen for MLN samlingen er til venstre, blir leverbiopsier vanligvis tatt fra venstre laterale og mediale venstre leverlappene som de er nærmere kanylen.
MLN oppsamlet og leverbiopsier ga rikelig celleutbytter for en rekke nedstrøms analyser og viste høy levedyktighet av de oppsamlede celler. Her ble cellene farget for flowcytometrisk analyse av leukocytt og lymfocyttpopulasjoner, og forskjeller mellom disse to viktige immun organer ble belyst. For eksempel ble det MLN høyanriket for CD4 + T-celler i forhold til leveren, på grunn av viktigheten av MLN som tyngdepunktene for innsamling og spre adaptive immunresponser, så vel med hensyn til betydningen av CD4 + T for styring av inflammatoriske og tolerogene respons på miljøet antigener avledet fra inntak og GI-hjemmehørende mikroorganismers = "ekstern referanse"> 24. Imidlertid leveren ble betydelig anriket for CD14 + leukocytter sammenlignet med MLN. CD14 blir uttrykt i hovedsak på monocytter og makrofager og er en sentral del av reseptorkomplekset for bakterielt lipopolysakkarid (LPS) 25. Faktisk blir økte plasmakonsentrasjoner av oppløselig CD14 forbundet med mikrobiell translokasjon og aktivering av immunsystemet hos HIV og SIV patogene infeksjoner 26. Således er høyere hyppighet av CD14 + leukocytter i leveren sannsynligvis skyldes en høyere bakteriemengden i dette organ i forhold til MLN.
Her viser vi en rask og minimal invasiv kirurgisk teknikk for serie samling av MLN og leverbiopsier bruker bare to små snitt for laparoskopisk oppføring som ikke har ført til noen uheldige utfall. Disse samplene tilveiebringer en nyttig vei til å evaluere viktige immunologiske, virologiske og mikrobiologiske prosesser som tar place i MLN og leveren, som er atskilt og unike fra systemisk immunitet. Tilsvarende leverbiopsier er avgjørende for den langvarige evaluering av virkningene av HIV / SIV, medikamentterapier, og translokerte mikrober, som ofte kombineres for å indusere signifikant leverskade 16. Videre, fordi den MLN og lever er immune organer som er utsatt for GI bakterieflora, evnen til å vurdere immunitet i disse organene over tid gir en utmerket plattform for å forstå den rolle som mikrobiomer spiller i å opprettholde vertens immun homeostase. Tatt sammen, evaluering av leveren og MLN er av stor betydning i forbindelse med vaksine og terapeutiske effektiviteter, SIV viral reservoar klaring, og generell slimhinneimmunitet. Evnen til å samle disse prøvene gjennom en minimal invasiv metode betyr at det er mindre risiko for betennelse knyttet til prosedyren enn det som finnes for tiden publiserte teknikker og mindre innvirkning på dyrenes fysiologi. I furatur, vil vi vurdere potensialet for å kombinere innsamling av MLN og leveren med innsamling av milten gjennom de samme to port steder for å muliggjøre sampling av et annet viktig og distinkt del av immunsystemet som har vist seg å spille en betydelig rolle i en rekke sykdomsmodeller.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend nummer P51OD010425.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
- Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
- Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
- Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
- Shuai, Z., et al.
- Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
- Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
- North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
- Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
- Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
- Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
- Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
- Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
- Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
- Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , Elsevier. (2011).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , Academic Press. (2009).
- Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia. , Blackwell Publishing. (2007).
- Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , Elsevier. (2012).
- Fransson, B. A., Mayhew, P. D. Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , Wiley Blackwell. (2015).
- Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
- Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
- Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).
