Summary
Burada, yüksek örnekleme frekansı verir ve bir laparotomi performans ile karşılaştırıldığında, cerrahi komplikasyonlar potansiyelini azaltır makaklarda karaciğer ve mezenterik lenf düğümlerinden (MLN) seri örnekleme için minimal invaziv bir laparoskopik tekniği açıklar.
Abstract
mezenterik lenf düğümlerinden (MLN) ve karaciğer bunları immünolojik benzersiz yapım, mide-barsak (GI) sistemin mikroplar ve mikrobiyal ürünler maruz kalmaktadır. Gastrointestinal sistem ve ilişkili MLN, insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) enfeksiyonu ile erken viral replikasyonun siteleri ve MLN daha uzun süreli anti-retroviral tedavi (ART) sonra kuluçkada enfekte olmuş hücreleri barındıran muhtemelen önemli rezervuar yerleridir. Karaciğer Lentivirüslerden immün yanıtlarda önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ve dolaşımdan virüsün temizlenmesinde önemli bir rol oynuyor gibi görünmektedir edilmiştir. İnsan-olmayan primat, HIV ve Kazanılan Bağışıklık Eksikliği Sendromu (AİDS) için (NSP) modelleri yakından enfeksiyon kritik olaylar aydınlatmak için yardımcı olur, HIV enfeksiyonu ve viral replikasyon ve bu modelde olarak ilişkili immün cevapların primer siteye seri boyuna örnekleme bu özelliklerini taklit eden, patogenez ve bu olaylar üzerinde çeşitli müdahale stratejilerinin etkisi. Current yayınlanan teknikler karaciğer örnek ve MLN birlikte aynı hayvanda bir seri biçimde bu önemli yerlerin araştırılması için sınırlar büyük cerrahi ve / veya otopsi, içerir. Daha önce MLN toplanması için bir laparoskopik tekniği tarif var. Burada, MLN toplanması için gerekli olan aynı iki bağlantı noktası yerleri ile karaciğer ve MLN'sinin seri boyuna örnekleme için minimal invaziv bir laparoskopik tekniği açıklar. ilave kesikler gerekli olduğu gibi aynı iki bağlantı noktası kullanımı hayvanlara etkisini en aza indirir. Bu teknik, büyük karın cerrahisi ile karşılaştırıldığında artmış bir örnekleme frekansı ile kullanılan ve cerrahi komplikasyon riskini ve sonuçların yorumlanmasını karmaşık hale getirebilir lokal ve sistemik inflamatuar yanıt ilişkilendirilebilir. Bu prosedür hayvan refahı geliştirirken NHP modellerini kapsayan çalışmalar kolaylaştırmak için potansiyele sahiptir.
Introduction
Mide-bağırsak (GI), vücudun en büyük mukoza yüzeyi olan ve yaygın olarak mikrobiyomu 1, 2 olarak adlandırılan, gıda, patojenler ve endosimbiyotik bakteri topluluklarının türetilen bir antijen sayısız maruz kalmaktadır. Mezenterik lenf düğümlerinden (MLN) gastrointestinal sistem hat ve bu farklı antijenlere karşı enflamatuar veya tolerojenik yanıtları teşvik etmek için immün fonksiyonun bir asıl yer bulunmaktadır. MLN'sinin fiziksel organizasyon lokal sistemik tepkiler 3 meydana getirmeden antijenlere yanıt verebilir bölmelere ayrılmış bir sistem oluşturur. Benzer şekilde, dolaşım dönen ve böylece lamina propria içine GI yolundan konuma transfer ve kan dolaşımına 4 girmiş mikropların ve mikrobiyal ürünlere maruz önce portal ven yoluyla karaciğere GI yolu düşene kan. Karaciğer aynı zamanda ikinci bir lenfoid organ a olarak işlevnd Transloke Mikroplar 5, 6 kaldırmak için özel makrofajlar gibi immün hücrelerin çok sayıda vardır. Bu nedenle, MLN ve karaciğer Gl kommensal ve patojenik bakterilere maruz primer immün organlar, hem de başka kaynaklardan gelen antijenleri ortam, olan bir imünolojik açıdan onları benzersiz ve önemli adrestir.
MLN Human Immunodeficiency Virus (HIV) veya patojenik maymun bağışıklık yetmezliği virüsü (SIV) enfeksiyon virolojik ve immünolojik etkilerinin değerlendirilmesi için kritik siteler ve muhtemelen intrarektal tehdit sonrasında SIV erken yayılması ilgilidirler. Bağırsak ile ilişkili lenfoid doku Modern antiretroviral tedaviler (ART) 7 ile viremi etkin kontrolü rağmen, kalıcı HIV replikasyonunun önemli bir yer olarak bilinir. SIV enfeksiyonu modellerinde, MLN latent virüsün önemli rezervuarları olduğu gösterilmiştir ve mayıs edilmiştirana hazne 8, 9 olabilir. Akut SIV enfeksiyonu 10 boyunca makak karaciğerlerinde SIV spesifik CD8 + T hücrelerinin birikimi ile kanıtlandığı gibi karaciğer de lentiviral enfeksiyon önemlidir. Ayrıca, bu dolaşım 11 virüs temizleme için sorumlu başlıca organdır.
HIV ve SIV enfeksiyonu değiştirilmiş Gl mikrobiyota ile ilişkilidir, Gl epitel entegriteyi bozulur ve çevresi ve dolaşım 12, 13 içine kolon mikroplar ve mikrobiyal ürünler translokasyonunu artmıştır. Bu işlemler, lokal ve sistemik immün aktivasyonu ile bağlantılı ve HIV ile enfekte olmuş bireylerin 14 morbidite ve mortalite riski vardır. SIV enfeksiyonunda transloke bakteri mikrofon birikimi ise, MLN 15 gözlenmiştirkaraciğerde robial ürünleri organı 16 enflamasyon ve zarar görmesine neden olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, HIV ve SIV enfeksiyonlarına bağlamında, MLN ve karaciğer Gl yerleşik bakteri tarafından tahrik ettiği enflamatuar süreçleri anlamak için oldukça bilgi verici olabilir.
Burada, insan-olmayan primatlarda (NHPs) seri MLN'sinin örnekleme ve karaciğer için minimal invaziv bir laparoskopik teknik sunar. Her cerrahi arasında her hayvana 160 gün ile iki kez, örnekleme, iki sağlıklı dışı makaklar (RMler) bu tekniğin başarılı bir performans sergiledik. Bu iki zaman aralığında yüksek tutarlı veri değerlendirme ve akış sitometrisi kullanılarak, her bir organ içinde önemli lökosit ve lenfosit karşılaştırılabilmesi ve göstermek için bu örneklerin kullanımı gidin.
Protocol
Hayvanlar muhafaza ve Değerlendirme ve Akreditasyon Laboratuar Hayvan Bakımı uluslararası (AAALACi) akredite tesisleri için Birliği bakım ve tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Washington Üniversitesi Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış protokollere göre gerçekleştirildi edildi Washington Ulusal primat Araştırma Merkezi.
1. Cerrahi Hazırlık, Anestezi ve Analjezi
- Sedasyon ve indüksiyon
- 10 mg / kg ketamin ve (bir şırınga içinde bir araya) 0.015 mg / kg deksmedetomidin bir intramüsküler enjeksiyon ile oturaklı makak. kafes alınmadan önce çekme reflekslerin yokluğu sağlanması.
- hayvan entübe ve izofluran kullanılarak genel anestezi bir düzlemde hayvan bakımı (1,0-2,5%) ve% 100 oksijen. , Makak 17'de entübasyon ve genel anestezi ilgili daha fazla bilgi için referanslara bakınızref "> 18, 19.
- Anestezi Destek ve İzleme
- çevresel bir venöz kateter takma anestezi ve ameliyat boyunca 5 ml / kg / saat arasında bir oranda (örneğin, laktatlı Ringers çözeltisi gibi) damar içi izotonik sıvı sağlar. Kornea kuruluğunu önlemek için steril göz yağ sürün.
- Bu tür buprenorfin bir sürekli salım formülasyonunun (0.2 mg / kg, deri altına) olarak, analjezi sağlar.
Not: bir NSAID (örneğin meloksikam ya da ketoprofen gibi) de deneysel protokol NSAID uygulanmasına imkan verir koşuluyla, anestetik kurtarma sırasında sağlanabilir ve bu hayvan normal tansiyonlu ve yüksek anestezi sırasında iyi hidratlanır. - Anestezi ve ameliyat boyunca anestezi derinliği (örn çene ton), kalp atım hızı, solunum hızı, EKG, kan basıncı, nabız oksijenasyonu, end-tidal CO2 ve vücut sıcaklığını izlemek.
NOT: karın şişirilir zaman, hayvan hipoventilasyona olabilir.Solunum hızı azalır veya end-tidal CO2 seviyeleri 45 mmHg üzerinde ise mekanik havalandırma sağlayın. - Cerrahi müdahalenin ardından, deksmedetomidin tersine çevrilmesi için atipamezol (0,15 mg / kg, kas içine) uygulanması.
- Cerrahi Hazırlık
- Prosedür 20 boyunca görselleştirme ve bağırsak manipülasyon yardım etmek için kolon dışkı hacmini azaltmak için birden fazla sıcak su lavman gerçekleştirin.
- Bir numara 40 bıçak ile kullanın makası cerrahi alandan saç kaldırmak için. pubis kostal sırtından ve sağ kanadındaki soldan Tıraş.
- Aseptik klorheksidin-alkol ya da povidon-iyodin-alkol ovma alternatif olarak, uygun antiseptikler kullanılarak cerrahi alanı hazırlar.
- dorsal ve sağ yanal yatar arasındaki açı yarım de, onun sırtında ameliyat masasına hayvan yerleştirin. bir uzama konumunda ip kollar ve bacaklar bağla. Son bir chlorhexi sağlayınhayvan ameliyat odasına hareket eder ve cerrahi konumlandırılmış bir kez yemek ve alkol hazırlık.
2. Cerrahi
Not: Küçük hayvanlarda laparoskopinin daha fazla bilgi için 21 başvuru bkz.
- Laparoskopik Enstrüman Hazırlık
- Steril fenestre örtüsü ile birlikte, hayvan örtün.
- Steril olmayan bir asistan yardımıyla, steril kamera örtü ile dijital kamera sarın ve kuleye kabloyu takın. Kamera kafasına sert kapsamını takın.
- katı kapsamı steril ışık kabloyu ve ışık kaynağına bağlayın. Beyaz üreticinin talimatlarına göre kamerayı dengeleyin.
- İnsüflatörde steril insuflatör boru takın.
- Laparoskopik Girişi
- Bir 15. neşter kullanılarak, karın kaslarının uygulamanın derinliği deri yoluyla bir ~ 5 mm bıçak kesisi yapınroximately 1 - göbek sol 2 cm.
- dominant olmayan el kullanarak, bıçak yarasına mahalline karın duvarı kranial, yukarı kaldırın. baskın el ile, insizyon ve açı ucu kraniyal yoluyla Veress iğne ucu yerleştirin.
Not: Veress iğne giriş açısı hayvanın vücut durumuna göre değişir. Örneğin, bir yağ hayvanda, Veress iğnesi yaklaşık karın duvarına dik yerleştirilmiş olması gerekir. ince bir hayvanda, Veress iğnesi iç organ temas riskini azaltmak için kraniyal açılı olmalıdır.- Veress iğne mili (değil merkezi) tutarak, sıkı bir şekilde karın boşluğuna karın duvarı nüfuz iğne itin. Ayrık bir "klik" ve sivri uç periton ileri karın boşluğuna Veress iğnesi yayların küt ucu nüfuz olarak direncinde azalma hissedilecektir.
Not: İğne th içine uygun bir şekilde geçerse2 cm 1 - ileri ve geri olduğunda e karın boşluğu, çok az direnç olacaktır.
- Veress iğne mili (değil merkezi) tutarak, sıkı bir şekilde karın boşluğuna karın duvarı nüfuz iğne itin. Ayrık bir "klik" ve sivri uç periton ileri karın boşluğuna Veress iğnesi yayların küt ucu nüfuz olarak direncinde azalma hissedilecektir.
- Iğne CO2 insuflatör boru bağlayın ve vana açık. pneumoperitoneumun oluşturmak için hiçbir fazla 10-12 mmHg karın basýnçlandýrýn.
NOT: simetrik genişledi zaman karın İdeal insuflasyonu elde etti ve kostal marjlar normal keskin kontur kaybı yoktur. Basınç iç organ temas riski olmadan kanül / trokar sokulması için yeterli bir alan sağlamak gerekir.
- Kanül Yerleştirme
- son kaburga 4 cm kaudal - karın kaslarının ~ 2 sol beyin karın deri yoluyla 15. bisturi bıçağı ile 7 mm insizyon - karın tam üflendi sonra, bir ~ 5 olun.
- caudomedially 60 derece - cilt insizyonu ve açı o ~ 45 ile 5 mm trokar-kanal tertibatı yerleştirin. 1-2 cm derinliğe kadar karın boşluğuna nüfuz. Scre1.5 derinliğe - kanülü (1 cm daha ~ 0.5) - döndürerek karın içine dişli kanül w 3 cm, ve trokar çıkarın.
- , Veress iğneden insüflatördür tüpünü çıkarın Stopcock kapatın ve iğneyi çıkartın. kanüle püskürteci boru bağlayın ve en fazla 10 bir pnömoperiton korumak için vana açık - 12 mmHg.
- kanül içinden ve karın boşluğuna katı kapsamı yerleştirin.
- Kamera görüntüleme altında, Veress iğnesi sokulması için kullanılan önceki cilt kesi ile karın kaslarının ve periton üzerinden bir 15. neşter bıçağı ile küçük bir kesi yapmaya devam. Kamera damarları önlemek ve kanamayı en aza indirmek için kesiğin karın tarafını görselleştirmek için kullanılır.
Not: kas içinden kesi sağlanması ve periton mezenter (~ 0.5 cm) sondanın girişi ve eksteriorizasyon kolaylaştırmak için yeterince büyüktür. Daha büyük bir kesi mesent exteriorize gerekebilirAşırı mezenterik yağ hayvanlarda ery. - Kafasının üzerinde 30 derece - yaklaşık 15 en yüksek ayak Trendelenburg konumunda 21 hayvan yerleştirin. Bu isteğe bağlıdır, fakat daha kranyal konuma hareket eder, küçük bağırsak sistemi gibi kolonun mezenterik lenf düğümleri daha kolay erişim, izin verebilir.
- Mezenterik Lenf Düğümü Biyopsi
- Kamera görüntüleme altında, aşama 2.3.5 yapılan abdominal kesikten katı sonda yerleştirin.
- omentum ve bağırsak arasındaki probu yerleştirilir ve hafifçe altında yatan mezenter görüntülenmesine olanak vermek üzere bağırsak dışı omentum süpürmek için kapsamlı bir hareket kullanın. kranial karın kaudalden gelen süpürme hareketi kullanmaya devam. o ameliyat alanının dışına yani omentum sağ kranial karın yerleştirilebilir.
- Sol veya sağ karın duvarına doğru inen kolon hareket etmek üzere kullanmak. Bu t daha iyi görselleştirme sağlayacako mezenterik lenf düğümleri için arama yardımcı olmak için mezentere.
- kolon ve mezenterik damarlar boyunca mezenterik lenf düğümleri bulmak için mezenter ile süpürme elde etmek üzere kullanmak.
NOT: kolonun mezenterik sınırı boyunca çalıştırmak Kolon düğümleri, sol kolik düğümler damarlarının şube yerlerin yakınında bulunabilir ve inferior mezenterik düğümleri inferior mezenterik damarlar boyunca bulunabilir. Mezenterik lenf düğümleri yağsız hayvanlarda kolaylıkla görebilir. Mezenterik yağ Gömüldüğünde genellikle örten mezentere biraz yükseltilmiş, parlak bir görünüm katacaktır ardından mezenterik yağ çevreleyen daha fazla grimsi bronzluk renk olabilir. Ayrıca, mezenterik lenf düğümleri lenfatiklere ve mezenterik damarların boyunca yalan eğilimindedir. - Bir lenf nodu belirlendikten sonra, prob kaldırmak ve karın boşluğuna Maryland mekanizmayla forseps yerleştirin. bitişik hedef düğümü mezenter kavramak için forseps kullanır. inci doğru mezenteri çekinsion ve kanül gelen kapsamını çıkarın.
- insuflatör kapatın ve mezenter dışsallaştırdığını kolaylaştırmak için karın basıncını açık kanül musluğunu bırakın. kesikten vücuda dışında mezenteri çekin. batın sonra, kesikten erişim sağlamak için kavisli bir sivrisinek hemostat veya başparmak forseps ile mezenter tutun.
- sıkı lenf düğümü ve / veya kül renkli rengi veya lenf düğümü nodüler görünüm doğrudan görselleştirme için el ile muayenesi ile batın mezenter içindeki lenf düğümü (ler) i belirlemek.
- kavisli hemostat kullanılarak düğüm civarındaki mezenter - (5 mm ~ 3) tespit sonra, küçük bir açıklık olun. kavisli hemostatlarla künt diseksiyon kullanılarak mezentere Ücretsiz ekleri. gerekli 4-0 emilmeyen monofilament sütür ile damar sistemini Arter. Lenf düğümü uzaklaştırmak için bir neşter ile keskin diseksiyon kullanın. Roswell Park Memorial Institute düğümleri (RPMI) orta 1640 yerleştirinbuz.
- Kanama için batın mezenteri inceleyin. Kanama tespit edilirse, veya dağlama kullanımı ile hemostat ya da bitişik harfler (4-0 emilmeyen monofilaman dikiş) gemiler tıkayarak uygun hemostaz sağlar. mezenter bırakın ve 10 karın geri insüfle - mezenter karın boşluğuna dönmesine imkan vermek için 12 mmHg.
- Tekrar ilave lenf nodu biyopsileri elde etmek üzere 2.4.8 boyunca 2.4.1 adımları tekrarlayın.
- Karaciğer Biyopsi
- yatay pozisyona tabloyu dönün.
- Daha önce (aşama 2.3.5 yapılan kesi), lenf düğümü biyopsi toplanması için kullanılan kesikten karın içine dişli bir kanül yerleştirin. trokar olmadan kanül yerleştirilmesi sağlamak için - (7 mm ~ 5) bir kesik kadar büyük olduğundan emin olun. kranyal karın boşluğuna doğru, bu kanül yoluyla katı kapsamı yerleştirin ve kraniyal karın ve karaciğer görselleştirmek.
- Kamera görüntüleme altında biyopsi f insertkanülden orceps önce sol kranyal karında (aşama 2.3.1 yapılan kesi) içine yerleştirilmiştir.
- Karaciğer biyopsisi elde karaciğer bakan çenenin hareketli parçası ile seçilen karaciğer lobu kenarı altında biyopsi forseps yer, forseps açık ve kenar açık çeneleri içine düşmesine izin vermek için. Hiçbir omentum karaciğer ve biyopsi forseps arasında olduğundan emin olun. Forseps konumunu ayarlamak ve istenen numune bölge üzerinde aleti kapatın.
- 30 s hemostaz sağlamak için - yaklaşık 20 için baskı koruyun. forseps kapalı ile hafifçe kanülden forseps yukarı çekerek numuneyi çıkar. Bu hafifçe karaciğer biyopsi gözyaşı. Buz üzerinde, RPMI 1640 ortamında karaciğer biyopsisi yerleştirin.
Not: Karaciğer biyopsisi büyüklüğü yaklaşık olarak 5 mm biyopsi forseps kullanılarak 5 mm x 2 mm x 2 mm'dir.
- 30 s hemostaz sağlamak için - yaklaşık 20 için baskı koruyun. forseps kapalı ile hafifçe kanülden forseps yukarı çekerek numuneyi çıkar. Bu hafifçe karaciğer biyopsi gözyaşı. Buz üzerinde, RPMI 1640 ortamında karaciğer biyopsisi yerleştirin.
- Kamera görselleştirme kullanarak kanaması için biyopsi sitesini inceleyin. kanama görülürse, bir tuzlu moistene yerleştirmekkanül içinden d steril pamuklu çubukla ve biyopsi sitesine basınç uygulayın. Seçenek olarak ise, hemostaz yardım etmek için steril jel köpük ile biyopsi siteleri paketi.
- Tekrar ilave karaciğer biyopsileri elde etmek üzere 2.5.5 boyunca 2.5.3 adımları tekrarlayın.
NOT: Burada prosedür başına hayvan başına 3 biyopsileri toplandı, tüm alt analizler için yeterlidir.
- Cerrahi Kapanış
- kanama karın boşluğu inceleyin.
NOT: Bu tarihe oluşmamıştır. aşırı kanama not edilir, ancak, kanama alanının tespit ve steril pamuklu ya da jel, köpüğün kullanımı ile basınç ile uygun hemostaz sağlar. - insuflatör kapatın ve kanül stopcocks açın. Tamamen periton boşluğunu basıncını için Karın yumuşak manuel basınç uygulayın. kanüller çıkarın.
- site başına 1 ila 2 basit tek sütürler ile karın duvarı kesiler her kapatın. 4-0 emilebilir sütür önerilir.
- Yerel analjezi için önce deri kapağın her bir kesi olarak 0.1-0.3 cc bupivakain yerleştirerek bir sıçrama blok gerçekleştirin.
- site başına 2 gömülü kesintiye dikişler (4-0 emilebilir sütür önerilir) - 1 ile cilt kapatın. Doku yapıştırıcı uygulanabilir.
- kanama karın boşluğu inceleyin.
3. Karaciğer biyopsisi işlenmesi ve Lenfosit Analizi
- karaciğer dokusunun birkaç adet saklayın (yaklaşık 0.5 mm x 0.5 mm boyutunda x 0,5 mm), gelecekteki moleküler ve histolojik için tercih edilen bir RNA depolama çözeltisi içinde dondurarak saklama tüplerde, ve% 10 formalin analiz eder.
- bir kapak ile 250 mL bir steril plastik bir kap içinde 1x penisilin / streptomisin, bir ticari olarak temin edilebilir kolajenaz çözeltisi 40 ug / mL, ve 4 ug / ml DNAz ile desteklenmiş 50 ml RPMI 1640 ortamında kalan karaciğer biyopsisi yerleştirin. kuvvetli bir şekilde, bir manyetik karıştırma çubuğu ve 37 ° C 'de 1 saat süre ile bir karıştırma plakası kullanarak karıştırın.
- Eşit sindirilmiş doku dökülerek dağıtın. griki 70 um filtreler üzerinde (aşama 3.1.1 den) sindirilmiş doku ind 5 ml steril bir şırınga ucunu kullanarak tek bir hücre süspansiyonu içine, iki 50 ml konik tüp içine uyar. RPMI içinde% 10 fetal sığır serumu ve 1 x penisilin / streptomisin (R10) ile desteklenmiş 1640 ortamı 50 mL her iki tüpün hacmi getirin.
- 4 ° C'de 6 dakika boyunca 840 xg'de hücreleri santrifüjleyin. Üstte kalan. 5 ml R10 her iki tüplerden süspansiyona ve bir 50 mL konik tüp içine birleştirerek tek bir 50 mL konik tüp içine hücreleri konsantre edilir. R10 ile 50 mL hacim getirin. Hücresel verimi belirlemek için, bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı.
- 4 ° C'de 6 dakika boyunca 840 xg'de hücreleri santrifüjleyin. , 1 ml R10 hücrelerin tekrar iki adet 5 mL'lik yuvarlak dipli bir polistiren tüpler içine eşit bir şekilde dağıtılması ve her bir tüp içinde> 500,000 hücre hedefleme, R10 ile 4 mL için, her tüpün hacmi getirmek.
- 4 ° C'de 6 dakika boyunca 840 xg'de hücreleri santrifüjleyin. s Durusuupernatant ve 4 ml fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde hücre pelletini. 4 ° C'de 6 dakika boyunca 840 x g'de santrifüjleyin.
- Üstte kalan hafifçe karıştırın 100 uL PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. sabitlenebilir bir ölü hücre leke 1.5 mcL ekleyin. 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- CD45-PerCP (klon D058-1283), CD3-PE-CF594 (klon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (klon 2H7), CD4-BV605 (: üretici tarafından tavsiye edilen titreleri aşağıdaki seyreltilmemiş yüzey boyama antikor ekleyin klon OKT4), CD8-BV570 (klon RPA-T8) ve CD14-BV785 (klon M5E2). 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
- 4 ° C'de 6 dakika boyunca 840 xg'de ml PBS ve santrifüj 4 ekleyin. Üstte kalan PBS içinde% 1 paraformaldehid 250 uL hücreler tekrar süspansiyon.
Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. - Referans olarak 22 tanımlanan bir akış sitometrisi kullanılarak hücre popülasyonları analiz edin.
Representative Results
Bu organlarda laparoskopik toplanan MLN'sinin işlenmesi için ayrıntılı yöntemler, hem de hücre verimi, ve lökosit frekansları önce 13 bildirilmiştir. Şekil 1, bu laparoskopik tekniği kullanarak iki sağlıklı kadın RMS 160 gün arayla iki zaman noktalarında toplanan MLG karşılaştırılması hücre verimi ve canlılığı veri ve karaciğer biyopsileri gösterir. Biz MLN'sinin hücresel verim, sırasıyla, elde edilen 33.5 x 10 6 ve 6.74 x 10 6 hücre, ortalama karaciğer (= 0.0021 P) göre önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Akış sitometrisi ile ölü hücre boyama ve analizi, her iki organlardan izole edilen hücrelerin>% 90 canlı olduğunu göstermiştir.
flow sitometri kullanarak, değerlendirilecek ve MLN ve karaciğerde lökosit ve lenfositlerin bolluğu karşılaştırıldı. karaciğer için temsili bir geçit şeması gösterilmektedir
Seri olarak alınan MLN ve karaciğer biyopsilerinde Şekil 1. Toplam Hücresel Verim (üst) ve Hücre Canlılığı (alt). MLN karaciğer anlamlı olarak daha yüksek hücre verimi gösterdi. Ancak, her iki numune tipleri alt analizler için yeterli hücrelerini verdiğini gösterir. akış sitometride ile ölçülen hücre viyabilitesi,etrically sabitlenebilir bir ölü hücre amin leke kullanılarak, her iki numune tipleri, tipik olarak, doku ayrışma sonra>% 90 hücre canlılığı ortaya çıkardığına işaret etti. Hata çubukları, örnekler arasında, standart sapmayı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Temsilcisi Sitometrisi Geçitleme Stratejisi. İlk olarak, toplanan hücreler sabitlenebilir ölü hücre amin leke kullanılarak boyamadan sonra, sadece canlı hücrelerin seçilmesi ile hariç tutulmuştur. Daha sonra, CD45 + lökositler, seçilen CD3 + T hücresi seçimi ile takip edildi. CD3 + nüfusunun itibaren CD4 + ve CD8 + T hücreleri analiz edildi. CD3 itibaren - nüfusun CD14 + ve CD20 + hücreler analiz edildi. Thi s yolluk strateji de MLN için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
MLN ve İki Hayvanlar Boyuna Karaciğerinde gelen Şekil 3. Akış Sitometri Arsalar. MLN ve karaciğer örnekleri her iki hayvan için 160 gün arayla toplanmıştır. (A). MLN CD45 + hücreleri (lökositler); (B) Karaciğer CD45 + hücreleri (lökosit); (C), MLN CD3 + hücreleri (T hücreleri); (D) Karaciğer CD3 + hücreleri (T hücreleri). Her iki hayvan için, MLN karaciğere kıyasla CD45 + ve CD3 + hücrelerinin daha yüksek oranlarda şunları verdi. zaman içinde, bu popülasyonlar frekansları her iki hayvan için de benzerdi.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil CD45 + (sol) Hücrelerin 4. Frekans ve çeşitli lökosit ve 23 bireysel numune alımları karşısında lenfosit alt (sağ). Karaciğer Her organ benzersiz işlevleri gösteren, CD14 + lökositlerin önemli ölçüde daha büyük frekanslar gösterdi MLNs, CD45 +, CD3 +, CD4 + hücreleri arasında önemli ölçüde daha büyük frekanslar gösterilir. Hata çubukları, örnekler arasında, standart sapmayı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Discussion
Burada, bu çalışmada açıklanmayan bu ve diğer hayvanlarda% 100 başarı oranı vardı seri MLN'sinin toplama ve karaciğer biyopsileri için minimal invaziv tekniği göstermektedir. Ayrıca, zaman içinde aynı hayvanlar üzerinde bu tekniğin kullanılması herhangi bir olumsuz olaylarla ilişkili edilmemiştir. Gerçekten de, SIV, maymun / insan bağışıklık eksikliği virüsü (SHIV) kullanmaktadır, veya Zika virüsü (yayınlanmamış veriler) ile aşılanmış hayvanların diğer gruplar halinde bu tekniğin kullanımından kaynaklanan komplikasyon olmuştur. Benzer şekilde, bu ameliyat bile daha önce, majör abdominal cerrahi geçiren hayvanlarda ve trombositopenik hayvanların (yayınlanmamış veriler) başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Biz ek kesiler ihtiyacını kaçınarak karaciğere MLN geçildiğinde bu numuneler kamera konumunu tersine çevirerek aynı iki limanları aracılığıyla toplanan edilebileceğini gösterdi. MLN toplanmasını etkileyen faktörler daha önce 13 bildirilmiştir.
tamamlamak için 45 dakika karıştırılır ve iki ~ 0.5 cm kesiklerden elde edilir - İşlemin tamamı tipik olarak 30 alır. şişman hayvan olarak, daha büyük bir kesi yapmak için gerekli olabilir - ile MLG almak için (~ 1 ila 1.5 cm) yapılır ve tamamlanması için ek süre gerektirebilir. Kapsamlı mezenterik yağ ile hayvanlar genellikle d önemli bir deneyime ihtiyaççevredeki yağdan MLG ifferentiate. MLN sıklıkla mezenterik damarların boyunca bulundu ve damarlarda şube yerlerin yakınında daha yaygın olduğu görülüyor edilmektedir. Bu tekniğin bir kritik bir yönü mezenter abdominal kesikten batın için yeterli hareketli olması seçilen MLG gerektirmesidir. Sonuç olarak, bu teknik mezenter köküne MLN yakın toplamak için kullanılamaz. Nedeniyle büyütmeye, bu kamera ile MLG tespit etmek ve MLN yakın kavrama yerinin ve dışarıya alınır kez düğümün belirlenmesi ile yardımcı olabilir kolay kez atar.
Trendelenburg pozisyonunda kullanılması her zaman MLN toplanması için gerekli olmayabilir ve MLN kolayca Trendelenburg pozisyonuna kullanılmadan alınabilir eğer o kraniyale kaymasını organlarını önleyecektir olarak karaciğer biyopsileri kolay hale getirebilir. Zaman zaman, Trendelenburg pozisyonuna yerleştirildikten sonra, karaciğer diyafram ve şırası karşı kaydırılır nazikçe geri biyopsi koleksiyonuna önce pozisyona manipüle edilebilir. MLN toplama noktası yerleştirme sola olduğu gibi onlar kanül daha yakın olarak, karaciğer biyopsileri genellikle sol yanal ve sol medial karaciğer lobu alınır.
MLN Toplanan ve karaciğer biyopsileri alt analizler, çeşitli için yeterli hücre verimi sağlanır ve toplanan hücrelerin yüksek yaşayabilirliği göstermemiştir. Burada hücreler lökosit ve lenfosit popülasyonu akış sitometrik analiz için boyanmıştır ve bu iki önemli bağışıklık organları arasında önemli farklılıklar ortaya konamamıştır. Örneğin, MLN yüksek iltihaplı yönetmek için, hem de CD4 + T önemine toplama ve adaptif bağışıklık tepkilerini yayılması için merkez noktaları olarak MLN'sinin önemi nedeniyle, karaciğere kıyasla, CD4 + T hücreleri için zenginleştirilmiş ve ortama tolerojenik tepkileri diyet alımı ve Gl yerleşik mikroorganizmalardan türetilen antijenleris = "xref"> 24. Ancak, karaciğer önemli MLN'sinin karşılaştırıldığında CD14 + lökositler için zenginleştirilmiştir. CD14 monosit ve makrofajlar üzerinde ağırlıklı olarak ifade edilir ve bakteriyel lipopolisakarit (LPS) 25 reseptör kompleksi önemli bir bileşenidir. Gerçekten de, çözünür CD14 yüksek plazma konsantrasyonları mikrobiyal translokasyon ve HIV bağışıklık aktivasyonu ve patojenik SIV enfeksiyonu 26 ile ilişkilidir. MLN karşılaştırıldığında Böylece, karaciğer CD14 + lökositlerin yüksek frekansları muhtemel bu organda daha büyük bir bakteri yükünün sonucudur.
Burada, seri MLN'sinin toplanması ve herhangi bir olumsuz sonuçlara yol açmamıştır laparoskopik giriş için sadece iki küçük kesi kullanılarak karaciğer biyopsileri için hızlı ve minimal invaziv cerrahi tekniği göstermektedir. Bu örnekler pla almak önemli immünolojik, virolojik ve mikrobiyolojik süreçlerini değerlendirmek için yararlı bir yol sağlayabilirSistemik bağışıklık ayrı ve farklı olan MLN ve karaciğerde ce. Benzer şekilde, karaciğer biyopsisi çoğunlukla önemli karaciğer hasarı 16 uyarmak üzere bir araya HIV / SIV, ilaç tedavileri ve transloke mikropların etkilerine, uzun süreli değerlendirilmesi için önemlidir. MLN ve karaciğer GI Mikrobiyota maruz bağışıklık organlar çünkü Dahası, yetenek zaman içinde bu organlarda bağışıklığı değerlendirmek için mikrobiyomları konak immün dengesinin düzenlenmesinde rolünü anlamak için mükemmel bir platform sağlar. Birlikte ele alındığında, karaciğer değerlendirilmesi ve MLN aşısı ve terapötik etkinlik dereceleri, SIV viral hazne temizlenmesinde, ve genel mukoza bağışıklık bağlamında büyük önemi vardır. bir minimal invaziv bir yaklaşım ile bu numune toplama özelliğini şu anda yayınlanan teknikler ve hayvanların fizyolojisi üzerinde daha az etki ile var olan daha prosedürü ile ilgili inflamasyon daha az risk olduğu anlamına gelir. fuTure, biz önemli bir rol oynamaktadır gösterilmiştir bağışıklık sisteminin bir başka önemli ve belirgin bölümünün örnekleme için izin vermek aynı iki liman yerleri ile dalak koleksiyonu ile MLN'sinin toplanması ve karaciğer birleştirmek potansiyelini değerlendirecek hastalık modelleri bir dizi.
Disclosures
Yazarlar herhangi mali çıkarlarını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe numarası P51OD010425 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
- Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
- Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
- Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
- Shuai, Z., et al.
- Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
- Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
- North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
- Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
- Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
- Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
- Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
- Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
- Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
- Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , Elsevier. (2011).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , Academic Press. (2009).
- Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia. , Blackwell Publishing. (2007).
- Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , Elsevier. (2012).
- Fransson, B. A., Mayhew, P. D. Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , Wiley Blackwell. (2015).
- Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
- Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
- Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).
