Summary
Burada uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LERLIC-MS / MS) yöntemi bir adım adım protokol mevcut. Bu av tüfeği proteomik tarafından glutamin ve asparajin deamidasyon izoformlarının ilk kez ölçümü ve karakterizasyonu için sağlayan bir roman yöntemdir.
Abstract
Protein deamidasyon Karakterizasyonu İnsan patoloji ve diğer biyokimyasal bağlamlarda bu protein dönüşüm sonrası modifikasyonu (PTM) rolü (ler) i ve potansiyeli deşifre zorunludur. Protein deamidasyon karakterizasyonu gerçekleştirmek için, yakın zamanda glutamin (Gln), ve asparajin (Asn) izoformu ayırabilen yeni bir uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LERLIC-MS / MS) yöntemi geliştirdik son derece karmaşık biyolojik örnekler model bileşiklerinden deamidasyon ürünleri. LERLIC-MS / MS, bu nedenle, bir, Gln, deamidasyon izoform ayrılması ve ölçümü için, ilk tüfek proteomik stratejisi. Ayrıca burada açıklanan örnek işleme protokolü LERLIC-MS / MS ile karakterizasyonu sağlayan süksinimid ara stabilize olduğu, bir yenilik olarak, göstermektedir. Bu video makalede gösterildiği gibi LERLIC-MS / MS uygulanması halen bilinmeyen aydınlatmak için yardımcı olabilirProtein deamidasyon n moleküler diziler. Buna ek olarak, LERLIC-MS / MS belirgin biyolojik kökenden deamidasyonu kapsayan enzimatik reaksiyonların daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Introduction
Deamidasyonu bir protein dönüşüm sonrası modifikasyonu asparagin (Asn) ve / veya glutamin (Gln) kalıntıları 1 modifikasyonu yoluyla protein omurgasına bir negatif yük getirmektedir (PTM) 'dir. 2: 1 oranında Asn kalıntısının etki ederken bu değişiklik, bir ortak 3 de izomerik ürünleri isoaspartic asit (IsoAsp) ve n -aspartic asit (Asp) oluşturur. Rağmen, bu oran tamir enzimi, L-isoaspartyl metiltransferaz (PIMT) 3, 4 müdahalesi ile değiştirilebilir. Benzer şekilde, Gln kalıntısının deamidasyon beklenen 1 de izomer gama-glutamik asit (γ-Glu) ve alfa-glutamik asit izoformu (α-Glu) oluşturur: 7 oranında 3, 5, bu oran aksiyonu ile kaydırılabilir her yerde enzim transglutaminaz 2 ve diğer transglütaminazlar da dahil olmak üzere transglütaminaz 1, ebeyin 6 hücre dışı veziküller ile ilişkili olarak nzyme yakın zamanda tespit edilmiş.
Deamidasyon kökeni (birkaç kronik de Gln transamidasyon ile ilgili detaylar ve Etkileri 3 bakınız önceki transglütaminazlar ve diğer enzimler, transamidasyon yoluyla arası / molekül içi çapraz bağlanma aracılık ettiği Gln kalıntıları özellikle yaygındır, kendiliğinden veya enzimatik olarak mevcut olabilir ve ölümcül insan hastalıkları). Bu nedenle, deamidasyon etkilenen moleküller 4, 7, 8, önemli bir yapı üzerinde yankı ve işlevi vardır ve 9 yaşlanma, hizmet olarak moleküler saat dahil olmak üzere çeşitli biyokimyasal sonuçları ışığında derinlemesine bir kimyasal karakterizasyonu 3 gerektiren bir PTM olan .
Asn kalıntılarına deamidasyonunun olmasına rağmen nispeten aşağıdan yukarı tüfek proteomik ile iyi karakterize edilmiş 1, 10, Gln kalıntısının deamidasyon yine elektron esaslı radikal parçalanma 11 model bileşimlerinin zor analizi ötesinde, uygun bir karakterizasyon yöntemi bulunmamaktadır. Son zamanlarda, tek bir analizde karmaşık biyolojik numunelerin ve model bileşiklerinden Gln ve Asn deamidasyon izoformlarının ayrılmasını sağlayan yeni bir tek boyutlu tüfek proteomik stratejisi (LERLIC-MS / MS) 3 geliştirdik. LERLIC-MS / MS, uzun uzunlukta (50 sm) elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi (ERLIC) modunda çalışan iyon değişim kolonu (lax) kullanılarak triptik sindirilmiş peptidlerin ayrılması göre ve tandem kütle spektrometrisi ile birleştirilir (LC MS / MS). Bu yeni analitik strateji karakterize ve nispeten insan beyin dokularında her deamide kalıntısının ölçüde ölçmek için kullanılmıştırf "> 3. Yine de burada özetlenen protokol ilgi biyokimyasal bağlamında protein deamidasyon özelliklerini incelemek amaçlanmıştır LERLIC-MS / MS video görüntüleme sağlayacaktır.
ETİK TABLOSU
Bu protokolün tüm işlemler Singapur Nanyang Teknoloji Üniversitesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve kurumsal kurallarına uygun olarak yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uzun uzunlukta Anyon değişim ambalaj (lax) Kılcal Sütun
(Not: lax kolon evde bu protokolde tarif olarak paketlenmiş, lax sütunlar da ticari olarak temin edilebilir olmasına rağmen, daha fazla ayrıntı için Materyaller ve Reaktifler: İçindekiler'i bakınız).
- Bulamaç hazırlamak üzere tamponu (Tablo 1) ambalaj 3.5 mL zayıf anyon değiştirme ambalaj malzemesi, 50 mg süspanse edin.
- bir dişi-dişi bağlantı parçası, bir ferule ve bir dişi somun ile - kılcal sütun (200 um iç çap (ID) boru 50 cm uzunluğunda) ucunu birleştirin. dişi-erkek uydurma içindeki bir ekran 1/16" OD 1 mikron arasında bir gözenek boyutuna yerleştirin (Not:. Burada kullanılan ekran malzeme sızmasını önlemek için ambalaj malzemesinin parçacık boyutundan daha küçük bir gözenek boyutuna sahip olması gerekir kolonu).
- 4500 psi'de çalıştırılan bir basınç pompası kullanan bulamaç ile kılcal paketleyin. (Not: Colu paketleyinambalaj malzemesi kadar mn kolonun girişi) de görülebilir.
- alanına 1.2 de tarif edildiği gibi kılcal kolon diğer ucunu bir araya getirin.
2. Numune Hazırlama
Bu protokol modeli proteomu olarak insan beyin dokularından analiz LERLIC-MS / MS uygulanmasını açıklar. (Not: diğer dokuları veya proteomik örnekleri kullanımı durumunda, örnek hazırlama işlemleri adapte edilmelidir.)
- Doku homojenizasyon:
a. üç kez beş dakika boyunca 1 x fosfat tampon solüsyonu ile yıkama, beyin dokuları (50 ila 100 mg).
b. 1: 1 ile doku homojenize 2.5 doku / metalik boncuk / SDC homojenizasyon tamponu (Tablo 2) oranı (ağırlık / ağırlık / hacim) bir doku homojenleştirici kullanılarak maksimum şiddette güvenli kilitli tüpler 4 ° C'de 5 dakika karıştırıldı. (Not: SDC homojenizasyon tamponu proteaz inhibitörleri içerebilir önce 3'te gösterildiği gibi)
c. ileri geri elde edilen doku homojenatı, santrifüj10.000 xg, 10 dakika boyunca 4 ° C'de bir önceki adımı, m ve yeni bir 1.5 mL tüpe supernatant toplamak.
d. Kalan topak için bc adımları tekrarlayın ve hiçbir topak görülünceye kadar gerekli olduğu kadar çok kez süpernatantlar birleştirin. (Not: İkiden fazla kez bc adımları tekrarlayın varsa, santrifüj basamağı sırasında numunenin kaybını önlemek için yeni bir kasa kilidi tüpe örnek ve boncuk taşımak).
e. Bikinkoninik asit analizi (BCA) 12 ile elde edilen homojenatlarının protein konsantrasyonu ölçmek. - Sodyum deoksikolat (SDC), beyin homojenatlarının içinde çözelti triptik sindirim 13 -assisted.
a. Protein disülfid bağları azaltılmasını başlatmak için elde edilen homojenata (Tablo 3 Çözüm 5 belirtilen stok solüsyonu kullanılarak), 10 mM ditiyotreitol (DTT) bir son konsantrasyon ekleyin.
b. bir banyoda 30 dakika boyunca inkübe edin Homojenat60 ° C'de daha önceden ayarlanır.
c. Homojenat Tablo 4 Çözüm 7'de gösterildiği stok solüsyonu kullanılarak 20 mM iyodoasetamit (IAA) bir son konsantrasyon ekleyin.
d. 45 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında EAM içeren Homojenat inkübe edin.
e. Beyin homojenatı seyreltme tamponu kullanılarak, iki kat (Tablo 3 Çözelti 6) seyreltin.
f. 37 ° C'de 30 dakika boyunca ikinci bir indirgeme adımı için örnek inkübe edin.
g. (Ağırlık / ağırlık) protein-enzim oranı, 1:50 Tablo 2'nin Çözüm 2 içinde çözülmüş dizileme dereceli modifiye tripsin ekleyin.
h. 30 ° C 'de bir gece boyunca inkübe etmek suretiyle tripsin ile Homojenat Digest.
ben. Formik asit (FA)% 0.5 nihai konsantrasyon ilave edilerek bir sonraki gün enzimatik sindirim söndürün. (Not: FA ilavesi, asidik koşullar altında SDC tuzlarının çökelmesini neden olur.)
j. Yavaşça SDC precipi içeren numunelerin vortekstates.
k. 12.000 xg, 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj örnekleri SDC tuzları aşağı pelet.
l. Süpernatant toplayın ve temiz yeni bir tüpe sıvı transferi. (Not: SDC pelet gelen tuzları yeniden askıya yok etmek bu adımın pipetleme esnasında özen ve / veya toplarlar.)
m. 1 dakika boyunca güçlü döndürülerek altında SDC yeniden eritilmesi tampon maddesi (Tablo 5) SDC pelet yeniden çözülür.
n. Adımları tekrarlayın iki kez çöktürülmüş peptidleri kurtarmak ve süpernatanlanm birleştirmek JL. (Not:. Bkz Serra et al ilgili daha ayrıntılı bilgi 2016 13 triptik sindirim protokolü burada adapte içinde çözelti SDC destekli.) - triptik bir tuz giderme örnekleri sindirilmiş.
a. Bir 1 g Cı-18 kartuşu kullanılarak sindirilmiş numunelerin tuz giderme gerçekleştirin. (Not: Bir büyük hacimli kartuş (5 mL) kullanımını, bağımsız bir şekilde, protein elde teminat örneklerde kalan SDC tuzlarının uygun temizlik miktarının öncedenLC-MS / MS, enjeksiyon için).
b. 5 mL asetonitril (ACN) ile 1 g Cı-18 kartuşun klima gerçekleştirin.
c. Kalan organik çözücünün çıkması için durumunu 1 g Cı-18 kartuşu temizlik tamponu (Tablo 6) 5 ml geçirin.
d. 1 g Cı-18 kartuşa örnek yükleyin.
e. Temizlik tamponu 5 mL her bir aşama kullanılarak 1 g C-18 kolonu içinde numuneye 5 temizleme adımları - 3 uygulayın.
f. Elüsyon tamponu 5 mL (Tablo 7) benzer şekilde 1 g Cı-18 kartuştan tuzdan arındırılmıştır peptidlerin elüt edilmesi.
g. bir vakum yoğunlaştırıcısı içinde ayrıştırılmıştır peptidler kurutun.
c. Elüsyon tamponu 200 uL nihai hacim içinde kurutuldu yeniden oluşturun. (Not:. Kullanımı (güçlü ve uzun> 30 dakika boyunca bir sonikasyon banyosu içerisinde müteakip sonikasyon ile, ardından 10 dakika) vorteksleme tamamen yeniden askıya enjeksiyon tamponu içinde kurutulmuştur peptidler)
d. Ana için LERLIC-MS / MS için örnek enjeksiyon hacmi ayarlamaprotein ug 3-1 arasında Lyze.
3. Tek boyut LERLIC-MS / MS Ayırma
- Sıvı kromatografi koşulları:
Mobil fazlar:
A: su içinde% 0.1 FA (Tablo 8).
B:% 0.1 FA ACN içinde (Tablo 9)
Akış hızı: 0.4 mL / dak
Kolon: lax kılcal sütun (50 cm uzunluğunda - 200 um İD)
a. 45 dakika süreyle% 3 B - 434 dakika boyunca% 85 B, 85 - 522 - dakika boyunca% 70 B, 70-124 dakika boyunca% 35 B, 35, 40 dakika, 95% 95 B: Aşağıdaki 1200 d gradyanı kullanarak 5 dakika boyunca% 3 B, 3, izokratik - 7 dakika boyunca% 95 B, 23 dakika boyunca% 95 B, izokratik tutulur.
b. Serra ve Gallart-Palau ve arkadaşları de belirtildiği gibi lax kılcal borular kullanılarak peptitlerin ayrılmasını gerçekleştirir. 3, çok yüksek basınç sıvı kromatografi kullanılarak. - Kütle spektrometresi yapılandırma:
a. veri toplama alternatif betwe gerçekleştirmek için tarama etkinlik ayrıntılarını yapılandırmatr tam Fourier dönüşümü-kütle spektrometresi (FT-MS) ve Fourier dönüşümü-tandem kütle spektrometresi (FT-MS / MS) aşağıdaki parametrelerle:
a.1. Veri toplama modu: Pozitif
FT-MS parametreleri a.2:
Kütle aralığı: 350 - 2000 m / z
Çözünürlük: 60.000
Microscans: spektrum başına 1
Otomatik kazanç kontrolü: 1 × 10 6
FT-MS / MS parametreleri a.3:
Parçalanma modu: Yüksek enerjili çarpışma ayrışma (HCD)
A.4 Kütle aralığı: 150 - 2000 m / z
a.5 Çözünürlük: 30.000
A.6 en K iyonları: 10
Microscans: spektrum başına 1
devlet şarj edin:> 2+
İzolasyon genişliği: 2 Da
A.7 Otomatik kazanç kontrolü: 1 × 10 6
b. 1.5 kV çalışan bir nano-elektrosprey iyon kaynağı ile donatılmış bir Orbitrap kütle spektrometresi kullanılarak 3'te gösterildiği gibi peptitler kütle spektrometresi algılama gerçekleştirin.
4. Veri Analizi
- prote gerçekleştirinLERLIC-MS / MS ile veritabanı arama belirli proteomik yazılımını kullanarak, aşağıdaki parametreler kullanılarak veriler elde edildi: (Not: Daha fazla bilgi için 3 bakınız.)
a. İyon toleransı: 10 ppm
b. Fragman iyon toleransı: 0.05 Da
c. Yanlış Keşif Oranı (FDR):% 1
d. Veritabanı: UniProt İnsan veritabanı
e. Sabit modifikasyonlar: Cys de Carbamydomethylation
f. Değişken modifikasyonlar (yazılım gerekli ise): Oksidasyon (Met), deamidasyonu (Asn ve Gln). - Şekli karakterizasyonu ve LERLIC-MS / MS verileri izomerik deamidatlı ürünlerin değerlendirilmesi:
a. Analiz için bir e-tabloda yazılımına LERLIC-MS / MS Dışa veritabanı arama sonuçları.
b. Bul ve deamidate peptidler ve bunların olmayan Deamide muadillerinin tüm listesini çıkarmak.
c. referans olarak elde peptitlerin listesini kullanarak, kütle tolerans 5 ppm bir uygun olanı yazılım kullanarak bu peptitlerin iyon kromatogramları (XICs) ekstrakte edin. (Not:XICs ekstraksiyonu için kullanılan yazılım ile ilgili daha fazla bilgi için 3 bakınız.)
d. Görsel olarak 3 belirtildiği gibi izomerik ürünler ayrılmış çift pik elüsyon belirlemek için elde edilen XICs kontrol edin. (Not: kolayca veritabanı arama sonucunda iki farklı tutma süreleri varlığı tarafından yönlendirilen bulunabilir MS / MS seviyesinde tespit peptidlerin izomerik ürünleri).
e. Her deamide Alanı / peptid izomerik ürünler rölatif ölçümü elde XICs olarak tanımlanan her izomerin pik alanına dayanılarak yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gln ve Asn kalıntısının deamidasyonu birçok kronik ve ölümcül hastalıklarda 14 içine dahil edilen bir dejeneratif protein modifikasyonu (DPM) olarak kabul edilir. PTM insan vücudunun ve benzer biyolojik arka 1, 15, antikorlar ve diğer moleküllerin yarı-ömrü ve parçalayıcı durumları tahmin edebilirsiniz gösterilmiştir. Protein deamidasyon önemi, aslında, dolayısıyla bu modifikasyon 16, 17 ve bazı çalışmalar resimlerinin doğru kalma gerçekleştirmek için zaman deamidasyon potansiyelini göstermiştir çeşitli proteomlarının mevcuttur ve arkeolojik 18, 19 kalır, biyomedikal bağlamda ötesine geçer . önemi ve farklı kökenlerden protein deamidasyon işlevselliği uzun süre teyit edilmiş olmasına rağmen,Yeniden bu PTM 3'ün derinlemesine bir karakterizasyonu elde etmek yolunda teknik ilerleme çok yakın bir eksikliği kadar oldu.
/ MS 3 LERLIC-MS uygulaması, Şekil 1 'de gösterildiği gibi, ilk kez ve Gln ve Asn, tek bir çalışma çözüldü ayrılması sağlar karmaşık proteomlarının veya modele izoformlannın da bağımsız Asn ve Gln deamide iki gösteren peptitler için bileşikler deamide proteoforms.
Şekil 1: LERLIC-MS / MS Workflow'un Şeması av tüfeği Proteomics ile kompleks Örneklerden Gln ve Asp deamidasyonu Ürünleri Ayrılması ve ölçümü için. LERLIC-MS / MS lax kılcal kolonu kullanılarak peptidlerin tek boyutlu ayırma işleminden önce LC-MS / MS ile, protein ekstraksiyonu ve enzimatik sindirim içerir. AnaXICs lizizi Farklı asit 3, 20, 21 göre farklı tutma süreleri elüte deamidasyon izomerik ürünler tanımlanmasını sağlar. MS / MS deamidatlı ve non-deamidatlı peptitler ve deamidatlı artığın emin kimliği arasında ayırt edilmesini sağlar. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Ters bir γ / α-glutamil oranı (Şekil 2) gösteren Transamidasyon enzimatik modifiye edilmiş ara madde Gln kalıntıları ortaya çıkan ve nörodejeneratif hastalıklar 3 proteinopathy çalışma üzerinde önemli etkileri olabilir LERLIC-MS / MS, 22, 23 ile karakterize edilebilir , 24. Daha önce Serra ve Gallart-Palau 2016 rapor edildiği gibi başka, deamidatlı Asn artıklarda ters bir IsoAsp / Asp oranı sunan birkaç bilinmeyen PIMT alt-tabaka proteinleri de LERLIC-MS / MS 3 insan dokularında tespit edilebilir.
Şekil 2: XICs ve Deamide Peptitler MS / MS Düzeyde Çift Tutma Times Belirlenmesi Teftiş deamidasyonda Gerçekleşen Önemli Enzimatik reaksiyonlarda Gln ve Asn Deamide İzomer ve Ürünler Tanımlama Karakterizasyonu izin verin. a. Beyin protein DPYL2 peptit FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK γ / α-glutamil izomerlerine tekabül eden iki tepe gösteren XIC detay ilgili proteini 2. ters γ / α-glutamil oranı detecte dihidroprimidinazbu peptitte d, ara bir transglutaminaz γ-glutamil olarak transglutamination reaksiyonunda γ-glutamil içeren tür olan potansiyel ima etmektedir. Deamide tortu, her ikisi de tutma sürelerinde MS / MS ile b doğrulanmıştır. 389.1 dakikada α-glutamil-ihtiva eden peptit ve c karşılık gelir. 401.4 dakikada γ-glutamil içeren peptide karşılık gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Bu çalışmanın bir yenilik olarak, LERLIC-MS / MS süksinimid ara madde (Şekil 3) karakterizasyonu olanak sağladığı bulunmuştur. Örnek işleme sırasında, hafif asitli pH kullanımı Asn 25 kalıntıları modifiye ara madde süksinimid stabilize eder. Bu nedenle, LERLIC-MS / MS succini ait proteom çapında çalışma sağlarmide ara maddesi, önemli fizyolojik ve patolojik etkileri 26 ile birlikte bir labil ve tam olarak anlaşılamamıştır modifikasyonu.
Şekil 3: LERLIC-MS / MS ile Asn Rezidülerinin Sukinimid Ara ürün tanımlanması. a. C Deamide Tortu Deam-Asn olarak belirtilir aldolaz Asn Spektrumu beyin proteini ALDO Cı Fruktoz-bisfosfatın peptid YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR deamidatlı. b. Bu durumda, en -17 Da'lık kütle kayma gösterir peptit YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, spektrumu nedeniyle önceden süksinimid ara maddenin oluşumu sırasında meydana gelen amonyum kaybına Asn kalıntı (SCC-Asn) deamidatlı. Th daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınrakamdır.
| Bileşen | 100 mL için tutar |
| izopropanol | 90 mL |
| Su | 10 ml |
Tablo 1. Ambalaj Tampon Bileşimi (% 90 izopropanol).
| Çözelti 1: amonyum asetat, 1 M. | |
| Bileşen | 50 mL için tutar |
| Amonyum asetat | 3.86 g |
| Su (50 mL kadar yapınız) | ~ 50 mL |
| Çözelti 2: amonyum asetat, 100 mM. | |
| Bileşen | 50 mL için tutar |
| Çözüm 1 | 5 mL |
| Su | 45 mL |
| Çözelti 3:% 10 sodyum deoksikolattır. | |
| Bileşen | 1 mL'lik miktarı |
| Sodyum deoksikolat | 0.1 gr |
| Su | 1 mL |
| Çözelti 4: SDC homojenizasyon tamponu (100 mM amonyum asetat,% 1 sodyum deoksikolat). | |
| Bileşen | 10 mL için tutar |
| Çözüm 2 | 9 ml |
| Çözüm 3 | 1 mL |
Tablo 2. SDC Homojenizasyon tampon Bileşim (100 mM Amonyum Asetat,% 1 sodyum deoksikolat). stok Solu hazırlayın1 amonyum asetat M (Çözelti 1) ve seyreltik tion amonyum asetat, 100 mM elde etmek için (Çözelti 2). Buna ek olarak,% 10 sodyum deoksikolat stok solüsyonu (Çözelti 3) hazırlanması. Çözüm 4 de tarif edildiği gibi SDC homojenizasyon tamponu hazırlayın.
| Çözüm 5: 1 M DTT | |
| Bileşen | 10 mL için tutar |
| Ditiyotretol | 77 mg |
| Çözelti 2 (Tablo 2) | 0.5 mL |
| Çözelti 6: seyreltme tamponu | |
| Bileşen | 10 mL için tutar |
| Çözüm 5 | 0.1 mL |
| Çözelti 2 (Tablo 2) | 9.9 mL |
Tablo 3. Seyreltme Tamponu Bileşim (10 mM ditiyotreitol (DTT) içeren 100 mM amonyum asetat). 1 M DTT stok solüsyonu (Çözelti 5) hazırlanması ve Çözüm 6'da ayrıntılı olarak daha sonra seyreltme tamponu hazırlayın.
| Çözelti 7: 1 M IAA | |
| Bileşen | 10 mL için tutar |
| IAA | 93 mg |
| Çözelti 2 (Tablo 2) | 0.5 mL |
Tablo 4. alkilasyonu Tampon Bileşimi (100 mM Amonyum Asetat, 20 mM iyodoasetamid (IAA) içeren). 1 M IAA (Çözelti 7), bir stok çözelti hazırlayın.
| Bileşen | 50 mL için tutar |
| Amonyum hidroksit | 0.25 mL |
| Su | 24.75 ml |
Tablo 5. SDC yeniden eritilmesi Tampon Bileşimi (% 0.5 amonyum hidroksit).
| Bileşen | 100 mL için tutar |
| Trifloroasetik asit | 0.1 mL |
| Su | 99.9 ml |
Tablo 6. Temizlik Tamponu (% 0.1 trifloroasetik asit).
| Bileşen | 100 mL için tutar |
| Asetonitril | 75 mL |
| Formik asit | 0.1 mL |
Tablo 7. Elüsyon Tamponu (% 75 asetonitril,% 0.1 formik asit).
| Bileşen | 1000 mL için tutar |
| Formik asit | 1 mL |
| Su | 999 ml |
Tablo 8. Mobil Faz A bileşim.
| Bileşen | 1000 mL için tutar |
| Formik asit | <td> 1 ml|
| Asetonitril | 999 ml |
Tablo 9. Hareketli faz B Bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video yazıda LERLIC-MS / MS 3'ün bir adım adım protokol sunmak için bir yöntem derinlemesine karakterizasyonunun ve doğru bir şekilde, protein deamidasyonu ve bu protein modifikasyonu ilgili enzimatik işlemlerin kapsamını tespit etmek. LERLIC-MS / MS elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi (ERLIC) 27 ilkesi altında uzun bir uzunlukta (50 sm) lax kullanımına dayanmaktadır. Çalışmamızda 3'te gösterildiği gibi uzun uzunlukta kolonunun kullanılması, izoelektrik noktalarına 27 göre ayrı peptitlere ERLIC potansiyelini arttırır.
LERLIC-MS / MS, yeni bir av tüfeği tek boyutlu ayırma strateji, son derece karmaşık bir proteomlarının ile en iyi sonuçları elde etmek için, 3 de gösterildiği gibi, bir 1200 dakika gradyan gerektirmesine rağmen örnek işleme sırasında zaman-on-eller kaydeden bir iş akışı temsil eder. Bir 60 dakika gradyanLERLIC-MS / MS t da tüfek proteomik 3 ilk kez örnek bileşikler üzerinde Gln deamidasyon izoformlarının uygun ayırma sağlayabilir. Bu iki uygulama dayanarak, lax kılcal tarafından gerçekleştirilen ikinci boyut ayırma orta karmaşıklık numunelerinin analizi için çok boyutlu bir kromatografi yaklaşımı altında bir birinci boyuta ters fazlı kromatografiye bağlanmış olabilir speküle, bir iş akışı önceden grubumuz 10 tarafından kullanılır.
Protein deamidasyon analiz için numune hazırlanması, büyük ölçüde 1 Asn artıkları üzerinde artefakt deamidasyon ortaya çıkmasını önlemek için dikkat gerektiren çok önemli bir adımdır. Hao ve ark. hafif asidik pH altında triptik sindirim önemli numune hazırlama 28 boyunca artefakt deamidasyon hayalet engellediği bulunmuştur. Bizim çözüm denemede SDC destekli bu çalışmada kullanmışpH değeri daha düşük 6 29 tutulduğunda ptic sindirim 13, örnek işleme Öte yandan pH 6 ile gerçekleştirilen bir yöntem olup, güçlü asidik koşullar tripsin sindirim engel olabilecek. Bu sorunu, çok yakın zamanda Liu ve ark adresleme. pH 4.5, 30 Glu-C tripsin ile değiştirilmesiyle Asn artıkları üzerinde artefakt deamidasyon meydana başarıyla sindirim ve önleme sağlayan bir optimum sindirim stratejisi bildirmiştir. Liu ve arkadaşları tarafından sindirim yöntemiyle uygulanması. 30 deneysel doğrulama gerektirir potansiyel strateji olabilir LERLIC-MS / MS ile Asn deamidasyonu analiz etmek için.
Bu video makalede özetlenen protokol daha ileri karakterize ve yaşlanma ve insan hastalıklarında protein deamidasyon katılımını tanımlayan şu anda bilinmeyen izoformu oranı dizileri miktarının belirlenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir. Kürkthermore, diğer biyolojik kökenden LERLIC-MS / MS uygulanması molekül saat modifikasyonu olarak potansiyellerini ve protein deamidasyon risklerini belirlemek için yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Singapur (NMRC-OF-IRG-0003-2016) ve NTU-NHG Araştırma Grant Yaşlanma Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (: Bu çalışma kısmen Eğitim Singapur Bakanlığının (Grant ARC9 / 15 Tier 2) hibe ile desteklenmiştir Grant ARG / 14017). Biz nazik bu çalışma mümkün kılan ambalaj materyalleri sağlayan Dr. Andrew Alpert ve PolyLC ekibine şükranlarımızı ve en içten teşekkürlerimi ifade etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
