Summary
Aquí se presenta un protocolo paso a paso de la longitud larga electrostática método (LERLIC-MS / MS) repulsión-hidrófilo interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem. Esta es una metodología novedosa que permite por primera cuantificación tiempo y caracterización de los glutamina y asparagina isoformas de desamidación por proteómica escopeta.
Abstract
Caracterización de la desamidación de proteínas es imprescindible para descifrar el papel (s) y las potencialidades de esta modificación postraduccional de proteínas (PTM) en la patología humana y otros contextos bioquímicos. Para llevar a cabo la caracterización de la desamidación de proteínas, hemos desarrollado recientemente una novela de longitud larga electrostática interacción cromatografía-espectrometría de masas tándem repulsión-hidrófilo (LERLIC-MS / MS) método que puede separar la glutamina (Gln) y asparagina isoforma (Asn) productos de desamidación de compuestos modelo a muestras biológicas muy compleja. LERLIC-MS / MS es, por lo tanto, la primera estrategia proteómica escopeta para la separación y cuantificación de las isoformas de desamidación de Gln. También demostramos, como novedad, que el protocolo de procesamiento de muestras descrito aquí estabiliza el intermedio de succinimida que permite su caracterización por LERLIC-MS / MS. Aplicación de LERLIC-MS / MS, como se muestra en este artículo de vídeo puede ayudar a dilucidar el momento desconocidaarrays n moleculares de desamidación de proteínas. Además, LERLIC-MS / MS proporciona una mayor comprensión de las reacciones enzimáticas que abarcan la desamidación en fondos biológicas distintas.
Introduction
La desamidación es una modificación postraduccional de proteínas (PTM) que introduce una carga negativa a la cadena principal de proteína a través de la modificación de la asparagina (Asn) y / o residuos de glutamina (Gln) 1. Esta modificación mientras que afecta a los residuos de Asn genera el ácido isoaspártico productos isómeros (isoAsp) y N ácido aspártico (Asp) a una común relación 3: 1 2. No obstante, esta relación puede ser alterado por la intervención de la enzima de reparación metiltransferasa-L isoaspartilo (PIMT) 3, 4. Del mismo modo, la desamidación de los residuos de Gln genera el ácido isomérica-gamma glutámico (γ-Glu) y las isoformas de ácido alfa-glutámico (α-Glu) a una esperada proporción de 1: 3, 5 7, pero esta relación puede ser desplazado por la acción de la transglutaminasa omnipresente enzima 2 y otras transglutaminasas, incluyendo transglutaminasa 1, un correonzyme identificado recientemente como asociada con vesículas extracelulares en el cerebro 6.
El origen de la desamidación puede ser ya sea espontánea o enzimática, el primero es especialmente común en los residuos de Gln en la que transglutaminasas y otras enzimas median reticulación / intra-molecular entre a través de transamidación (ver 3 para más detalles sobre Gln transamidación y sus implicaciones en varios crónica y enfermedades humanas mortales). Por lo tanto, la desamidación es una PTM que tiene una repercusión fundamental en la estructura y función de las moléculas afectadas 4, 7, 8 y requiere de una caracterización química en profundidad 3 a la luz de sus diversas consecuencias bioquímicas incluyendo su servicio de reloj como molecular del envejecimiento 9 .
Aunque la desamidación de residuos de Asn ha sido relativamente bien caracterizado por la proteómica escopeta de abajo hacia arriba 1, 10, desamidación de residuos de Gln todavía no tiene un método de caracterización adecuada más allá del análisis desafiante de compuestos modelo por la fragmentación radical a base de electrones 11. Recientemente hemos desarrollado un novedoso de una sola dimensión estrategia proteómica escopeta (LERLIC-MS / MS) 3 que permite la separación de Gln y Asn isoformas de desamidación partir de muestras biológicas complejas y compuestos modelo en un solo análisis. LERLIC-MS / MS se basa en la separación de trípticos digeridos péptidos usando una larga de longitud (50 cm) columna de intercambio iónico (LAX) que trabaja en el modo de cromatografía de interacción electrostática de repulsión-hidrófilo (ERLIC) y acoplada a espectrometría de masas tándem (LC- MS / MS). Esta nueva estrategia de análisis se ha utilizado para caracterizar y relativamente cuantificar la extensión de cada residuo desamidada en los tejidos cerebrales humanosf "> 3. Sin embargo, el protocolo descrito aquí proporcionará imágenes de vídeo de LERLIC-MS / MS dirigido a estudiar las peculiaridades de la desamidación de proteínas en el contexto bioquímico de interés.
DECLARACIÓN DE ÉTICA
Todos los procedimientos de este protocolo han sido aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad Tecnológica de Nanyang en Singapur y se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales.
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Protocol
1. Embalaje El anión de intercambio de longitud larga columna (LAX) Capilar
(Nota: A pesar de la columna puede ser de LAX en el hogar lleno como se describe en este protocolo, columnas LAX también están disponibles comercialmente, véase la Tabla de Materiales y Reactivos para más detalles).
- Suspender 50 mg de material de embalaje de intercambio aniónico débil en 3,5 ml de tampón de embalaje (Tabla 1) para preparar la suspensión.
- Montar el extremo de la columna capilar (50 cm de longitud - 200 m de diámetro interno ID del tubo ()) usando una de hembra a hembra apropiado, una férula y una tuerca hembra. Coloque una pantalla de 1/16" OD de 1 micra de tamaño de poro dentro de la guarnición-hembra a hembra. (Nota: La pantalla que se utiliza aquí debe tener un tamaño de poro más pequeño que el tamaño de partícula del material de embalaje para evitar la fuga del material de la columna).
- Empaque el capilar con la suspensión usando una bomba de presión operado a 4500 psi. (Nota: Pack de la column hasta que el material de embalaje es visible en la entrada de la columna).
- Montar el otro extremo de la columna capilar como se describe en el punto 1.2.
Preparación 2. Muestra
Este protocolo describe la aplicación de LERLIC-MS / MS para analizar los tejidos cerebrales humanos como modelo proteoma. (Nota: En el caso de utilizar otros tejidos o muestras de proteómica, los procedimientos de preparación de muestras deben ser adaptados.)
- Homogeneización de tejidos:
a. tejidos cerebrales de lavado (50 a 100 mg) con solución tampón de fosfato 1x durante cinco minutos tres veces.
segundo. Homogeneizar el tejido en 1: 1: (Tabla 2) 2.5 tejido / de los granos metálicos / tampón de homogeneización SDC (w / w / v) durante 5 min a 4 ° C en tubos de bloqueo de seguridad en intensidad máxima usando un homogeneizador de tejidos. (Nota: tampón de homogeneización SDC puede incluir inhibidores de la proteasa como se ha indicado anteriormente en 3)
do. Centrifugar el homogeneizado de tejido, obtenido from el paso anterior, a 10.000 x g, 4 ° C durante 10 minutos y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 ml.
re. Repita los pasos bc para los gránulos restantes y combinar los sobrenadantes tantas veces como sea necesario hasta que no se observa ningún sedimento. (Nota: Si usted tiene que repetir los pasos bc más de dos veces, mover la muestra y las cuentas a un nuevo tubo de fallos de bloqueo para evitar la pérdida de muestra durante la etapa de centrifugación).
mi. Cuantificar la concentración de proteína de los homogeneizados obtenidos por Acid ensayo bicinconínico (BCA) 12. - Desoxicolato de sodio (SDC) -assisted en solución de digestión tríptica 13 de homogeneizados de cerebro.
a. Añadir una concentración final de ditiotreitol 10 mM (DTT) (usando la solución madre se indica en la solución 5 de la Tabla 3) para el homogeneizado obtenido para iniciar la reducción de los enlaces disulfuro de la proteína.
segundo. Incubar el homogeneizado durante 30 min en un bañopre-fijado en 60 ° C.
do. Añadir al homogenado una concentración final de yodoacetamida 20 mM (IAA), utilizando la solución madre se indica en la Solución 7 de la Tabla 4.
re. Incubar el homogeneizado que contiene IAA a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 min.
mi. Diluir el homogeneizado de cerebro-dos pliegues utilizando tampón de dilución (solución 6 de la Tabla 3).
F. Incubar la muestra durante una segunda etapa de reducción durante 30 min a 37 ° C.
gramo. Añadir tripsina modificada de calidad para secuenciación disolvió en una solución 2 de la Tabla 2 en proteína-enzima 1:50 (w / w).
marido. Digerir el homogeneizado con tripsina por incubación durante la noche a 30 ° C.
yo. Se detiene la digestión enzimática en el día siguiente mediante la adición de 0,5% de concentración final de ácido fórmico (FA). (Nota: La adición de FA causará la precipitación de las sales de SDC en condiciones ácidas.)
j. vórtice suavemente las muestras que contienen SDC precipistados.
k. Se precipitan hacia abajo las sales SDC mediante la centrifugación de las muestras a 12.000 xg, 4 ° C durante 10 min.
l. Recoger el sobrenadante y transferir el líquido a un nuevo tubo limpio. (Nota: Tenga cuidado durante el pipeteo de este paso para no volver a suspender y / o sales de recoger a partir del sedimento SDC).
metro. Re-disolver el pellet SDC en re-disolución tampón SDC (Tabla 5) bajo agitación vigorosa durante 1 min.
norte. Repetir los pasos JL dos veces para recuperar péptidos precipitados y se combinan los sobrenadantes. (Nota:. Ver Serra et al 2016 13 para más detalles sobre la SDC-asistido en solución protocolo de digestión tríptica adaptado aquí.) - La desalación de tríptica digerido muestras.
a. Realizar desalinización de muestras digeridas usando un cartucho de 1 g C-18. (Nota: El uso de un cartucho de volumen grande (5 ml), independientemente de la cantidad de proteína obtenida garantías limpieza adecuada de sales restantes SDC en las muestras antesa la inyección de LC-MS / MS).
segundo. Realizar acondicionado del cartucho C-18 de 1 g con 5 ml de acetonitrilo (ACN).
do. Pase 5 ml de tampón de limpieza (Tabla 6) por el cartucho 1 g C-18 acondicionado para eliminar cualquier disolvente orgánico restante.
re. Cargar la muestra en el cartucho de 1 g C-18.
mi. Realizar 3 - 5 pasos de limpieza a la muestra en la columna de la 1g C-18 usando 5 ml de tampón de limpieza de cada paso.
F. Eluir los péptidos desaladas de la 1g C-18 cartucho utilizando 5 ml de tampón de elución (Tabla 7).
gramo. Secar los péptidos eluidos en un concentrador de vacío.
do. Reconstituir la muestra seca en un volumen final de 200! L de tampón de elución. (Nota:. Uso vigorosa y largo (> 10 min) vórtex seguido por sonicación posterior en un baño de sonicación durante 30 min a completamente re-suspender los péptidos secos en tampón de inyección)
re. Ajustar el volumen de inyección de la muestra para LERLIC-MS / MS a analisar entre 1 a 3 g de proteína.
3. Una dimensión LERLIC-MS / MS Separación
- condiciones de cromatografía de líquidos:
Las fases móviles:
A: FA 0,1% en agua (Tabla 8).
B: 0,1% FA en ACN (Tabla 9)
Velocidad de flujo: 0,4 l / min
Columna: columna capilar LAX (longitud 50 cm - 200 micras ID)
a. Usar el siguiente 1200 min-gradiente: 95% de B durante 40 min, 95 - 85% B para 434 min, el 85 - El 70% B para 522 min, el 70 - El 35% B durante 124 min, de 35 - 3% B durante 45 min , isocrática a 3% de B durante 5 min, 3 - 95% de B durante 7 min y se mantuvo isocrática a 95% de B durante 23 min.
segundo. Realizar la separación de péptidos usando el capilar LAX como se indica en Serra & Gallart-Palau et al. 3 utilizando cromatografía líquida de ultra-alta presión. - configuración Espectrómetro de masas:
a. Configurar los detalles del evento exploración para realizar las betwe adquisición de datos alternaen completo transformada de Fourier-espectrometría de masas (FT-MS) y espectrometría de masas Fourier transform-tándem (FT-MS / MS) con los siguientes parámetros:
a.1. modo de adquisición de datos: positivo
a.2 parámetros FT-MS:
Rango de masas: 350 - 2000 m / z
Resolución: 60000
Microscans: 1 por espectro
Control automático de ganancia: 1 × 10 6
a.3 parámetros FT-MS / MS:
modo de fragmentación: de alta energía de disociación de colisión (HCD)
Rango de masas a.4: 150 - 2000 m / z
A.5 Resolución: 30000
a.6 Top N iones: 10
Microscans: 1 por espectro
Estado de carga:> 2+
anchura de aislamiento: 2 Da
a.7 control de ganancia automático: 1 × 10 6
segundo. Realizar la detección de espectrometría de masas de péptidos como se indica en 3 usando un espectrómetro de masas orbitrap equipado con una fuente de iones de nanoelectropulverización de trabajo en 1,5 kV.
Análisis 4. Datos
- realizar una proten la búsqueda de base de datos a la LERLIC-MS / MS obtenido datos utilizando los siguientes parámetros utilizando un software específico proteómico: (Nota: Ver 3 para más detalles).
a. tolerancia Ion: 10 ppm
segundo. tolerancia ion Fragmento: 0,05 Da
do. Tasa de Falso Descubrimiento (FDR): 1%
re. Base de datos: la base de datos UniProt Humano
mi. modificaciones fijos: Carbamydomethylation en Cys
F. modificaciones variables (si lo requiere el software): Oxidación (Met), desamidación (Asn y Gln). - caracterización confidentes y cuantificación de los productos deamidadas isoméricas en datos LERLIC-MS / MS:
a. Resultados de búsqueda de base de datos de exportación de LERLIC-MS / MS a un software para el análisis spreedsheet.
segundo. Encontrar y extraer toda la lista de péptidos desamidada y sus contrapartes no desamidada.
do. Usando la lista de los péptidos obtenidos como referencia, extraer los cromatogramas de iones (XICS) de estos péptidos usando un software apropiado en 5 ppm de la tolerancia de masas. (Nota:Ver 3 para más detalles sobre el software utilizado para la extracción de XICS).
re. Inspeccionar visualmente los Xics obtenidos para identificar la elución de doble pico separado de los productos isómeros, como se indica 3. (Nota: Los productos isoméricas de dichos péptidos identificados a nivel de MS / MS se pueden encontrar fácilmente guiado por la presencia de dos tiempos de retención diferentes en el resultado de búsqueda de base de datos).
mi. La cuantificación relativa de los productos isómeros de cada sitio / péptido desamidada tiene que ser realizada en base al área del pico de cada isómero identificados en los Xics obtenidos.
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Representative Results
La desamidación de residuos Gln y Asn se considera una modificación de proteínas degenerativa (DPM) implicado en varias enfermedades crónicas y fatales 14. Se ha demostrado que este PTM puede predecir la vida media y degradativas estados de anticuerpos y otras moléculas en el cuerpo humano y fondos biológicas similares 1, 15. La importancia de la desamidación de proteínas, de hecho, va más allá del contexto biomédico, por lo tanto, esta modificación está presente en diversos proteomas 16, 17 y algunos estudios han demostrado el potencial de desamidación en el tiempo para realizar citas precisa de pinturas y restos arqueológicos 18, 19 . Aunque la significación y la funcionalidad de la desamidación de proteínas en diversos orígenes se han afirmado durante mucho tiempo, lare era hasta hace muy poco la falta de avance técnico en la forma de lograr una caracterización en profundidad de este PTM 3.
Aplicación de LERLIC-MS / MS 3, como se representa en la Figura 1, proporciona por primera vez y en una separación única ejecución resuelto de Gln y Asn desamidada isoformas de proteomas o modelo de compuestos complejos, incluso para aquellos péptidos que muestran dos Asn independiente y Gln desamidan proteoforms.
Figura 1: Diagrama de LERLIC-MS / MS de flujo de trabajo para la separación y cuantificación de Gln y Asp desamidación los productos de muestras complejas por Shotgun proteómica. LERLIC-MS / MS implica la extracción de proteínas y digestión enzimática antes de la separación de una sola dimensión de péptidos por LC-MS / MS utilizando la columna LAX capilar. analisis de Xics permite la identificación de productos isómeros de desamidación eluyeron a diferentes tiempos de retención en base a su diferente acidez 3, 20, 21. MS / MS permite la discriminación entre los péptidos desamidadas y no desamidada y la identificación confianza del residuo desamidada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Residuos de Gln intermedios enzimáticamente modificadas de transamidación que exhibe una relación invertida γ / α-glutamil (Figura 2) pueden ser descubiertos y se caracterizan por LERLIC-MS / MS, lo que podría tener implicaciones importantes en el estudio de proteinopatía en enfermedades neurodegenerativas 3, 22, 23 , 24. Además, como se informó anteriormente en Serra & Gallart-Palau 2016, varias proteínas de sustrato PIMT desconocido que presentan una relación de isoAsp / Asp invertida en residuos de Asn deamidadas pueden también ser identificadas en tejidos humanos por LERLIC-MS / MS 3.
Figura 2: La inspección de XICS e Identificación de Doble Tiempos de retención en el / Nivel MS MS de los péptidos desamidada permitir la caracterización de Gln y Asn desamidada isómeros e identificación de los productos de las reacciones enzimáticas cruciales que tienen lugar en desamidación. a. Detalle de la XIC que muestra los dos picos correspondientes a los isómeros γ / α-glutamil del péptido FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK de la proteína de cerebro DPYL2 dihidropirimidinasa relacionados con la proteína 2. La invertida γ / α-glutamil relación detected en que el péptido indica la implicación potencial de la especie que contiene γ-glutamil-en la reacción transglutamination como una transglutaminasa γ-glutamil intermedio. El residuo desamidada se verificó por MS / MS en ambos tiempos de retención, b. a 389,1 min correspondiente al péptido y c que contiene α-glutamil-. a 401,4 min correspondiente al péptido que contiene γ-glutamil-. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como novedad de este trabajo, se encontró que LERLIC-MS / MS permite la caracterización de la succinimida intermedia (Figura 3). El uso de pH ácido suave durante el procesamiento de la muestra se estabiliza la succinimida intermedio en modificado Asn residuos 25. Por lo tanto, LERLIC-MS / MS permite el estudio de todo el proteoma de la succinimide intermedio, una modificación lábil y mal entendido con implicaciones fisiológicas y patológicas significativas 26.
Figura 3: Identificación de la succinimida Intermedio en Asn residuos por LERLIC-MS / MS. a. Espectro de la Asn desamidada péptido YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR de la proteína de cerebro ALDO C fructosa bifosfato aldolasa residuo C. desamidada se indica como Deam-Asn. segundo. Espectro del péptido YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, que en este caso muestra un desplazamiento de masa de -17 Da en el desamidada previamente Asn residuo (SCC-Asn) debido a la pérdida de amonio que tienen lugar durante la formación del intermedio de succinimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de les figura.
| Componente | Cantidad para 100 ml |
| isopropanol | 90 ml |
| Agua | 10 ml |
Tabla de Composición de Tampón 1. Embalaje (90% isopropanol).
| Solución 1: 1 M de acetato de amonio. | |
| Componente | Cantidad para 50 ml |
| Acetato de amonio | 3,86 g |
| Agua (hacer hasta 50 ml) | ~ 50 ml |
| Solución 2: 100 mM de acetato de amonio. | |
| Componente | Cantidad para 50 ml |
| solución 1 | 5 ml |
| Agua | 45 ml |
| Solución 3: 10% de desoxicolato de sodio. | |
| Componente | Cantidad para 1 ml |
| desoxicolato de sodio | 0,1 g |
| Agua | 1 ml |
| Solución 4: tampón de homogeneización SDC (acetato de amonio 100 mM que contiene 1% de desoxicolato de sodio). | |
| Componente | Cantidad para 10 ml |
| solución 2 | 9 ml |
| solución 3 | 1 ml |
Tabla 2. Composición SDC tampón de homogeneización (100 mM de acetato de amonio que contiene 1% desoxicolato de sodio). Preparar las acciones Solución de 1 M de acetato de amonio (solución 1) y se diluye para obtener 100 mM de acetato de amonio (Solución 2). Además, preparar la solución madre de desoxicolato de sodio al 10% (Solución 3). Preparar el tampón de homogeneización SDC como se describe en la Solución 4.
| Solución 5: 1 M DTT | |
| Componente | Cantidad para 10 ml |
| ditiotreitol | 77 mg |
| Solución 2 (Ver Tabla 2) | 0,5 ml |
| Solución 6: tampón de dilución | |
| Componente | Cantidad para 10 ml |
| solución 5 | 0,1 ml |
| Solución 2 (Ver Tabla 2) | 9,9 ml |
Tabla 3. Composición de tampón de dilución (100 mM de acetato de amonio que contenía ditiotreitol 10 mM (DTT)). Preparar la solución madre de 1 M DTT (solución 5) y posteriormente preparar el tampón de dilución como se detalla en la Solución 6.
| Solución 7: 1 M IAA | |
| Componente | Cantidad para 10 ml |
| IAA | 93 mg |
| Solución 2 (Ver Tabla 2) | 0,5 ml |
Tabla 4. Composición Alquilación Buffer (100 mM de acetato de amonio que contiene yodoacetamida 20 mM (IAA)). Preparar la solución madre de 1 M IAA (Solución 7).
| Componente | Cantidad para 50 ml |
| Hidróxido de amonio | 0,25 ml |
| Agua | 24.75 ml |
Tabla 5. Composición SDC redisolución Buffer (0,5% hidróxido de amonio).
| Componente | Cantidad para 100 ml |
| Ácido trifluoroacético | 0,1 ml |
| Agua | 99,9 ml |
Tabla 6. Clean-up Buffer (0,1% de ácido trifluoroacético).
| Componente | Cantidad para 100 ml |
| acetonitrilo | 75 ml |
| Ácido fórmico | 0,1 ml |
Tabla 7. Tampón de Elución (75% de acetonitrilo, 0,1% de ácido fórmico).
| Componente | Cantidad para 1000 ml |
| Ácido fórmico | 1 ml |
| Agua | 999 ml |
Tabla 8. Fase móvil una composición.
| Componente | Cantidad para 1000 ml |
| Ácido fórmico | <td> 1 ml|
| acetonitrilo | 999 ml |
Tabla 9. Fase móvil B Composición.
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Discussion
En este video-artículo se presenta un protocolo paso a paso de LERLIC-MS / MS 3, un método para llevar a cabo la caracterización en profundidad y para determinar con precisión la extensión de la desamidación de proteínas y los procesos enzimáticos que participan en esta modificación de la proteína. LERLIC-MS / MS se basa en el uso de una de longitud larga (50 cm) LAX bajo el principio de cromatografía electrostática de repulsión-hidrófilo interacción (ERLIC) 27. El uso de una columna de longitud larga, como se muestra en nuestro estudio 3, maximiza el potencial de ERLIC a péptidos separados según su punto isoeléctrico 27.
LERLIC-MS / MS representa una estrategia de separación unidimensional novela escopeta, un flujo de trabajo que ahorra tiempo-en-manos durante el procesamiento de la muestra aunque requiere un gradiente de 1.200 min como se indica en 3 para obtener resultados óptimos en proteomas altamente complejos. A 60 min gradient en LERLIC-MS / MS también puede conseguir la separación óptima de las isoformas de desamidación de Gln en compuestos modelo por primera vez en la proteómica escopeta 3. Basado en estas dos aplicaciones, se especula que segunda separación dimensión realizado por capilar LAX podría acoplarse a una cromatografía de fase inversa primera dimensión bajo un enfoque de cromatografía multidimensional para el análisis de muestras de complejidad media, un flujo de trabajo utilizado anteriormente por nuestro grupo 10.
Preparación de la muestra para el análisis de la desamidación de proteínas es un paso crucial que requiere una cuidadosa atención a evitar la aparición de desamidación artefactual en los residuos de Asn en gran medida 1. Hao et al. encontraron que la digestión tríptica bajo pH ácido suave evita significativamente aparición de desamidación artefactual durante la preparación de la muestra 28. Hemos utilizado en este estudio nuestra SDC-asistido en solución intentodigestión PTIC 13, un método en el procesamiento de la muestra se lleva a cabo a pH 6. Por otro lado, condiciones ácidas más fuertes podría cuestionar la capacidad de digestión de tripsina cuando el pH se mantiene menor que 6 29. Al abordar esta cuestión, hace muy poco Liu et al. han informado de una estrategia de digestión óptima que permite la digestión exitosa y la prevención de la ocurrencia de desamidación artefactual en los residuos de Asn mediante la sustitución de la tripsina por Glu-C a pH 4,5 30. Aplicación del método de digestión reportado por Liu et al. 30 para analizar Asn desamidación por LERLIC-MS / MS podría ser una estrategia potencial que requiere la verificación experimental.
El protocolo descrito en este video-artículo tiene un gran potencial para caracterizar adicionalmente y cuantificar actualmente desconocidos arrays de relación de isoforma que definen la participación de la desamidación de proteínas en el envejecimiento y las enfermedades humanas. PelajeThermore, la aplicación de LERLIC-MS / MS en otros orígenes biológicos ayudará a determinar las potencialidades y los riesgos de la desamidación de proteínas como una modificación de reloj molecular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de Educación de Singapur (Nivel 2: Grant ARC9 / 15), Consejo Nacional de Investigación Médica de Singapur (NMRC-DE-GRI-0003 hasta 2016), y el NTU-NHG Aging Research Grant ( subvención ARG / 14017). Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento y más sincero agradecimiento al Dr. Andrew Alpert y equipo para PolyLC amablemente nos proporcionó los materiales de embalaje que hicieron posible este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
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- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
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