Summary
כאן אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול של דחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית באורך ארוך אינטראקציה-טנדם כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (LERLIC-MS / MS) שיטה. זוהי שיטה חדשנית המאפשרת כימות לראשונה ואפיון של isoforms deamidation גלוטמין ו asparagine ידי פרוטאומיקה רובה.
Abstract
אפיון של חלבון deamidation הוא הכרחי כדי לפענח את התפקיד (ים) ועל פוטנציאל של שינוי posttranslational חלבון זה (PTM) בפתולוגיה האנושית בהקשרים ביוכימיים אחרים. על מנת לבצע אפיון של חלבון deamidation, אנו לאחרונה פיתחו ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם אינטראקציה ודחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית לטווח אורך הרומן (LERLIC-MS / MS) שיטה שיכולה להפריד בין גלוטמין (GLN) ו asparagine (ASN) איזופורם מוצרים של deamidation מן תרכובות מודל דגימות ביולוגיות מורכבות מאוד. LERLIC-MS / MS היא, אפוא, אסטרטגית פרוטאומיקה הרובה הראשונה להפרדה וכימות של isoforms deamidation GLN. אנחנו גם להפגין, כחידוש, כי פרוטוקול עיבוד מדגם המתוארות כאן מייצב את ביניים succinimide המאפשר אפיון שלה על ידי LERLIC-MS / MS. יישום של LERLIC-MS / MS כפי שמוצג במאמר זה וידאו יכול לעזור כדי להבהיר את כרגע unknowמערכים מולקולריים n של deamidation חלבון. בנוסף, LERLIC-MS / MS מספקת הבנה נוספת של תגובות אנזימטיות כי להקיף deamidation ב רקע ביולוגי מובהק.
Introduction
Deamidation הוא שינוי posttranslational חלבון (PTM) המציג מטען שלילי לשדרת חלבון באמצעות שינוי של asparagine (ASN) ו / או גלוטמין (GLN) שאריות 1. שינוי זה תוך העמדת פנים שהם שאריות ASN מייצר חומצת isoaspartic מוצרים isomeric (isoAsp) ו- n חומצה -aspartic (ASP) בבית 3 המשותף: יחס 1 2. עם זאת, יחס זה ניתן לשינוי על ידי התערבות של methyltransferase L-isoaspartyl אנזים תיקון (PIMT) 3, 4. באופן דומה, deamidation של שאריות GLN מייצר חומצת isomeric גלוטמית-גמא (γ-Glu) ו isoforms חומצה גלוטמית-אלפא (α-Glu) במכירה צפוי 1: 7 יחס 3, 5, אך יחס זה יכול להיות מוזז על ידי פעולה של transglutaminase האנזים נמצא בכל מקום 2 ו transglutaminases אחר, כולל transglutaminase 1, דוארnzyme זיהה לאחרונה הקשורים שלפוחית תאית במוח 6.
מקורו של deamidation יכול להיות ספונטני או אנזימטי, לשעבר נפוץ במיוחד על שאריות GLN שבו transglutaminases ואנזימים אחרים לתווך בין / crosslinking תוך המולקולרי באמצעות transamidation (ראה 3 לפרטים נוספים על GLN transamidation וההשלכות בכמה כרוני מחל אנושיות קטלניות). לכן, deamidation הוא PTM שיש לו השלכה מכרעת על המבנה ותפקוד של מולקולות מושפעות 4, 7, 8 ו דורש אפיון כימי מעמיק 3 לאור השלכות ביוכימיים המגוונים שלה כולל השירות שלה כמו שעון מולקולרי של הזדקנות 9 .
למרות deamidation של שאריות ASN כבר יחסית היטב מאופיין פרוטאומיקה רובה מלמטה למעלה 1, 10, deamidation של שאריות GLN עדיין אין שיטה לאפיון מתאימה מעבר לניתוח המאתגר של תרכובות מודל ידי קיטוע רדיקלי מבוסס אלקטרונים 11. פיתחנו לאחרונה אסטרטגיית פרוטאומיקה רובה אחד-מימד רומן (LERLIC-MS / MS) 3 המאפשרת הפרדה של isoforms deamidation GLN ו ASN מ דגימות ביולוגיות מורכבות תרכובות המודל בניתוח יחיד. LERLIC-MS / MS מבוסס על הפרדת פפטידים מתעכל tryptic באמצעות אורך-ארוך (50 ס"מ) טור חילוף יונים (LAX) עובד על כרומטוגרפיה אינטראקציה ודחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית (ERLIC) מצב מצמידים ספקטרומטריית מסה טנדם (LC- MS / MS). אסטרטגיה אנליטית חדשה זו שימשה לאפיין יחסית לכמת את מידת כל שאריות deamidated ברקמות המוח האנושיf "> 3. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן יספק הדמיה וידאו של LERLIC-MS / MS נסיון לבדוק את הייחוד של חלבון deamidation בהקשר ביוכימיים של עניין.
אמירה אתית
כל הנהלים של פרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של האוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג בסינגפור בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אריזה-אניוני לטווח האורך (LAX) טור נימים
(הערה: למרות טור LAX יכול להיות בתוך הבית הארוז כפי שאנו מתארים בפרוטוקול זה, עמודות LAX זמינות גם מסחרי, ראה טבלה של חומרים ריאגנטים לפרטים נוספים).
- להשעות 50 מ"ג של חומר אריזת אניוני חלש 3.5 מיליליטר של אריזת חיץ (לוח 1) כדי להכין את התרחיף.
- להרכיב סוף טור הנימים (אורך 50 סנטימטרים - 200 מיקרומטר צינורות פנימי בקוטר (ID)) באמצעות נקבה אל נקבה הולמת, A מַקֵל ו אגוז נשי. מניח גודל נקבובי מסך 1/16" OD של 1 מיקרון בתוך ראוי נקבה אל נקבה (הערה:. המסך משמש כאן חייב להיות גודל נקבובי קטן יותר מגודל החלקיקים של חומר האריזה כדי למנוע דליפה של החומר מן טור).
- ארוז את הנימים עם התרחיף באמצעות משאבת לחץ המופעל על 4500 psi. (הערה: ארוז את coluMN עד חומרי האריזה גלוי על כניסתם של הטור).
- הרכב את הקצה השני של טור הנימים כמתואר נקודת 1.2.
לדוגמא כנה 2.
פרוטוקול זה מתאר את היישום של LERLIC-MS / MS לנתח רקמות מוח אנושיות כפי proteome מודל. (הערה: במקרה להשתמש ברקמות אחרות או דגימות proteomic, הליכי הכנת המדגם צריך להיות מותאם.)
- הומוגניזציה רקמות:
א. רקמות המוח Wash (50 עד 100 מ"ג) עם פתרון חיץ פוספט 1x במשך חמש דקות שלוש פעמים.
ב. Homogenize רקם בבית 1: 1: 2.5 רקמה / חרוזים מתכתיים / חיץ הומוגניזציה SDC (לוח 2) יחס (w / w / v) עבור 5 דקות ב 4 ° C ב צינורות בטוח נעילה בעצימות מקסימלית באמצעות homogenizer רקמות. (הערה: חיץ הומוגניזציה SDC עשוי לכלול מעכבי פרוטאז כפי שצוין בעבר ב 3)
ג. צנטריפוגה homogenate רקמות, שהושג הלוך ושובמ 'בשלב הקודם, ב g 10,000 ×, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאסוף את supernatant לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש.
ד. חזור על שלבים לפנה"ס עבור הכדורים הנותרים ולשלב את supernatants כמספר פעמים דרושות עד אין גלולה הוא ציין. (הערה: אם אתה צריך לחזור על השלבים לפנה"ס יותר מפעמים, להעביר את המדגם ואת החרוזים כדי צינור בטוח נעילה חדש כדי למנוע האובדן של מדגם במהלך שלב צנטריפוגה).
e. לכמת את ריכוז החלבון של homogenates מתקבל על ידי Bicinchoninic חומצה assay (BCA) 12. - Deoxycholate נתרן (SDC) -assisted ב-פתרון העיכול tryptic 13 של homogenates המוח.
א. הוספת הריכוז הסופי של 10 מ"מ dithiothreitol (DTT) (באמצעות פתרון המניות המצוין פתרון 5 לוח 3) אל homogenate שהושג ליזום הפחתת חוב דיסולפיד חלבון.
ב. דגירת homogenate במהלך 30 דקות באמבטשנקבעו מראש על 60 מעלות צלזיוס.
ג. הוסף את homogenate ריכוז סופי של 20 מ"מ iodoacetamide (רש"ת) באמצעות פתרון המניות המצוין פתרון 7 לוח 4.
ד. דגירה homogenate המכיל רש"ת בטמפרטורת החדר בחושך במשך 45 דקות.
e. לדלל את homogenate המוח שני קפלים באמצעות חיץ דילול (פתרון 6 לוח 3).
ו. דגירה המדגם עבור צעד הפחתה שנייה במהלך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
ז. להוסיף טריפסין רצף שונה כיתה מומס פתרון 2 של טבלה 2 ב 01:50 יחס חלבון-אל-אנזים (w / w).
ח. לעכל את homogenate עם טריפסין ידי הדגירה לילה בשעה 30 ° C.
אני. להרוות את עיכול אנזימטי ביום הבא על ידי הוספת ריכוז 0.5% סופיים של חומצה פורמית (FA). (הערה: תוספת של FA תגרום משקעים של מלחים SDC בתנאים חומציים.)
j. בעדינות מערבולת הדגימות המכילות SDC precipiטאטעס.
k. גלול את מלחי SDC ידי צנטריפוגה הדגימות ב g 12,000 ×, 4 מעלות צלזיוס במהלך 10 דקות.
l. איסוף supernatant ולהעביר את הנוזל לצינור חדש ונקי. (הערה: ישמור במהלך בפיפטה של צעד זה לא מחדש להשעות ו / או לאסוף מלחים מן גלולת SDC.)
M. Re-לפזר את גלולת SDC ב SDC-מחדש המסת חיץ (לוח 5) תחת vortexing הנמרצת במשך 1 דקות.
n. חזור על שלבים JL פעמיים כדי לשחזר פפטידים זירז ולשלב את supernatants. (הערה:. ראה סר ואחות 2016 13 לפרטים נוספים על SDC-סייע-פתרון פרוטוקול עיכול tryptic מותאם כאן.) - Desalting של tryptic מתעכל דגימות.
א. בצע desalting של דגימות מתעכלות באמצעות מחסנית 1G C-18. (הערה: השימוש במחסנית נפח גדול (5 מ"ל) ללא תלות בשיעור של ערבויות חלבון המתקבל ניקיון נאותה של מלחים SDC שנותרו דגימות קודמותכדי הזרקת LC-MS / MS.)
ב. בצע מיזוג של מחסנית C-18 1G עם 5 מ"ל של אצטוניטריל (ACN).
ג. Pass 5 מ"ל של חיץ הניקיון (לוח 6) על ידי מחסנית 1G C-18 מותנה כדי להסיר כל ממיס אורגני הנותרים.
ד. טען את המדגם כדי מחסנית C-18 1G.
e. בצעו 3 - 5 צעדים נקי-עד המדגם בעמודה 1G C-18 באמצעות 5 מ"ל של חיץ לנקות כל שלב.
ו. Elute את פפטידים desalted ממחסנית 1G C-18 באמצעות 5 מ"ל של חיץ elution (לוח 7).
ז. יבש את פפטידים eluted בתוך רכז ואקום.
ג. לשקם המדגם המיובש בנפח סופי של 200 μL של חיץ elution. (הערה:. השתמש נמרץ וארוך (> 10 דקות) vortexing ואחריו sonication עוקבות באמבט sonication במהלך 30 דקות מחדש להשעות את פפטידים יבשים לחלוטין חיץ הזרקה)
ד. התאם את עוצמת הזריקה של המדגם עבור LERLIC-MS / MS כדי analyze בין 1 עד 3 מיקרוגרם של חלבון.
3. אחת-מימד LERLIC-MS / MS ההפרדה
- תנאי כרומטוגרפיה נוזליים:
שלבים ניידים:
A: 0.1% FA במים (לוח 8).
B: 0.1% FA ב ACN (לוח 9)
קצב זרימה: 0.4 μL / דקה
טור: טור נימי LAX (אורך 50 ס"מ - 200 מיקרומטר ID)
א. השתמש 1200 min-השיפוע הבא: B 95% עבור 40 דקות, 95 - 85% B עבור 434 דק ', 85 - 70% B עבור 522 דק', 70 - 35% B עבור 124 דק ', 35 - 3% B עבור 45 דק' isocratic, בבית B 3% עבור 5 דקות, 3 - 95% ב מעל 7 דקות והמשיך isocratic ב 95% B עבור 23 דקות.
ב. בצעו הפרדת פפטידים באמצעות נימי LAX כמצוין סרה & Gallart-פלאו ואח. 3 באמצעות לחץ גבוה במיוחד כרומטוגרפיה נוזלית. - תצורת ספקטרומטר מסה:
א. הגדר את פרטי האירוע סריקה לבצע betwe לסירוגין רכישת נתוניםen מלא התמרה-ספקטרומטריית מסה (FT-MS) ו התמרתי-טנדם ספקטרומטריית מסה (FT-MS / MS) עם הפרמטרים הבאים:
א .1. מצב רכישת נתונים: חיובים
א .2 פרמטרים FT-MS:
טווח המוני: 350 - 2000 מ '/ z
רזולוציה: 60,000
Microscans: 1 לכל ספקטרום
שליטה אוטומטית: 1 × 10 6
א .3 FT-MS / MS פרמטרים:
מצב הפיצול: ניתוק collisional High-אנרגיה (HCD)
טווח המוני א .4: 150 - 2000 מ '/ z
החלטת A.5: 30,000
יונים למעלה N א .6: 10
Microscans: 1 לכל ספקטרום
המדינה אחראית:> 2+
בידוד רוחב: 2 Da
בקרה אוטומטית רווח A.7: 1 × 10 6
ב. בצע איתור ספקטרומטריית מסה של פפטידים כמצוין 3 באמצעות ספקטרומטר מסה orbitrap מצויד מקור יון nanoelectrospray לעבוד 1.5 קילו וולט.
ניתוח 4. נתונים
- בצעו והגנה של המחזורבחיפוש מסד נתוני LERLIC-MS / MS שהושג באמצעות הפרמטרים הבאים באמצעות תוכנת proteomic ספציפית: (הערה: ראה 3 לפרטים נוספים.)
א. יון סובלנות: 10 עמודים לדקה
ב. סובלנות יון קטע: 0.05 Da
ג. שיעור התגליות השגויות (FDR): 1%
ד. מסד נתונים: מסד נתונים אנוש UniProt
e. שינויים קבועים: Carbamydomethylation ב Cys
ו. שינויים משתנים (אם נדרש על ידי התוכנה): חמצון (Met), Deamidation (ASN ו GLN). - אפיון וכימות בטוחים המוצרים deamidated isomeric בנתונים LERLIC-MS / MS:
א. תוצאות חיפוש בבסיס הנתונים ייצוא מ LERLIC-MS / MS כדי תוכנת spreedsheet לניתוח.
ב. מצא ולחלץ את כל רשימת פפטידים deamidated ואת עמיתיהם הלא deamidated.
ג. שימוש ברשימת פפטידים שהתקבלו כהפניה, לחלץ את chromatograms יונים (XICs) של פפטידים אלה באמצעות תוכנת appropiate ב 5 עמודים לדקה של סובלנות המונית. (הערה:ראה 3 לפרטים נוספים על התוכנה המשמשת להפקת XICs.)
ד. ראייה לבדוק את XICs שהושג לזהות את elution פעמיים שיא מופרדים מהמוצרים isomeric כמצוין 3. (הערה: מוצרי isomeric של פפטידים אלו זיהו ברמת MS / MS להיות יכולים למצוא מודרך בקלות על ידי הנוכחות של שתי פעמי שמירה שונות לתוצאות החיפוש בבסיס נתונים.)
e. כימות יחסיות של מוצרי isomeric מכל אתר / פפטיד deamidated צריכה להתבצע על בסיס אזור השיא של כל איזומר שזוהה XICs שהושג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deamidation של שאריות GLN ו ASN נחשב שינוי חלבון ניוונית (DPM) מעורב בכמה מחלות כרוניות קטלנית 14. הוכח כי PTM זה יכול לחזות את המדינות חצי-חי degradative של נוגדנים ומולקולות אחרות בגוף האדם ורקעים ביולוגיים דומים 1, 15. המשמעות של חלבון deamidation, למעשה, מעבר להקשר ביו, ומכאן שינוי זה קיים proteomes מגוונת 16, 17 ועוד כמה מחקרים הוכיחו את הפוטנציאל של deamidation בזמנו לבצע לתיארוך מדויק של ציורים ארכיאולוגיים נשאר 18, 19 . למרות משמעות ופונקציונליות של deamidation חלבון מרקעים שונים ואושרו עבור זמן רב,מחדש היה עד לא מזמן מאוד חוסר ההתקדמות הטכנית על הדרך להשיג אפיון מעמיק של PTM 3 זה.
יישום של LERLIC-MS / MS 3, כמתואר באיור 1, מספק לראשונה וב פרדה חד בטווח נפתרה של GLN ו ASN deamidated isoforms מן proteomes או מודל מורכב תרכובות אפילו עבור אלה פפטידים מראים שני ASN העצמאי GLN deamidated proteoforms.
איור 1: תרשים של LERLIC-MS / MS Workflow עבור ההפרדה וכימות של GLN ו- ASP Deamidation מוצרים מן דגימות מורכבות ידי Shotgun פרוטאומיקה. LERLIC-MS / MS כרוך מיצוי חלבון עיכול אנזימטי לפני ההפרדה החד-מימד של פפטידים על ידי LC-MS / MS באמצעות טור נימי LAX. אנהתמס של XICs לאפשר זיהוי של מוצרי isomeric deamidation eluted בזמני שימור שונים המבוסס על החומציות 3 השונה שלהם, 20, 21. MS / MS מאפשר אפליה בין פפטידים deamidated ולא deamidated והזדהות בטוחה של שאריות deamidated. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
שאריות GLN ביניים שונה enzymatically של transamidation מוצגות יחס הפוך γ / α-glutamyl (איור 2) ניתן חשפו ומאופיינת LERLIC-MS / MS, אשר עשויות להיות לכך השלכות משמעותיות על מחקר של proteinopathy במחלות ניווניות 3, 22, 23 , 24. יתר על כן, כפי שדווח בעבר סר & Gallart-פלאו 2016, מספר חלבוני מצע PIMT הידוע המציגים יחס isoAsp הפוך / ASP ב שאריות ASN deamidated יכולים גם להיות מזוהים ברקמות אנושיות ידי LERLIC-MS / MS 3.
איור 2: הפיקוח של XICs וזיהוי זוגי Retention טיימס ברמת MS / MS עבור פפטידים Deamidated אפשר אפיון GLN ו ASN Deamidated איזומרים וזיהוי של מוצרים מן תגובות אנזימטיות חיוני המתרחשים Deamidation. א. פירוט של XIC מראה את שתי הפסגות מתאימות איזומרים-glutamyl α γ / של GTK # פפטיד FQMPDQGMTSADDFFEQ מן החלבון במוח DPYL2 dihydropyrimidinase-חלבון קשור 2. detecte היחס ההפוכים γ / α-glutamylד ב פפטיד המציין את המשמעות הפוטנציאלית של מצלצלי γ-glutamyl המכיל את תגובת transglutamination בתור transglutaminase γ-glutamyl ביניים. שאריות deamidated אומתו על ידי MS / MS בשתי פעמי השמירה, ב. ב 389.1 דקות המתאים פפטיד glutamyl המכילים-α ו- C. ב 401.4 דקות המתאים פפטיד glutamyl המכילים-γ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
כחידוש של מאמר זה, מצאנו כי LERLIC-MS / MS מאפשרת אפיון (איור 3) succinimide ביניים. שימוש pH חומצי המתון במהלך עיבוד מדגם מייצב את succinimide ביניים שונים ASN שאריות 25. לכן, LERLIC-MS / MS מאפשר מחקר רחב-proteome של succiniMide ביניים, שינוי רָפִיף מחד ומובן עם השלכות פיסיולוגיות ופתולוגיים משמעותיים 26.
איור 3: זיהוי ביניים Succinimide בשאריות ASN ידי LERLIC-MS / MS. א. ספקטרום של ASN deamidated פפטיד YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR מן פרוקטוז-bisphosphate C ALDO חלבון במוח aldolase שאריות ג Deamidated מצוין כמו Deam-ASN. ב. ספקטרום של הפפטיד YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, אשר במקרה זה מראה תזוזה המונית של -17 Da בבית בעבר deamidated שאריות ASN (SCC-ASN) בשל אובדן אמוניום המתרחשים במהלך היווצרות של ביניים succinimide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של ההוא דמות.
| רְכִיב | הסכום עבור 100 מ"ל |
| איזופרופיל | 90 מ"ל |
| מַיִם | 10 מ"ל |
רכב חוצץ אריזה בטבלה 1. (isopropanol 90%).
| פתרון 1: 1 M של אמוניום אצטט. | |
| רְכִיב | הסכום עבור 50 מ"ל |
| אמוניום אצטט | 3.86 גרם |
| מים (לעשות עד 50 מ"ל) | ~ 50 מ"ל |
| פתרון 2: 100 מ"מ של אמוניום אצטט. | |
| רְכִיב | הסכום עבור 50 מ"ל |
| פתרון 1 | 5 מ"ל |
| מַיִם | 45 מ"ל |
| פתרון 3: deoxycholate נתרן 10%. | |
| רְכִיב | הסכום עבור 1 מ"ל |
| deoxycholate נתרן | 0.1 גרם |
| מַיִם | 1 מ"ל |
| פתרון 4: חיץ הומוגניזציה SDC (100 אמוניום אצטט מ"מ המכיל deoxycholate נתרן 1%). | |
| רְכִיב | הסכום עבור 10 מ"ל |
| פתרון 2 | 9 מ"ל |
| פתרון 3 | 1 מ"ל |
טבלה 2. SDC המגון חוצץ הרכב (100 מ"מ אמוניום אצטט המכיל 1% נתרן Deoxycholate). הכן את solu המניות tion של 1 M של אמוניום אצטט (פתרון 1) ו לדלל כדי לקבל 100 מ"מ של אמוניום אצטט (פתרון 2). בנוסף, להכין את פתרון המניות של deoxycholate נתרן 10% (פתרון 3). הכן את החיץ הומוגניזציה SDC כמתואר פתרון 4.
| פתרון 5: 1 M DTT | |
| רְכִיב | הסכום עבור 10 מ"ל |
| dithiothreitol | 77 מ"ג |
| פתרון 2 (ראה טבלה 2) | 0.5 מ"ל |
| פתרון 6: חיץ דילול | |
| רְכִיב | הסכום עבור 10 מ"ל |
| פתרון 5 | 0.1 מ"ל |
| פתרון 2 (ראה טבלה 2) | 9.9 מ"ל |
התחת = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> לוח 3. הרכב חוצץ דילול (100 מ"מ אמוניום אצטט המכיל 10 מ"מ Dithiothreitol (DTT)). כן פתרון המניות של 1 M DTT (פתרון 5) ובהמשך להכין את חיץ הדילול כמפורט פתרון 6.
| פתרון 7: 1 M רש"ת | |
| רְכִיב | הסכום עבור 10 מ"ל |
| רש"ת | 93 מ"ג |
| פתרון 2 (ראה טבלה 2) | 0.5 מ"ל |
טבלה 4. הרכב אלקילציה חוצץ (100 מ"מ אמוניום אצטט המכיל 20 מ"מ iodoacetamide (רש"ת)). כן פתרון המניות של 1 M רש"ת (פתרון 7).
| רְכִיב | הסכום עבור 50 מ"ל |
| אמוניום הידרוקסיד | 0.25 מ"ל |
| מַיִם | 24.75 מ"ל |
טבלה 5. הרכב חוצץ SDC Redissolving (0.5% אמוניום הידרוקסיד).
| רְכִיב | הסכום עבור 100 מ"ל |
| חומצת trifluoroacetic | 0.1 מ"ל |
| מַיִם | 99.9 מ"ל |
לוח 6. נקי-עד חוצץ (0.1% trifluoroacetic חומצה).
| רְכִיב | הסכום עבור 100 מ"ל |
| acetonitrile | 75 מ"ל |
| חומצה פורמית | 0.1 מ"ל |
לוח 7: הצפת elution (75% אצטוניטריל, 0.1% חומצה פורמית).
| רְכִיב | הסכום עבור 1000 מ"ל |
| חומצה פורמית | 1 מ"ל |
| מַיִם | 999 מ"ל |
טבלה 8. שלב נייד קומפוזיציה.
| רְכִיב | הסכום עבור 1000 מ"ל |
| חומצה פורמית | <td> 1 מ"ל|
| acetonitrile | 999 מ"ל |
לוח 9: נייד שלב רכב B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In-מאמר בסרטון הזה אנחנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של LERLIC-MS / MS 3, שיטה לבצע אפיון מעמיק כדי לקבוע את המידה במדויק deamidation חלבון לבין תהליכים אנזימטיים מעורבים על שינוי חלבון זה. LERLIC-MS / MS מבוסס על השימוש באורך-ארוך (50 ס"מ) LAX תחת העיקרון של כרומטוגרפיה אינטראקציה-הידרופיליות דחייה אלקטרוסטטית (ERLIC) 27. שימוש טור ארוך באורך, כפי שמוצג במחקר שלנו 3, ממקסמת את הפוטנציאל של ERLIC כדי פפטידים נפרדים על פי נקודת איזואלקטרית שלהם 27.
LERLIC-MS / MS מייצג אסטרטגיה הפרדה חד ממדי רובה הרומן, זרימת עבודה זה חוסך זמן-על-הידיים במהלך עיבוד מדגם למרות שזה דורש שיפוע 1200 דקות כמצוין 3 כדי להשיג תוצאות אופטימליות על proteomes מורכב מאוד. של 60 דק 'gradient ב LERLIC-MS / MS יכול גם להשיג הפרדה אופטימלית של isoforms GLN deamidation על תרכובות המודל בפעם הראשונה פרוטאומיקה רובה 3. בהתבסס על שני יישומים אלה, אנו משערים כי הפרדת ממד שנייה מבוצעת על ידי נימי LAX יכולה להיות מצמידה את כרומטוגרפיה ממד הפוך שלב ראשון תחת גישת כרומטוגרפיה רבה מימדית לניתוח דגימות מורכבות באמצע, זרימת עבודה בשימוש קודם לכן על ידי הקבוצה שלנו 10.
לדוגמא כהכנה לניתוח חלבון deamidation היא צעד חיוני הדורש תשומת לב קפדנית כדי למנוע את התרחשותם של deamidation artefactual על שאריות ASN בבית במידה רבה 1. האו ואח. נמצא כי העיכול tryptic תחת pH חומצי עדין מונע הופעה משמעותית של deamidation artefactual במהלך הכנת המדגם 28. השתמשנו במחקר זה SDC בסיוע שלנו לנסות פתרוןעיכול ptic 13, שיטה שבה עיבוד מדגם מתבצע ב- pH 6. מצד השני, בתנאים חומציים חזקים עלולים לערער את יכולת העיכול של טריפסין כאשר pH נשמר נמוך מ 6 29. להתייחס לנושא זה, מאוד לאחרונה ואח ליו. דיווח אסטרטגיה לעיכול אופטימלית המאפשרת עיכול ומניעה מוצלחים של התרחשות deamidation artefactual על שאריות ASN ידי החלפת טריפסין ידי Glu-C ב- pH 4.5 30. יישום שיטת העיכול דיווחה על ידי Liu et al. 30 לנתח ASN deamidation ידי LERLIC-MS / MS יכול להיות אסטרטגיה פוטנציאל הדורשת אימות ניסיון.
הפרוטוקול המתואר מאמר וידאו זה יש פוטנציאל גדול כדי להמשיך לאפיין ו לכמת מערכי יחס איזופורם ידועים כרגע המגדירים את מעורבותו של החלבון deamidation ב הזדקנות ומחלות אדם. פרווהthermore, יישום של LERLIC-MS / MS ב רקע ביולוגי אחר יעזור לקבוע את הפוטנציאל וסיכונים של החלבון deamidation כשינוי שעון מולקולרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו באופן חלקי בסיוע מענקים ממשרד סינגפור החינוך (Tier 2: גרנט ARC9 / 15), לאומי המועצה למחקר רפואי של סינגפור (NMRC-OF-IRG-0003-2016), ו NTU-NHG הזדקנות מחקר גרנט ( גרנט ARG / 14,017). ברצוננו להביע את תודתנו ותודה הכנה ביותר ד"ר אנדרו אלפרט וצוות PolyLC עבור ספק לנו בחביבות עם חומרי האריזה מתאפשרים במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
