LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике

Summary

Здесь мы приводим протокол шага за шагом в длинномерной электростатическом отталкивание-гидрофильно-хроматографии тандемной масс-спектрометрии метода (LERLIC-МС / МС). Это роман методология, которая позволяет в первый раз и количественного определения характеристик глутамина и аспарагина деамидирования изоформ с помощью дробовика протеомики.

Abstract

Характеристика белок дезамидирования важно расшифровать роль (ы) и потенциальные возможности этого белка посттрансляционной модификации (PTM) в патологии человека и других биохимических контекстах. Для того чтобы выполнить характеристику белка дезамидировании, недавно мы разработали новый длинномерных электростатическое отталкивание-гидрофильное взаимодействия хромато-тандемной масс-спектрометрии (LERLIC-МС / МС) метод, который может отделить глутамина (Gln) и аспарагин (Asn) изоформы продукты дезамидирования от модельных соединений до чрезвычайно сложных биологических образцов. LERLIC-МС / МС, таким образом, первая стратегия дробовика протеомики для разделения и количественного определения Gln деамидирования изоформ. Мы также продемонстрировать, как новизна, что протокол обработки образцов описанный здесь стабилизирует сукцинимид промежуточное позволяет его характеристику с помощью LERLIC-MS / MS. Применение LERLIC-MS / MS, как показано в этом видео статьи может помочь пролить свет в настоящее время неизвестногоп молекулярных массивы белка дезамидирования. Кроме того, LERLIC-МС / МС обеспечивает дальнейшее понимание ферментативных реакций, которые включают дезамидирование в различных биологических фонах.

Introduction

Дезамидирование представляет собой модификацию белков посттрансляционная (ПТМ) , который вводит отрицательный заряд белка позвоночника за счет модификации аспарагина (Asn) и / или глутамин (GLN) остатков ^1. Эта модификация в то время как остатки Asn влияющие генерирует изомерные продукты isoaspartic кислоты (isoAsp) и п -aspartic кислоты (Asp) в общем соотношении 3: 1 ^2. Тем не менее, это отношение может быть изменено путем вмешательства фермента ремонта L-isoaspartyl метилтрансферазы (PIMT) ^{3, 4.} Точно так же, деамидирование Gln остатков генерирует изо....

Protocol

1. Упаковка длинномерных анионообменной (LAX) Капиллярная колонка

(Примечание: Хотя LAX колонка может быть в доме упакован , как мы описываем в этом протоколе, LAX столбцы также коммерчески доступны, см таблицы материалов и реагентов для получения более подробной информации).

1. Приостановка 50 мг слабой анионообменной упаковочного материала в 3,5 мл буфера упаковки (таблица 1) для приготовления суспензии.
2. Собрать конец капиллярной колонки (длина 50 см - 200 мкм внутреннего диаметра (ID) трубка) с использованием женских к женщине фитинга, а ферулы и охватывающую гайки. Поместите....

Results

Дезамидирование из Gln и Asn остатков считаются дегенеративной модификацией белков (ПСБ) участвует в нескольких хронических и смертельных заболеваниях ^14. Было показано , что этот ПТМ может предсказать полураспада и дегенеративных состояний антител и других молекул в организме человека и других подобных биологических фонов ^{1, 15.} Значение белка дезамидирования, на самом деле, выходит за рамками биомедицинс.......

Discussion

В этом видео-статье мы приводим протокол шага за шагом LERLIC-MS / MS ^3, способ для выполнения углубленной характеристики и точно определить степень белка дезамидирования и ферментативных процессы , участвующих в этой модификации белка. LERLIC-МС / МС основан на использовании длинной длины (50 см) LAX по принципу электростатического взаимодействия хроматографии отталкивания-гидрофильной (ERLIC) ^27. Использование колонны длинномерной, как показано в нашем исследовании

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 и микро; m 100-Å (сыпучие материалы)	PolyLC Inc.	Специальный заказ
Ионообменный капиллярный столб большой длины 50 см - 200 мкм; m ID	PolyLC Inc.	специальному заказу
1/16" OD x 200 & микро; m ID x 50 см длина	SGE Analytical Science под руководством Trajan Scientific Australia	620050
Фитинг с внутренней резьбой для трубки с наружным диаметром 1/16"	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Внутренняя гайка для микроферулы	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Бомба под давлением NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC система	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Safe-lock tubes	Eppendorf	T9661-1000EA
Бусины из нержавеющей стали. 0,9 – 2,0 мм. 1 фунт. Нестерильный.	Next Advance	SSB14B
Настольная центрифуга	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Стандартная цифровая циркуляционная ванна с подогревом, 120 В переменного тока	PolyScience 8006 6 л	8006A11B
Sep-pack c18 картридж для обессоливания 50 мг	воды	WAT020805
концентратор Vacumm	Eppendorf	Концентратор Плюс Система
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite масс-спектрометр	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Михром-Брукер Инк.	Инкубатор TCSI-SS2
INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
Секвенирование модифицированного трипсина	Promega	V5111
Коктейль ингибиторов протеазы	Roche	11836170001 (ROCHE)
Фосфатный буферный раствор 10x (разбавленный до 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Ацетат аммония	Sigma-Aldrich	A1542
Дезоксихолат натрия	Sigma-Aldrich	D6750
Дитиотреитол	Sigma-Aldrich	D0632
Йодоацетамид	Sigma-Aldrich	i6125
Муравьиная кислота	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Гидроксид аммония	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Ацетонитрил ВЭЖХ марки	Sigma-Aldrich	675415
Изопропанол ВЭЖХ марки	Sigma-Aldrich	675431
воды ВЭЖХ марки	Sigma-Aldrich	14263