Summary
Здесь мы приводим протокол шага за шагом в длинномерной электростатическом отталкивание-гидрофильно-хроматографии тандемной масс-спектрометрии метода (LERLIC-МС / МС). Это роман методология, которая позволяет в первый раз и количественного определения характеристик глутамина и аспарагина деамидирования изоформ с помощью дробовика протеомики.
Abstract
Характеристика белок дезамидирования важно расшифровать роль (ы) и потенциальные возможности этого белка посттрансляционной модификации (PTM) в патологии человека и других биохимических контекстах. Для того чтобы выполнить характеристику белка дезамидировании, недавно мы разработали новый длинномерных электростатическое отталкивание-гидрофильное взаимодействия хромато-тандемной масс-спектрометрии (LERLIC-МС / МС) метод, который может отделить глутамина (Gln) и аспарагин (Asn) изоформы продукты дезамидирования от модельных соединений до чрезвычайно сложных биологических образцов. LERLIC-МС / МС, таким образом, первая стратегия дробовика протеомики для разделения и количественного определения Gln деамидирования изоформ. Мы также продемонстрировать, как новизна, что протокол обработки образцов описанный здесь стабилизирует сукцинимид промежуточное позволяет его характеристику с помощью LERLIC-MS / MS. Применение LERLIC-MS / MS, как показано в этом видео статьи может помочь пролить свет в настоящее время неизвестногоп молекулярных массивы белка дезамидирования. Кроме того, LERLIC-МС / МС обеспечивает дальнейшее понимание ферментативных реакций, которые включают дезамидирование в различных биологических фонах.
Introduction
Дезамидирование представляет собой модификацию белков посттрансляционная (ПТМ) , который вводит отрицательный заряд белка позвоночника за счет модификации аспарагина (Asn) и / или глутамин (GLN) остатков 1. Эта модификация в то время как остатки Asn влияющие генерирует изомерные продукты isoaspartic кислоты (isoAsp) и п -aspartic кислоты (Asp) в общем соотношении 3: 1 2. Тем не менее, это отношение может быть изменено путем вмешательства фермента ремонта L-isoaspartyl метилтрансферазы (PIMT) 3, 4. Точно так же, деамидирование Gln остатков генерирует изомерные гамма-глутаминовой кислоты (γ-Glu) и изоформы альфа-глутаминовой кислоты (α-Glu) в ожидаемом соотношении 1: 3, 5 7, но это соотношение может быть смещена под действием вездесущий фермент трансглютаминаза 2 и другие трансглутаминазы, в том числе трансглутаминаза 1, электронныеnzyme недавно идентифицирован как связанный с внеклеточной везикул в мозге 6.
Происхождение дезамидировании может быть либо спонтанным или ферментативным, бывшее особенно распространен на Gln остатках , в которых трансглутаминаза и другие ферменты опосредуют меж / внутрисистемное молекулярное сшивание с помощью переамидирования (см 3 для более подробной информации о Gln переамидировании и его последствия в некоторых хронических и смертельные заболевания человека). Таким образом, деамидирование является ПТМ , что имеет решающее резонанс на структуру и функции пораженных молекул 4, 7, 8 и требует углубленного химических характеристик 3 в свете его различных биохимических последствий , включая его службы в качестве молекулярных часов старения 9 ,
Несмотря на то, деамидирование Asn остатков было относительно хорошо характеризуются снизу вверх дробовика протеомики 1, 10, деамидирование Gln остатков до сих пор не имеет подходящий метод характеризации за пределы сложного анализа модельных соединений с помощью электронно-радикальной фрагментации на основе 11. Недавно мы разработали новый один размер дробовика протеомики стратегию (LERLIC-МС / МС) 3 , что делает возможным разделение Gln и Asn деамидирования изоформ из сложных биологических образцов и модельных соединений в одном анализе. LERLIC-МС / МС основан на разделении триптических пептидов переваривали с использованием длинномерных (50 см) ионообменная колонка (LAX) работает в режиме электростатического отталкивания-гидрофильное взаимодействие хроматографии (ERLIC), и в сочетании с тандемной масс-спектрометрии (АЯ МС / МС). Эта новая аналитическая стратегия была использована для характеристики и относительно количественной оценки степени каждого дезамидированного остатка в тканях мозга человекае "> 3. Тем не менее, протокол описанный здесь будет предоставлять видео съемки LERLIC-MS / MS , направленную на изучение особенностей белков дезамидирования в биохимическом контексте интересов.
ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ
Все процедуры этого протокола были одобрены этическими комитетами в Наньянском технологическом университете в Сингапуре и были выполнены в соответствии с институциональными рекомендациями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Упаковка длинномерных анионообменной (LAX) Капиллярная колонка
(Примечание: Хотя LAX колонка может быть в доме упакован , как мы описываем в этом протоколе, LAX столбцы также коммерчески доступны, см таблицы материалов и реагентов для получения более подробной информации).
- Приостановка 50 мг слабой анионообменной упаковочного материала в 3,5 мл буфера упаковки (таблица 1) для приготовления суспензии.
- Собрать конец капиллярной колонки (длина 50 см - 200 мкм внутреннего диаметра (ID) трубка) с использованием женских к женщине фитинга, а ферулы и охватывающую гайки. Поместите экран 1/16" OD 1 мкм размер пор внутри фитинга женской на женский (Примечание:. Экран, используемый здесь, должен иметь меньший размер пор, чем размер частиц упаковочного материала, чтобы предотвратить утечку материала из колонка).
- Пакет капилляр с суспензией с помощью нагнетательного насоса, работающего при 4500 фунтов на квадратный дюйм. (Примечание: Упаковать coluмлн до упаковочного материала видны на входе колонки).
- Собрать другой конец капиллярной колонки, как описано в пункте 1.2.
2. Подготовка проб
Этот протокол описывает применение LERLIC-MS / MS для анализа тканей головного мозга человека в качестве модели протеома. (Примечание: В случае использования других тканей или протеомические образцов, процедуры подготовки образца должны быть адаптированы.)
- Ткань гомогенизация:
а. Wash ткань мозга (от 50 до 100 мг) с 1x фосфатного буферным раствором в течение пяти минут трижды.
б. Однородные ткани в соотношении 1: 1: 2,5 ткани / металлические шарики / SDC буфер для гомогенизации (2 Таблицы) Соотношение (вес / вес / объем) в течение 5 мин при 4 ° С в безопасных блокировках трубок при максимальной интенсивности с помощью гомогенизатора тканей. (Примечание: SDC гомогенизация буфер может включать в себя ингибиторы протеазы , как указано ранее в пункте 3)
с. Центрифуга гомогената ткани, полученной сюдам на предыдущем шаге, при 10000 х г, 4 ° С в течение 10 мин и собирают супернатант в новую пробирку на 1,5 мл.
д. Повторите шаги Bc для оставшихся гранул и объединить супернатанты столько раз , сколько необходимо , пока не наблюдается осадок. (Примечание: Если вы должны повторить шаги Ьса более чем в два раза, перемещение образца и бусинки к новой безопасной блокировке трубки для предотвращения потери образца во время стадии центрифугирования).
е. Количественно концентрации белка в гомогенатах полученных с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) 12. - Дезоксихолат натрия (SDC) -поддерживаемая в растворе-триптического пищеварение 13 гомогенатах мозга.
а. Добавление конечной концентрации 10 мМ дитиотреитолы (DTT) ( с использованием исходного раствора , указанный в растворе 5 таблицы 3) к полученному гомогенато , чтобы инициировать снижение дисульфидных связей белка.
б. Инкубируйте гомогената в течение 30 мин в ваннепредварительно установлена на уровне 60 ° C.
с. Добавить в гомогенате конечной концентрации 20 мМ иодацетамида (IAA) с использованием исходного раствора , указанного в растворе 7 таблицы 4.
д. Инкубируйте гомогената, содержащего IAA при комнатной температуре в темноте в течение 45 мин.
е. Развести гомогената мозга две складки с использованием буфера для разведения (раствор 6 таблицы 3).
е. Инкубируйте образец для второй стадии восстановления в течение 30 мин при 37 ° С.
г. Добавить секвенирование класса-модифицированного трипсина , растворенного в растворе 2 таблицы 2 при белок-к-фермента соотношении 1:50 (вес / вес).
час Дайджест гомогената с помощью трипсина путем инкубации в течение ночи при 30 ° С.
я. Гасит ферментативное расщепление на следующий день путем добавления конечной концентрации муравьиной кислоты (FA) 0,5%. (Примечание: Добавление FA будет вызывать осаждение солей SDC в кислых услови х.)
к. Аккуратно вихрь образцы, содержащие SDC precipiTates.
к. Гранулы вниз соли SDC пути центрифугирования образцов при 12000 х г, 4 ° С в течение 10 мин.
л. Собирают супернатант и передавать жидкость в чистую новую пробирку. (Примечание: Будьте осторожны во время пипетки этого шага, чтобы не повторно приостанавливать и / или собирать соли из гранул SDC).
м. Повторно растворить осадок в SDC SDC повторного растворения буфера (таблица 5) при интенсивном вортексе в течение 1 мин.
п. Повторите шаги JL дважды , чтобы восстановить осажденных пептиды и объединить супернатант. (Примечание: См . Серра и др 2016 13 для более подробной информации о SDC-помощь в растворе-протокол трипсина переваривания адаптирована здесь.) - Обессоливание триптические переваривается образцы.
а. Выполните опреснение переваренных образцов с использованием картриджа 1g С-18. (Примечание: Использование большого объема картридж (5 мл), независимо от количества белка, полученной гарантии надлежащей очистки оставшихся солей SDC в образцах передк LC-MS / MS инъекции.)
б. Выполните кондиционирование С-18 картриджа 1 г с 5 мл ацетонитрила (ACN).
с. Pass 5 мл очистки буфера (таблица 6) с помощью условного 1g C-18 картриджа , чтобы удалить любые остатки органического растворителя.
д. Загрузить образец картриджа с 1g C-18.
е. Выполните 3 - 5 очистку шагов для образца в колонке 1g C-18 с использованием 5 мл буфера очистки каждого шаг.
е. Элюируйте обессоленные пептиды из С-18 картриджа 1 г с использованием 5 мл буфера для элюции (Таблица 7).
г. Сушат элюированные пептиды в вакуумном концентраторе.
с. Развести высушенного образца в конечном объеме 200 мкл буфера для элюции. (Примечание:. Используйте энергичный и длинный (> 10 мин) вортексе с последующей обработкой ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 30 минут, чтобы полностью повторно приостанавливать высушенных пептиды в буфере для инъекций)
д. Регулировка объема впрыска образца для LERLIC-MS / MS к анелизировать от 1 до 3 мкг белка.
3. Один аспект LERLIC-МС / МС Разделение
- Жидкие условия хроматографии:
Подвижные фазы:
А: 0,1% ФА в воде (таблица 8).
Б: 0,1% ФА в ACN (Таблица 9)
Скорость потока: 0,4 мкл / мин
Колонка: ЛАКС капиллярная колонка (длина 50 см - 200 мкм ID)
а. Используйте следующий 1200 мин-градиент: 95% B в течение 40 мин, 95 - 85% B в течение 434 мин, 85 - 70% B в течение 522 мин, 70 - 35% B в течение 124 мин, 35 - 3% B в течение 45 мин , изократическая на 3% B в течение 5 мин, 3 - 95% B в течение 7 мин и выдерживают при изократическая 95% в в течение 23 мин.
б. Выполните разделение пептидов с использованием LAX капилляра , как указано в Serra & Gallart-Палау и др. 3 с помощью ультра-жидкостной хроматографии высокого давления. - Масс-спектрометр конфигурации:
а. Настройка сканирования сведений о событиях для выполнения данных переменного сбора betweан полное преобразование Фурье-масс-спектрометрии (FT-MS) и преобразование Фурье-тандемной масс-спектрометрии (ФТ-МС / МС) со следующими параметрами:
A.1. Режим сбора данных: положительный
А.2 параметры FT-MS:
Масс-спектр: 350 - 2000 м / г
Разрешение: 60 000
Microscans: 1 за спектр
Автоматическая регулировка усиления: 1 × 10 6
а.3 параметров FT-MS / MS:
Режим Фрагментация Высокоэнергичные столкновительная диссоциации (HCD)
А.4 Диапазон Масс-спектр: 150 - 2000 м / г
a.5 Разрешение: 30 000
А.6 Топ N ионы: 10
Microscans: 1 за спектр
Поручите состояние:> 2+
Ширина Изоляция: 2 Да
А.7 Автоматическая регулировка усиления: 1 × 10 6
б. Выполните массовое обнаружение спектрометрии пептидов , как указано в пункте 3 с использованием масс - спектрометра Orbitrap , оснащенным источником nanoelectrospray ионов , работающим при 1,5 кВ.
Анализ 4. Данные
- Выполните PROTEв поиске в базе данных к LERLIC-MS / MS получены данные , используя следующие параметры , используя конкретное протеомное программное обеспечение: (Примечание: см 3 для получения более подробной информации.)
а. Ион допуск: 10 частей на миллион
б. Фрагмент толерантности иона: 0,05 Да
с. Ложный Discovery Rate (FDR): 1%
д. База данных: UniProt Человеческая база данных
е. Фиксированные модификации: Carbamydomethylation на Cys
е. Переменные модификации (в случае необходимости с помощью программного обеспечения): Окисление (Мет), Дезамидирование (Asn и Gln). - Уверенная характеристика и количественное определение изомерных деамидированных продуктов в данных LERLIC-МС / МС:
а. Экспорт результатов поиска базы данных из LERLIC-MS / MS в качестве spreedsheet программного обеспечения для анализа.
б. Найти и извлечь весь список деамидированных пептидов и их недезамидированных коллегами.
с. Используя список полученных пептидов в качестве ссылки, извлечь ионные хроматограммы (XICs) этих пептидов с использованием программного обеспечения на наши правила 5 частей на миллион массовых толерантности. (Заметка:См 3 для получения более подробной информации о программном обеспечении , используемом для извлечения XICs.)
д. Визуально проверить полученные XICs идентифицировать отделенный двойной пик элюции изомерных продуктов , как указано 3. (Примечание: изомерные продукты этих пептидов, идентифицированных на уровне MS / MS может быть легко найдено руководствоваться наличием двух различных времен удерживания в результате поиска по базе данных.)
е. Относительное количественное определение изомерных продуктов из каждого дезамидированной сайта / пептид должен быть выполнен на основе площади пика каждого идентифицированного изомера в полученных XICs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дезамидирование из Gln и Asn остатков считаются дегенеративной модификацией белков (ПСБ) участвует в нескольких хронических и смертельных заболеваниях 14. Было показано , что этот ПТМ может предсказать полураспада и дегенеративных состояний антител и других молекул в организме человека и других подобных биологических фонов 1, 15. Значение белка дезамидирования, на самом деле, выходит за рамками биомедицинского контекста, следовательно , эта модификация присутствует в различных протеомах 16, 17 и некоторые исследования продемонстрировали потенциал дезамидирования в то время , чтобы выполнить точную датировку картин и археологические остается 18, 19 , Хотя значение и функциональность белок дезамидирования в разных слоях были подтверждены в течение длительного времени,вновь было до самого последнего времени отсутствия технического прогресса на пути достижения углубленной характеристики этого PTM 3.
Применение LERLIC-MS / MS 3, как показано на фиг.1, предусматривает в первый раз , и в один проход разрешен разделения Gln и Asn деамидирован изоформы из сложных протеомов или модельных соединений даже для тех пептидов , показывающие два независимых Asn и Gln , деамидирован proteoforms.
Рисунок 1: Схема LERLIC-MS / MS Workflow для разделения и количественного Gln и Asp дезамидирования Изделия из сложных образцов дробовика протеомики. LERLIC-МС / МС включает экстракцию белка и ферментативное расщепление до одномерного разделения пептидов с помощью LC-MS / MS с использованием LAX капиллярной колонки. изреченийлизис XICs позволяет идентифицировать деамидирование изомерных продуктов , элюированных в разное время удерживания на основе их различной кислотности 3, 20, 21. МС / МС позволяет дискриминацию между дезамидированными и недезамидированными пептидами и уверенной идентификацией дезамидированного остатка. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Ферментативно модифицированные промежуточные остатки Gln из переамидирования , отображающие соотношение инвертируется γ / α-глутамил (рисунок 2) могут быть обнаружены и охарактеризованы с помощью LERLIC-MS / MS, которые могут иметь существенное влияние на изучении proteinopathy при нейродегенеративных заболеваниях 3, 22, 23 , 24. Кроме того, как сообщалось ранее в Serra & Gallart-Palau 2016 года, несколько неизвестных PIMT субстрата белков , представляющих собой перевернутое соотношение isoAsp / Asp в дезамидированных остатках Asn также могут быть идентифицированы в тканях человека с помощью LERLIC-MS / MS 3.
Фигура 2: Обследование XICs и идентификации двойного времени удерживания в MS / MS уровне для Деамидированной Пептиды Разрешить Определение характеристик Gln и Asn Деамидированные ИЗОМЕРЫ и идентификации продуктов от Crucial ферментативных реакций , которые происходят в дезамидировании. а. Деталь Xic показывающей два пика, соответствующих γ / α-глутамили изомеры пептида FQMPDQGMTSADDFFEQ # GTK из белка мозга DPYL2 дигидропиримидиназы-белок, связанного 2. Перевернутого γ / α-глутамило отношение detecteд в том, что пептид указывает на потенциальную причастность к γ-глутамил-содержащих звонкой в реакции transglutamination как трансглютаминазы гамма-глутамил промежуточной. Деамидированная остаток проверяется MS / MS на обоих времена удерживания, б. на 389,1 мин , соответствующий α-глутамил-содержащего пептида , и с. на 401,4 мин, соответствующий γ-глутамил-содержащего пептида. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Как новизна данной работы, мы обнаружили , что LERLIC-МС / МС дает характеристику сукцинимидного промежуточному продукту (фиг.3). Использование мягкого кислого рН во время обработки образца стабилизирует промежуточную сукцинимид в модифицированной Asn 25 остатков. Таким образом, LERLIC-МС / МС позволяет протеом масштаба исследования succiniМИД промежуточный, лабильная и плохо понимаются модификация со значительными физиологическими и патологическими последствиями 26.
Рисунок 3: Определение сукцинимида промежуточного продукта в Asn остатков по LERLIC-MS / MS. а. Спектр Asn деамидирован пептид YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR из белка мозга ALDO С альдолазом С. дезамидированной остаток обозначаются как Deam-Asn. б. Спектр пептид YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, который в данном случае показывает массовый сдвиг -17 Da на ранее деамидирован Asn остатка (SCC-Asn) из-за потери аммония, которые имеют место в процессе формирования сукцинимида промежуточного продукта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию гофигурное.
| Компонент | Сумма на 100 мл |
| Изопропиловый | 90 мл |
| вода | 10 мл |
Таблица 1. Упаковка Буфер Состав (90% изопропанол).
| Решение 1: 1 М ацетата аммония. | |
| Компонент | Сумма в 50 мл |
| ацетат аммония | 3,86 г |
| Вода (составляют до 50 мл) | ~ 50 мл |
| Раствор 2: 100 мМ ацетата аммония. | |
| Компонент | Сумма в 50 мл |
| Решение 1 | 5 мл |
| вода | 45 мл |
| Решение 3: 10% дезоксихолат натрия. | |
| Компонент | Сумма на 1 мл |
| дезоксихолат натрия | 0,1 г |
| вода | 1 мл |
| Решение 4: SDC буфер для гомогенизации (100 мМ ацетата аммония, содержащий 1% дезоксихолата натрия). | |
| Компонент | Сумма в 10 мл |
| Решение 2 | 9 мл |
| Решение 3 | 1 мл |
Таблица 2. SDC Гомогенизация буфер Состав (100 мМ ацетата аммония , содержащего 1% дезоксихолат натрия). Подготовка запасов СолуТион 1 М ацетата аммония (раствор 1) и разбавленным, чтобы получить 100 мМ ацетата аммония (Раствор 2). Кроме того, готовят исходный раствор 10% дезоксихолата натрия (раствор 3). Подготовка буфера для гомогенизации SDC, как описано в растворе 4.
| Решение 5: 1 М ДТТ | |
| Компонент | Сумма в 10 мл |
| дитиотреитол | 77 мг |
| Раствор 2 (таблица 2) | 0,5 мл |
| Решение 6: Буфер для разведения | |
| Компонент | Сумма в 10 мл |
| Решение 5 | 0,1 мл |
| Раствор 2 (таблица 2) | 9,9 мл |
Таблица 3. Буфер для разбавления Состав (100 мМ ацетата аммония , содержащего 10 мМ дитиотреитола (DTT)). Подготовка исходного раствора 1 М DTT (раствор 5), а затем подготовить буфер для разведения, как описано в растворе 6.
| Решение 7: 1 M IAA | |
| Компонент | Сумма в 10 мл |
| IAA | 93 мг |
| Раствор 2 (таблица 2) | 0,5 мл |
Таблица 4. Состав Алкилирование буфера (100 мМ ацетата аммония , содержащего 20 мМ иодацетамида (МАА)). Подготовка исходного раствора 1 М IAA (раствор 7).
| Компонент | Сумма в 50 мл |
| Гидроксид аммония | 0,25 мл |
| вода | 24,75 мл |
Таблица 5. SDC Состав буфера повторного растворения (0,5% Гидроксид аммония).
| Компонент | Сумма на 100 мл |
| трифторуксусной кислоты | 0,1 мл |
| вода | 99,9 мл |
Таблица 6. Очистка буфера (0,1% трифторуксусной кислоты).
| Компонент | Сумма на 100 мл |
| Ацетонитрил | 75 мл |
| Муравьиная кислота | 0,1 мл |
Таблица 7. элюирующего буфера (75% ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота).
| Компонент | Сумма на 1000 мл |
| Муравьиная кислота | 1 мл |
| вода | 999 мл |
Таблица 8. Мобильная фаза А состав.
| Компонент | Сумма на 1000 мл |
| Муравьиная кислота | <TD> 1 мл|
| Ацетонитрил | 999 мл |
Таблица 9. Мобильная фаза В состав.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео-статье мы приводим протокол шага за шагом LERLIC-MS / MS 3, способ для выполнения углубленной характеристики и точно определить степень белка дезамидирования и ферментативных процессы , участвующих в этой модификации белка. LERLIC-МС / МС основан на использовании длинной длины (50 см) LAX по принципу электростатического взаимодействия хроматографии отталкивания-гидрофильной (ERLIC) 27. Использование колонны длинномерной, как показано в нашем исследовании 3, максимизирует потенциал ERLIC для отдельных пептидов в соответствии с их изоэлектрической точкой 27.
LERLIC-МС / МС представляет собой стратегию одномерного разделения нового дробовика, рабочий процесс , который экономит время-на-руки в процессе обработки образца , хотя это требует 1200 мин градиента , как показано в 3 , чтобы получить оптимальные результаты на очень сложные протеомах. A 60 мин gradienт в LERLIC-MS / MS может также достичь оптимального разделения Gln деамидирования изоформ на модельных соединений впервые в дробовика протеомики 3. На основании этих двух приложений, мы предполагаем , что второе отделение измерение выполняется LAX капилляра может быть соединен с обращенной фазой хроматографии первой размерности под многомерной хроматографии подхода для анализа образцов средней сложности, рабочий процесс , ранее используемый нашей группой 10.
Подготовка образцов для анализа белков дезамидирования является важным шагом , который требует особого внимания , чтобы предотвратить возникновение артефактного дезамидировании на Asn остатках в значительной степени 1. Хао и др. Обнаружено , что трипсин пищеварение при слабом кислотном рНе значительно предотвращает призрак артефактного дезамидировании во время подготовки образца 28. Мы использовали в этом исследовании, наша SDC-помощь в попытке решенияptic пищеварение 13, способ , в котором обработка образца проводят при рН 6. С другой стороны, более сильные кислотные условия могут оспорить пищеварение способность трипсина при рН поддерживают ниже , чем 6 29. Решение этой проблемы, совсем недавно Liu и др. сообщили об оптимальной стратегии пищеварения , что позволяет успешно пищеварение и предотвращение возникновения артефактного дезамидировании на Asn остатков путем замены трипсина с помощью Glu-C при рН 4,5 30. Реализация метода расщепления , сообщаемые Лю и др. 30 для анализа Asn дезамидирования пути LERLIC-MS / MS может быть потенциальной стратегией , которая требует экспериментальной проверки.
Протокол изложенный в этом видео-статье имеет большой потенциал для дальнейшей характеризации и количественной оценки в настоящее время неизвестных соотношений изоформа массивов, которые определяют участие белка дезамидирования в старении и заболеваниях человека. МехThermore, применение LERLIC-MS / MS в других биологических фонах поможет определить потенциальные возможности и риски белка дезамидирования в качестве модификации молекулярных часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантами Министерства образования Сингапура (2-го уровня: Грант ARC9 / 15), Национальный Совет по медицинским исследованиям Сингапура (NMRC-OF-IRG-0003-2016) и NTU-NHG Aging Research Grant ( Грант ARG / 14017). Мы хотели бы выразить нашу признательность и искреннюю благодарность доктору Эндрю Альперт и команды PolyLC за любезно предоставил нам упаковочные материалы, которые сделали возможным это исследование.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
