Medicine

דיסקציה של הלבלב העכבר עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי

Published: August 19, 2017 doi: 10.3791/55647

Michelle J. Veite-Schmahl¹, Daniel P. Regan¹, Adam C. Rivers¹, Joseph F. Nowatzke^1,2, Michael A. Kennedy¹

¹Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, ²College of Medicine, Central Michigan University

Summary

המאמר וידאו מספק הפגנה מפורט של ההליכים הנדרשים בהצלחה להסיר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי.

Abstract

לנו יש כבר חוקרת את הלבלב גורם שעתוק ספציפיים, 1a cre-recombinase; לקס-עצור-סלומון-קריסטן עכברוש סרקומה, גליצין כדי חומצה אספרטית-codon 12 (Ptf1a^{cre / +}; LSL-Kras^{G12D / +}) העכבר זן כמודל של סרטן הלבלב אנושי. מטרת המחקר הנוכחי שלנו הוא לזהות סמנים מטבוליים חדשניים של התקדמות סרטן הלבלב. ערכנו פרופיל מטבולי של שתן, צואה, דם, ואת תמציות רקמת הלבלב, כמו גם ניתוחים היסטולוגית של הלבלב לביים את התקדמות סרטן. הלבלב העכבר אינו איבר מוצק מוגדר היטב כמו בבני אדם, אך מעדיף רקמה רכה diffusely מבוזרת לא בקלות המזוהה על-ידי אנשים מכירים את האנטומיה הפנימית העכבר או על ידי יחידים שיש להם מעט או ללא ניסיון ביצוע העכבר איברים והניתוחים. מטרת מאמר זה היא לספק מפורטת step-wise ויזואלית הפגנה מדריך טירונים להסרת הלבלב העכבר על ידי ניתוח. מאמר זה צריך להיות יקר במיוחד סטודנטים, חוקרים חדשים למחקר הדורש קציר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח פרופיל מטבולי או ניתוחים היסטולוגית.

Introduction

העכבר התפתחה חשוב במודל חיה של סרטן הלבלב האנושי¹^,². ב- Ptf1a^{cre / +}; LSL-קראס^{G12D / +}דגם העכבר, קריסטן עכברוש סרקומה (K-Ras) אונקוגן מופעל באופן בלעדי הלבלב, וכתוצאה מכך חניכה של נגעים טרום סרטניים בלבלב, המכונה הלבלב neoplasias intraepithelial הנרתיק (PanINs), לזה ההתקדמות כדי אדנוקרצינומות ductal הלבלב, נפוץ המכונה PDACs³. מערכת מודל זה העכבר מספק אחד מהדגמים הכי זמין בבעלי חיים עבור סרטן הלבלב האנושי⁴^,⁵, עם יתרון נוסף העולות PanINs בתוך בחמשת החודשים הראשונים של החיים ולעיתים קרובות התקדמות PDAC בתוך יחיד בן⁴^,⁵, ואילו סרטן הלבלב מתרחשת לעתים קרובות ביותר בבני 60-70 שנים של גיל.

מיצוי של הלבלב על ידי ניתוח של Ptf1a^{cre / +}; LSL-קראס^{G12D / +}עכברים בגילאים שונים מאפשרת בדיקה היסטולוגית האורך מקיפה של התפתחות סרטן הלבלב, החל בשלבים המוקדמים הייתה דרך ההתקדמות PDAC³^,⁴ ^, ⁵. קצירת הלבלב בגילאים הנעים מ-5 עד חמישה עשר חודשים יכול לשמש גם כדי להכין טישו תמציות לאפיין שינויים כלליים בחילוף החומרים⁴ הלבלב להתרחש במהלך המעבר בריא רקמה חולה⁶^,⁷.

מאמר זה מציג מדריך ויזואלי מלא של כל השלבים הדרושים לביצוע חילוץ הלבלב של העכבר, מספקת קווים מנחים עבור אחסון פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי לצורך ניתוח נוסף. מדריך זה יהיה שווה ערך עבור יחידים ניסוי על מחלות אחרות הלבלב, לרבות סוג של סוכרת, צריכה להיות שימושית במיוחד סטודנטים, חוקרים חדשים למחקר מעורבים קציר של הלבלב העכבר באמצעות ניתוח פרופיל מטבולי או ניתוחים היסטולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים וידאו והנחת המתוארים להלן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת מיאמי.

1. הכנה ובדיקה הגירוי

צור שני תחומים ברורים הליך כירורגי, שולחן הניתוחים של הטבלה פעולה-מאוחרת. שלב שני אזורים עם כל חומרים וכלים הדרושים. שולחן
1. הבמה פעולתו ברדס פרקו. לסדר את השולחן. עם הציוד באופן המאפשר ביצועים רציפה, ללא הפרעה של ההליך-
2. ליצור טבלה לאחר הניתוח באותו החדר, ליד השולחן הראשי של המבצע. לשמור על שתי הטבלאות כמו סביבות סטרילי לאורך כל ההליך.
המקום הבאות מספקת על שולחן הניתוחים: כוס אחת צנצנת עם מכסה, שפופרת אחת 15 מ"ל, זוג מספריים כירורגיים, בקבוק לחיץ אחד של 70% אתנול, שתי לוחות קצף, מלקחיים שני, שני מזרקים מד 1 מ"ל 21, שני צינורות 50 מ ל, שפופרת אחת צנטריפוגה , בקבוקון אחד קריוגני 4 רפידות כירורגי, עשר סיכות, מתקן של מגבונים חיטוי, מיכל שרפ.
למקם את המצרכים הבאים על השולחן פעולה-מאוחרת: איזון האנליטי אחד, אחד דיואר L 4 של חנקן נוזלי, רחב רדוד פה דיואר מתלה microtube צף, זוג מספריים כירורגיים, מלקחיים שני, 4 מבחנות הקפאה, מתקן של מגבונים סטריליים.
למלא אחד 50 mL ושפופרת אחת 15 מ"ל לאמצעי 75% עם פורמלין.
שימוש במספר זיהוי אישי בכל פינה, מוספית אחת כירורגי pad כדי לוח מוקצף משוער 30 ס"מ על 30 ס"מ כדי לשמש הלוח לנתיחה. להשתמש בפינים ארבעת הנותרים במהלך המבצע. להכין לוח מוקצף קטן עם כרית כירורגית כדי להעביר את האיברים הטבלה לאחר הניתוח.
התראה: איזופלוריין (99.9%) כימי רעיל, אמור לשמש בשכונה האוורור כדי להבטיח את הרמה המקסימלית של ביטחון מפני ניקוי פסולת גז הרדמה ⁸. ניתן למצוא פרטים נוספים אודות הסיכונים לחוקרים הקשורים לשימוש של השיטה הפתוחה-שחרור באמצעות איזופלוריין מאמר מאת טיילור ו מוק ⁸.
מקום אחד משטח כירורגי לתוך צנצנת זכוכית להשרות כמה טיפות של איזופלוריין (99.9%) ומניחים מגבת נייר לפסגה כדי למנוע מגע ישיר של העכבר עם איזופלוריין. באופן דומה, להשתמש בפתקים כירורגי קו הצינור הנותרים, להשרות כמה טיפות של איזופלוריין ולמקם רכיב pad נוספים לפסגה כדי למנוע מגע ישיר בין העכבר את איזופלוריין.
חנקן נוזלי לשפוך לתוך הפה רחב רדוד דיואר עד למקסימום מילוי קו מתמלאת.
המקום העכבר שנבחר עבור ניתוח לתוך ההרדמה קאמרית, כלומר צנצנת הזכוכית עם כרית ספוג עם כמה טיפות של איזופלוריין (99.9%) מכוסה את המכסה, עבור מינימלית ~ 1
הערה: הפעם משתנה של עכבר. ברגע העכבר מחוסר הכרה, להסיר אותו מן החדר ומניחים אותו על גבי לוח ההפעלה.
אוריינט העכבר כך הוא שוכב בצד הגחוני והגביר את ראשו הצביע מן המדען. שים את ראשך בתוך הצינור מרופדת עם כרית כירורגי שרויות במים עם מספר טיפות של איזופלוריין (99.9%), ולבצע מבחן גירוי על ידי צביטה רגל כדי להבטיח העכבר מגיב לגירויים.
1. אם נכשלת במבחן זה העכבר מגיב במבחן קמצוץ רגל, חזור על שלב 1.8.

2. ראשוניות החתך לב לנקב, המתת חסד

להצמיד את הגפיים של העכבר ללוח קצף כירורגי. ולהשתין הצד הבטני של העכבר באמצעות אתנול 70%-
לצבוט הפרווה/העור ליד הפתח השופכה עם מלקחיים ולמשוך מעט כלפי מעלה. לעשות חתך עם המספריים כירורגי דרך חלל הבטן החל פתח השופכה, את האמצע ואת הסוף על הסנטר.
1. ליד נקודת המוצא של החתך הראשוני, תפוס צד אחד של הפרווה/העור עם המלקחיים, להפוך את חיתוך נוסף עם המספריים כלפי מטה באלכסון לכיוון הכפה גב-
2. חוזר זה באופן זהה בצד השני.
  הערה: הפרווה/העור עלול להיסגר כדי ליצור פתח רחב יותר, אך לא הכרחי.
לאתר הלב ולהסיר את קרום הלב, אשר נמצא השק. סביב הלב, כדי למנוע סתימת מחט מזרק.
1. ולהיאחז הכפורת בעזרת המלקחיים. ולהפסיק עם המספריים. לבצע הניקוב הלב על ידי בקפידה החדרת מחט מזרק לתוך הלב הפועם ולאט לאט מתחילים לחזור בו הבוכנה.
2. לאיסוף דם מיטביים, השתמש הבוכנה של המחט לחקות את פעולת השאיבה של הלב ואף להימנע מהדפסת מהר מדי.
  הערה: בדרך כלל כ 1 מ"ל של דם ניתן לאסוף.
3. לאחר השלמת איסוף דם, להפיג את הדם לתוך צנטריפוגה צינור והשלך המזרק לתוך המיכל שרפ.
4. לאחר הניקוב הלב מבוצע, לבצע המתת חסד על-ידי הסרת הקבצים המצורפים חיבור הלב.
  הערה: הפארין, אנטי מקריש, לא נוסף את המזרק בהליך זה לפני הניקוב הלב כדי לאפשר את הדם והקרשה לאוסף סרום במחקר ספציפי זה. עם זאת, אם החוקר רצה למנוע קרישת דם כדי לאסוף פלזמה, הפארין היתה אפשרות להוסיף את המזרק לפני הניקוב הלב.
אם המחקר כרוכה genotyping של העכבר, לגזור חלק האוזן עם המספריים ומניחים לתוך שפופרת צנטרפוגה עבור אימות גנוטיפ.

3. החילוץ הלבלב

אתר בבטן בצד שמאל של העכבר. בגין בעדינות (כדי למנוע קריעה) הפרדת הלבלב הקיבה, התריסריון באמצעות מלקחיים שני.
הערה: בעת ניתוק הלבלב הקיבה, המעיים, חשוב מאוד כי המלקחיים משמשים בעדינות כדי להנחות את רקמת הלבלב מן האברים וכדי לא למעוך או לקרוע את הלבלב עם המלקחיים.
1. להמשיך להפריד בין הלבלב מן הסעיפים מעי ו המעי הדק, ולבסוף החל caecum של המעי הגס.
ב caecum, מיקום מחדש של המלקחיים ולהמשיך ההפרדה של הלבלב לאורך המעי הגס הנותרים לקראת בחלחולת.
הערה: בשלב זה, זה נוח לחתוך ולהסיר את החלק מן הקיבה לאזור של המעי הגס מיד לפני החלחולת.
לאתר הלבלב ומצורפת הטחול. החלק הלבלב כלפי הצד הימני של העכבר. להפריד את החיבורים שנותרו בין הלבלב חלל בית החזה עם המלקחיים להתנתק לחלוטין לבלב וטחול מחודשים, נוחים ומרווחים.
להסיר את הלבלב, להפיץ את זה לבדיקה. השאר הטחול קשור הלבלב למטרות זיהוי.
1. הסר כל רקמת חיבור, רקמת שומן, מצע המעי העליון מן הלבלב.
  הערה: זה רקמות לבן בצבע, ולכן ניתן בקלות להבחין בין רקמת לבלב זה pinker בצבע. הדבר חשוב במיוחד אם הלבלב כל צריך להיות מוסר. לדוגמה, אם הלבלב צריך להיות שקל, לעומת משקל הגוף או בין קבוצות של בעלי חיים. ב- Ptf1a ^{cre / +}; LSL-קראס ^{G12D / +} דגם העכבר, במיוחד בחודשים בוגרים, קשה סיבי רקמת הלבלב יכול להיות נוכח. במקרה זה, הסרת זהיר של הלבלב שחייבת להתנהל כמו המעיים יכול להיות שזורה ברקמת הגידול. במקרים מתקדמים, הטחול לא תקין ואת רקמת הכבד עשוי גם להיות נוכח.
במידת הצורך, מסירים איברים אחרים בשלב זה.

4. איסוף נתונים ואחסון

לאחר החילוץ של האיברים, מעביר את הדגימות לאזור לאחר הניתוח לשימור.
שוקל כל איבר ואיבר ולמקם אותם לתוך המבחנה קריוגני בהתאמה שלהם.
הערה: לאורך שנינותh המסה של כל דגימה, חריגות צריך להיות מוקלט לשימוש עתידי.
לאחר ששקלת את האיברים, למקם אותם לתוך החנקן הנוזלי עבור הצמד לקפוא.
אחרי הצמד קופאים, לאחסן את האיברים ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך-
למקם את הדגימות פורמלין המאוחסנים על גבי ספסל בן לילה, למחרת בבוקר לשנות את הפתרון שלהם פורמלין אתנול 70%-
הערה: הדוגמאות האלה צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך-
לאחסון לטווח ארוך, להקפיא את האגרוף דם ועל אוזנו ב-80 º C. אוסף נסיוב מהדם, לאפשר את הדם מצב של קרישת חסר במשך 30 דקות ולאחר מכן centrifuge את זה. להסיר את החלק סרום באמצעות פיפטה ולאחר מכן אחסן ב-80 מעלות צלזיוס

5. ניקוי

Sanitize כל הקרע כלים עם המחיקות לחיטוי. מכסה הצינורית הרצוף של איזופלוריין ספוג כרית כירורגי. החלף משטח כירורגי על לוח מוקצף עם כרית כירורגי טריים. תשליך את החלקים של העכבר לא אסף לכל המתקן ' מדיניות לרשות בעלי חיים s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג סקירה של האזור סביבת ההפעלה, איור 2 מציג את אזור הפעולה פוסט. כאשר הגדרה זו מספקת את כמות מינימלית של ציוד, מעצבים, אנשים יכולים לבחור לשנות את זה בצורה הטובה ביותר לצרכים בודדים. הפרוטוקול צריך להיות מוטבת בהתאם לצרכים הספציפיים של הניסוי. ההליך זה מתנהל בצורה שמסיים את חייו של עכבר, הדורשים euthanization תקין⁹. כאשר החוקר מוכן, העכבר ימוקם תא הרדמה עם הידיות ספוג איזופלוריין (איור 3).

ברגע העכבר מחוסר הכרה, להסיר את העכבר והנח אותו בצד הגבי על הלוח. הליך הבוהן-קמצוץ צריכה להתבצע כדי להבטיח העכבר מגיב לכאב (איור 4). החל 70% אתנול לחטא את האזור החתך הראשוני. ההגרלה דם מסוף שחייבת להתנהל קודם, לפני הסרת הלבלב, כדי להבטיח אחזור דם נאותה. לפני הסרת דם, יש להסיר את קרום הלב כדי למנוע סתימת של המחט 21 גרם הפתיחה. לאחר שסיים את הדם מסוף לצייר, הלב מנותק כשיטה משנית של המתת חסד, הלבלב מוסר לאחר מכן.

התחל על-ידי איתור הבטן, אשר מספק נקודת התחלה טובה להסרת הלבלב (איור 5). הערה: נקטו זהירות כדאי להשתמש במהלך ההסרה של הלבלב, אשר טישו עדין ושברירי, לכן כל הפעולות יש לבצע עם כוח עדין. באמצעות מלקחיים, להתחיל את הקרע החל למשוך בעדינות את הלבלב מן הקיבה ולהמשיך להפריד את רקמת הלבלב הציפוי החיצוני של מערכת העיכול (GI) עובדים מאזור הבטן תריסריון, מעי ו ( איור 6). ברגע caecum מתמלאת, הסרה קלה של הלבלב מושגת על ידי שינוי מיקום המלקחיים כך מלקחיים אחד מחזיק caecum את המלקחיים אחרים משמש כדי להמשיך להפריד הלבלב המעי הגס (איור 7). לאחר הסרה של המעי הגס, הלבלב ממוקם בצד ימין של העכבר ו קבצים מצורפים הנותרים הם כרות(איור 8).

הלבלב צריך להיות התפזרו לבדיקה, חריגות צריך להיות מוקלט (איור 9). ב- Ptf1a^{cre / +}; LSL-קראס^{G12D / +} העכבר זן, הלבלב עשויה להכיל פוטנציאל גידול מוקשה (איור 10). איברים אחרים צריך להיבדק גם עבור פוטנציאל גרורות. ברגע הלבלב הוסר, זה צריך להישקל והקליט המשקל. חלק הלבלב snap-קפוא חנקן נוזלי לניתוח העתיד פרופיל מטבולי או בדיקות אחרות וחלק של הלבלב להניחה בפורמלין לבדיקה היסטולוגית בעתיד. איור 11 מציג האחסון הראשונית של איברים שונים שנאספו מכל הקרע לשימוש בניתוח מאוחר יותר. האיברים שנאספו על ידי דיסקציה ומאוחסנים להמשך לימודים יהיה תלוי המטרות של החוקר בודדים.

דגימות רקמות דם יכול לשמש עבור ניתוחים היסטולוגית, פרופיל מטבולי. דוגמה של ניתוח היסטולוגית של רקמת לבלב מוצג באיור12. פרופיל מטבולי יכול להתבצע על דגימות רקמה מוקפאים snap ו דגימת דם. תהודה מגנטית גרעינית נציג ספקטרה ספקטרוסקופיה (NMR) של רכיבי תמציות רקמת הלבלב הידרופיליות, הידרופובי מוצגים איור 13A עם 13 ב', בהתאמה. ספקטרום NMR נציג שנאסף על דגימת נסיוב מקריסטלים של דם נאסף בזמנו של הליך צייר דם מסוף מוצג באיור14.

איור 1 : היערכות של אזור ההפעלה. הפריסה הכללית של כלים נכונים לתנאי התפעול רוברט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : היערכות שטח פעולה-מאוחרת. הפריסה הכללית של כלים נכונים לתנאי התפעול ההליכים לאחר הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : הרדמה תא. סביבה. שמתאימה הרדמה דרך איזופלוריין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : גירוי בדיקה. לא הוא להיות עברה את המבחן גירוי שנערך על העכבר לפני החתך כדי להבטיח כל כאב או אי נוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : תחילת הסרת הלבלב. הכיוון של העכבר המציין את החילוץ הראשוני של הלבלב, במיקום המצוין על-ידי המלקחיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6 : חילוץ הלבלב לאורך המעי. תהליך של בידוד הלבלב מ מערכת העיכול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7 : הסרת הלבלב-Caecum. מיקום מחדש של המלקחיים פעם את caecum נגיש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 8 : הסרת הלבלב. במקום הלבלב על הצד הימני של העכבר. צריך להיות חתוך המצורפים הנותרים כדי להסיר לחלוטין את הלבלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 9 : בדיקה הלבלב. הלבלב עם הטחול המצורפת נבחנת לאחר הסרת מן העכבר. הטחול הוא שמציין החץ האנכי, הלבלב הוא הצביע על ידי החץ האופקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 10 : בדיקה הלבלב. הלבלב עם הטחול המצורף מציג גידול בלבלב נבחנת לאחר הסרת מן העכבר. הטחול הוא שמציין החץ האנכי, הלבלב הוא הצביע על ידי החץ האופקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 11 : אחסון של אבריה הוצאו. אחסון המתאים של איברים ודוגמאות אסף, שהוכנו עבור אחסון לטווח ארוך של ניתוח בעתיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 12 : ניתוח היסטולוגית של רקמת הלבלב. Hematoxylin ואאוזין מוכתם תמונות מתוך רקמת הלבלב. א) רקמת הלבלב נורמלי Ptf1a^{cre /-}; LSL-קראס^{G12D /-}שליטה בעכבר. B) הייתה רקמת הלבלב של Ptf1a^{cre / +}; LSL-קראס^{G12D / +}המחקר העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 13 : מטבולית פרופיל ניתוח. פרוטון חד-ממדי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) ספקטרום של שלב א) הידרופילית ו ב) הידרופובי רכיבים של תמציות רקמת הלבלב בעקבות רקמות המגון ונחשפו כלורופורם/מתנול החילוץ. ספקטרום NMR נרכשו ב 850 מגה-הרץ, המתאימים לשימוש בניתוח פרופיל מטבולי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 14 : נציג ספקטרום NMR של נסיוב. הדם הנאסף על-ידי הפרוצדורה צייר דם מסוף יכול לשמש לצורך ניתוח פרופיל מטבולי. ספקטרום נרחב זה מראה אופייני של הפרוטון חד-ממדי 850 מגה הרץ NMR ספקטרום שנאסף על הסרום המתקבל דגימת דם מסוף לצייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

משמעות לגבי שיטות קיימות
בעוד אחרים קטעי וידאו לא רשמי של העכבר והניתוחים קיימים, המאמר וידאו מספק לאיכות המקצועית הראשונה, עמית שנסקרו, הדגמה ויזואלית של כל השלבים מפורט הנדרש לחילוץ קצירת בלבלב עכבר על-ידי דיסקציה¹⁰. הקל להיות איבר הראשי עבור פעילות חילוף החומרים, אינסולין ייצור, חיתוך, קציר של הלבלב מאפשר השימור של ה הפיזיולוגיות¹¹. על-ידי בידוד הלבלב, ניתוח עתידי יכול שיתקיים על הדגימה. הליך זה מאפשר להשוואה ולמידה של אינטראקציות בין רקמות אחרות בתוך האורגניזם אותו בתוך באותה מסגרת זמן.

מגבלות של הטכניקה
המגבלה הגדולה ביותר של הליך זה הוא סיום של העכבר החיים, ובכך מונע אוסף אורכי, דגימה של מספר דגימות רקמה מהעכבר אותו. כדי לנתח מגמות הקשורות לגיל, מין או quantifiers אחרים, חתך אוכלוסייה חייב להיות מיושם, כפי שעשינו עבור המחקר שלנו של סמנים מטבוליים של סרטן הלבלב. הגבלה נוספת של פרוטוקול זה הוא חוסר היכולת להשהות את ההליך. ברגע euthanization מאותחלת, ההליך צריך להתבצע בשלמותו.

שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול
ביצוע הבדיקה גירוי על ידי צובט הכפה האחוריות של העכבר חיוני כדי להבטיח כי העכבר מקבל ליחס אנושי. אם העכבר אינו מגיב לגירוי הזה, ואז ההליך עשוי להתבצע כמתוכנן. עם זאת, צריך העכבר להציג מענה במצוקה בעקבות הבדיקה גירוי, העכבר אמורה להיות מוחזרת לתא הרדמה לתקופה נוספת של זמן הבדיקה עד לתגובה במבחן גירוי לא נצפית¹².

באופן דומה, לב סופנית הניקוב ואחריו הסרת חיבורי ללב מיד לאחר דגימת הדם מסוף נאסף שיטה המשני של המתת חסד מבטיח את הקורבן אנושי של העכבר. כדי להבטיח של לקיחת הדם יעיל, המדען עליך להשתמש תנועה שאיבה עם המזרק הדומה פעימות הלב של העכבר, מתן אפשרות לאיסוף מרבי של דם לבדיקה.

שינויים ופתרון בעיות
מיתוג האברים של פורמלין לפתרונות אתנול 70% מכין האברים לצורך תהליך ההטבעה הנדרש לבדיקה היסטולוגית. פתרונות אחסון שונים עשוי להידרש צריך המדען לבחור לבצע ניסויים אחרים עם האיברים. לפני ניתוח חשוב להגביל את כל פוטנציאל הפשרתו של האיברים שמאוחסנים במקרר-80 ° C כדי לשמר את השלמות של האיבר.

השימוש Ptf1a^{cre / +}; LSL-קראס^{G12D / +} דגם העכבר מצמצם את המופע של הלא-הלבלב הראשי גידולים ומחלות¹³. לכן, חשוב לציין חריגות שאינן לכאורה הלבלב או איברים אחרים במהלך ניתוח ואוסף של דגימות רקמה לבדיקה.

יישומים עתידיים
קציר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח מאפשרת לסוגים רבים של ניתוח להתנהל על אותה דגימת זרע. הפופולריות ביותר של אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ hematoxylin ואאוזין היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, ספקטרומטר מסה, תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה⁶^,⁷^, ¹⁴ ^, ¹⁵. מחלות כמו סוכרת, דלקת לבלב סרטן הלבלב יכול להילמד תוך שימוש בטכניקות הנ ל¹⁶.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

MAK מודה תמיכה עבור עבודה זו של מכוני הבריאות הלאומיים / מכון הסרטן הלאומי מעניק מספר - 1R15CA152985-01A1. פרויקט זה נתמך גם על ידי מיאמי באוניברסיטה לתואר ראשון מחקר פרס התוכנית, אוניברסיטת מיאמי דוקטורט-הסמכה הזדמנויות למילגות, של אוניברסיטת מיאמי מלומדים קייטנה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Jar	Corning	3140-150	The glass jar used in the video has been discontinued. This is its replacement.
Lid of Glass Jar	Corning	9985-150	The glass jar lid used in the video has been discontinued. This is its replacement.
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	339650
Surgical Scissors	Fisher Scientific	9201
Squeeze bottle	Fisher Scientific	03-409-10DD
100% Ethanol	Fisher Scientific	22-032-103
Formalin	Fisher Scientific	245-684
Foam Boards	Therapak	562908
Forceps	Fisher Scientific	200205SHN
1 mL 21G Syringes	BD Biosciences	309624
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	339652
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-681-258
Surgical Pads	Fisher Scientific	S67011
T-Pins Length: 2"	Advance Store Products	X32T-05
Sterilizing Wipes	Professional Disposables International Inc.	Q85084
Sharps Container	Fisher Scientific	14-827-122
Analytical Balance	Marshall Scientific	ME-AE200
4L Dewar	Taylor-Wharton	4LD
Shallow Wide Mouth Dewar	Fisher Scientific	F3087-V
Floating Microtube Rack	VWR	60986-100
Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile	Fisher Scientific	10-500-25
Isothesia (Isoflurane)	Henry Schein Animal Health	050033
Liquid Nitrogen	Wright Brothers	NIT-60-XX
Mouse Kras Strain	The Jackson Laboratory	OO8179
Mouse Cre Strain	MMRRC	OOO435-UNC