Summary
Dieser video Artikel enthält eine ausführliche Demonstration der Verfahren erforderlich, um erfolgreich die Bauchspeicheldrüse von einer Maus entfernen durch Präparation für histologische Analyse und metabolic profiling.
Abstract
Wir haben die Bauchspeicheldrüse spezifischen Transkriptionsfaktor, 1a Cre-Rekombinase untersucht; Lox-Stop-Lox-Kristen Ratte Sarkom, Glycin, Asparaginsäure an das 12-Codon (Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / +) Belastung als ein Modell des menschlichen pankreatischen Krebses Maus. Unsere aktuellen Studien soll neue metabolischen Biomarker der Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression ermittelt. Wir haben durchgeführt, metabolic profiling von Urin, Kot, Blut, sowie Pankreas-Gewebe-Extrakte und histologische Analysen der Bauchspeicheldrüse, die Krebsentwicklung zu inszenieren. Die Maus-Bauchspeicheldrüse ist keine wohldefinierte solide Organ wie beim Menschen, sondern ist ein diffus verteilte weichen Gewebe, das nicht leicht zu erkennen ist von Einzelpersonen mit Maus Innere Anatomie nicht vertraut oder von Personen, die wenig oder gar keine Erfahrung durchführen Maus-Organ-Sektionen. Der Zweck dieses Artikels ist es, eine detaillierte schrittweise bieten visuelle Demonstration, Novizen bei der Entfernung der Maus Bauchspeicheldrüse durch Dissektion zu führen. Dieser Artikel sollte besonders wertvoll für Studenten und Forscher neue Forschung, die Ernte der Maus Bauchspeicheldrüse durch Präparation für metabolic profiling oder histologische Analysen benötigt.
Introduction
Die Maus hat ein wichtiges Tier Modell des menschlichen pankreatischen Krebses1,2entwickelt. In der Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / + Maus-Modell, die Kristen Ratte Sarkom (K-Ras) Onkogen ist ausschließlich in der Bauchspeicheldrüse, was Einleitung von präkanzerösen Läsionen in der Bauchspeicheldrüse, bekannt als Pankreas intraepitheliale Neoplasie (liegen), dass der Fortschritt aktiviert zu pankreatischen duktalen Adenokarzinome, gemeinhin als PDACs3. Dieses Maus-Modell-System bietet eines der verfügbaren Tiermodelle für menschlichen pankreatischen Krebs4,5, mit dem zusätzlichen Vorteil, die sich die liegen innerhalb der ersten fünf Monate des Lebens und häufig Fortschritte PDAC innerhalb einer einzelne Jahr4,5, während Bauchspeicheldrüsenkrebs am häufigsten bei Menschen 60-70 Jahre alt tritt.
Extraktion der Bauchspeicheldrüse durch Dissektion aus der Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / + Mäuse in verschiedenen Altersstufen ermöglicht detaillierte längs histologische Untersuchung der Entwicklung von Krebs in der Bauchspeicheldrüse PDAC3,4 von den frühesten Stadien der PanIN durch das Fortschreiten bis , 5. Ernte der Bauchspeicheldrüsenkrebs im Alter von fünf bis fünfzehn Monate Gewebe vorzubereiten Auszüge zu globalen Veränderungen im Pankreas4 Stoffwechsel zu charakterisieren, die auftreten, während der Übergang vom gesunden zum erkrankten Gewebe verwendet werden 6,7.
Dieser Artikel stellt eine komplette visuelle Anleitung die erforderlichen Schritte zum Ausführen einer Maus Bauchspeicheldrüse Extraktion und enthält Richtlinien für die Lagerung der Bauchspeicheldrüse zur weiteren Analyse. Dieses Handbuch wird für Einzelpersonen forschen auf andere Pankreas Erkrankungen, darunter Diabetes Typ I und besonders nützlich für Studenten und Forscher neu in Forschung, die Ernte von Pankreas Maus sollte gleichermaßen wertvoll sein Präparation für metabolic profiling oder histologische Analysen.
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Protocol
durchgeführt, in dem Video und weiter unten beschriebenen Abläufe von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Universität Miami genehmigt worden.
1. Vorbereitung und Impuls-Test
- stellen zwei verschiedene Bereiche für den chirurgischen Eingriff, dem OP-Tisch und dem Post-OP-Tisch. Inszenieren Sie beide Bereiche mit allen Materialien und Utensilien notwendig.
- Bühne, die das Betriebssystem Tabelle unter eine belüftete Haube. Ordnen Sie die Tabelle mit der Ausrüstung in einer Weise, die die kontinuierliche und ungehinderte Leistung des Verfahrens erlaubt.
- Schaffen eine postoperative Tabelle im selben Raum und in der Nähe der Haupt-Tabelle des Vorgangs. Beide Tabellen als sterile Umgebungen während des Verfahrens zu erhalten.
- Ort die folgenden liefert auf dem OP-Tisch: ein Glas mit Deckel, eine 15 mL Tube, einem Paar Chirurgische Scheren, ein Squeeze-Flasche von 70 % Ethanol, zwei Schaumstoffplatten, zwei Zangen, zwei 1 mL 21 Gauge Spritzen, zwei 50 mL Röhrchen ein Zentrifugenröhrchen , eine kryogene Durchstechflasche, vier chirurgischen Pads, zehn Pins, einem Dispenser sterilisieren Tücher und Sharps Container.
- Legen Sie die folgenden Lieferungen auf dem Post-OP-Tisch: eine Analysenwaage, einer 4 L Dewar von flüssigem Stickstoff, einem flachen breiten Mund Dewar, einem schwimmenden Reaktionscup Rack, ein paar Chirurgische Scheren, zwei Zangen, vier kryogene Fläschchen und ein Spender von sterile Tücher.
- Füllen Sie ein 50 mL und eine 15 mL Tube zu 75 % des Volumens mit Formalin.
- Mit einem Stift in jeder Ecke ein OP Pad, ein ca. 30 cm x 30 cm Hartschaumplatten dienen als Dissektion Board befestigen. Nutzen Sie die verbleibenden vier Stifte während des Betriebs. Bereiten Sie eine kleinere Hartschaumplatten mit einem OP Pad übertragen die Organe auf der Post-Op-Tisch.
Achtung: Isofluran (99,9 %) ist eine giftige Chemikalie, und sollte in einer Abzugshaube verwendet werden, um das Höchstmaß an Sicherheit aus der Aufräumvorgang Narkose Abgas 8 sicherzustellen. Weitere Informationen über die Risiken für die Forscher im Zusammenhang mit der Verwendung der Open-Drop-Methode mit Isofluran finden Sie in einem Artikel von Taylor und Mook 8. - Eine OP Pad in das Glasgefäß und Einweichen mit ein paar Tropfen von Isofluran (99,9 %) und einem Papiertuch über den Rand zu direkten Kontakt der Maus mit der Isofluran zu verhindern. Ebenso eine OP Pad verwenden, um säumen den verbleibenden Schlauch und Tränken mit ein paar Tropfen Isoflurane und legen Sie eine zusätzliche Pad über den Rand zu direkten Kontakt zwischen der Maus und der Isofluran verhindern.
- Pour Flüssigstickstoff in den flachen breiten Mund Dewar, bis das Maximum füllen Zeile erreicht ist.
- Statt der Maus ausgewählt für die Dissektion in die Narkose Kammer, d. h. das Glasgefäß mit einem Pad, getränkt mit ein paar Tropfen Isofluran (99,9 %) bedeckt mit Deckel, für ~ 1 min.
Hinweis: Diese Zeit variiert von Maus zu Maus. Sobald die Maus bewusstlos ist, entfernen Sie es aus der Kammer und platzieren Sie es auf das Bedienboard. - Ausrichten die Maus, sodass es Bauchseite bis und mit dem Kopf wies Weg von der Wissenschaftler aufliegt. Legen Sie den Kopf in die Röhre, gesäumt von einer OP Pad getränkt mit ein paar Tropfen von Isofluran (99,9 %), und führen Sie einen Impuls-Test durch eine Prise Fuß um sicherzustellen, dass die Maus nicht auf Reize reagiert.
- Wenn dieser Test fehlschlägt und die Maus auf den Fuß Kneiftest reagiert, wiederholen Sie Schritt 1.8.
2. Erster Schnitt, Herz durchbohren und Euthanasie
- Pin die Gliedmaßen der Maus auf die chirurgische Dämmplatte und nass die ventrale Seite der Maus mit 70 % igem Ethanol.
- Die Fell/Haut in der Nähe der Harnröhrenöffnung mit Zange zusammendrücken und leicht nach oben ziehen. Machen Sie einen Schnitt mit der chirurgische Schere durch die Bauchhöhle der Harnröhrenöffnung auf der Mittellinie beginnend und endend am Kinn.
- Nahe des Startpunktes des ersten Schnittes, einseitig das Fell/Haut mit der Zange greifen und machen ein weiterer Schnitt mit der Schere nach unten und schräg in Richtung der hinteren Pfote.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang auf die gleiche Weise auf der gegenüberliegenden Seite.
Hinweis: Die Fell/Haut kann eine breitere Öffnung erstellen festgenagelt werden, aber ist nicht notwendig.
- Herzen suchen und entfernen Sie das Perikard, die der Sac in der Herzgegend, zur Vermeidung von Verstopfungen der Spritzennadel ist.
- Der Herzbeutel mit der Zange fassen und mit der Schere ausschneiden. Führen Sie die Herz-Punktion durch sorgfältig die Spritzennadel in das schlagende Herz und beginnen Sie langsam den Kolben zurückziehen.
- Für die optimale Blutentnahme, verwenden Sie den Kolben der Nadel zu imitieren die Pumpfunktion des Herzens und vermeiden zu schnelles zeichnen.
Hinweis: In der Regel etwa 1 mL Blut gesammelt werden können. - Nach Abschluss der Blutentnahme, zerstreuen das Blut in die Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Spritze in die Scharfbehälter.
- Nach der Herz-Punktion durchführen Euthanasie durch Entfernen der Anlagen verbinden Herzen.
Hinweis: Heparin, ein Antigerinnungsmittel, wurde die Spritze in diesem Verfahren vor Herz durchbohren um das Blut zu gerinnen für Serum-Sammlung in dieser spezifischen Studie ermöglichen nicht hinzugefügt. Jedoch wenn der Forscher Blutgerinnung Sammle Plasma verhindern wollte, Heparin konnte hinzugefügt werden, die Spritze vor der Herz-Punktion.
- Wenn die Studie Genotypisierung der Maus beinhaltet, einen Teil des Ohrs mit der Schere schneiden und legen Sie in ein Zentrifugenröhrchen für eine Überprüfung der Genotyp.
3. Bauchspeicheldrüse Extraktion
- suchen den Magen auf der linken Seite der Maus. Beginnen Sie vorsichtig (um reißen zu vermeiden) trennt die Bauchspeicheldrüse, Magen und Zwölffingerdarm mit zwei Pinzetten.
Hinweis: Wenn die Bauchspeicheldrüse vom Magen und Darm zu trennen, ist es sehr wichtig, dass die Zange vorsichtig verwendet werden, um das Pankreas-Gewebe Weg von den Organen zu führen und zu nicht zerdrücken oder reißen die Bauchspeicheldrüse mit der Zange.- Weiterhin die Bauchspeicheldrüse aus den Dünndarm Jejunum und Ileum, trennen und schließlich von der Blinddarm des Dickdarms.
- An den Blinddarm, positionieren Sie die Zange und Trennung der Bauchspeicheldrüse entlang der restlichen Doppelpunkt in Richtung Enddarm.
Hinweis: An dieser Stelle ist es bequem zu schneiden und entfernen den Teil aus dem Magen in die Region des Dickdarms, die unmittelbar vor dem Rektum. - Suchen Sie die Bauchspeicheldrüse und Milz zugeordnet. Schieben Sie die Bauchspeicheldrüse zur rechten Seite der Maus. Trennen Sie die restlichen Verbindungen zwischen der Bauchspeicheldrüse und der Brusthöhle mit der Zange, vollständig zu lösen, der Bauchspeicheldrüse und der angrenzenden Milz.
- Die Bauchspeicheldrüse zu entfernen und zur Prüfung verteilt. Lassen Sie die Milz an der Bauchspeicheldrüse zu Identifizierungszwecken befestigt.
- Entfernen Sie alle Bindegewebe, Fett und mesenterialen Gewebe aus der Bauchspeicheldrüse.
Hinweis: Dieses Gewebe ist von weißer Farbe und somit aus dem Gewebe der Bauchspeicheldrüse, das pinker Farbe ist leicht unterschieden werden kann. Dies ist besonders wichtig, wenn die ganze Bauchspeicheldrüse entfernt werden muss. Zum Beispiel, wenn die Bauchspeicheldrüse muss abgewogen und im Vergleich zu Körpergewicht oder zwischen Gruppen von Tieren. In der Ptf1a Cre / +; LSL-Kras G12D / + Mausmodell, speziell in den älteren Monaten harten faserigen Bauchspeicheldrüsen-Gewebe vorhanden sein könnten. In diesem Fall muss sorgfältige Entfernung der Bauchspeicheldrüse durchgeführt werden, da der Darm im Tumorgewebe interlaced sein könnte. In fortgeschrittenen Fällen abnorme Milz und Leber können auch vorhanden sein.
- Entfernen Sie alle Bindegewebe, Fett und mesenterialen Gewebe aus der Bauchspeicheldrüse.
- Auf Wunsch entfernen andere Organe an dieser Stelle.
4. Datenerhebung und-Speicherung
- nach der Extraktion der Organe, verschieben die Proben in den postoperativen Bereich für Erhaltung.
- Wiegen jedes Organ und legen Sie sie in ihre jeweiligen kryogenen Vial.
Hinweis: entlang with die Masse jeder Probe sollte etwaige Unregelmäßigkeiten zu Referenzzwecken aufgezeichnet werden. - Sobald die Organe gewogen sind, legen Sie sie in den flüssigen Stickstoff für Snap einfrieren.
- Nach dem Fang Einfrieren, aufbewahren der Organe bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung.
- Stellen die Formalin aufbewahrt Proben auf der Bank-Oberseite über Nacht und am nächste Morgen ändern ihre Lösung von Formalin in 70 % igem Ethanol.
Hinweis: Diese Beispiele sollten gespeichert werden, bei 4 ° C für die Langzeitspeicherung. - Für langfristige Lagerung, Einfrieren die Blut und Ohr Punch bei-80 ° c. Lassen Sie für Serum-Sammlung aus dem Blut das Blut gerinnen für 30 min dann Zentrifugieren sie. Die Serum-Teil mit einer Pipette zu entfernen und dann speichern bei-80 ° c
5. Clean Up
- desinfizieren die Dissektion Werkzeuge mit der Sterilisation Tücher. Verschluss der Röhre, gesäumt von den Isofluran getränkt OP Pad. Ersetzen Sie die OP Pad auf der Dämmplatte mit einem frischen OP Pad. Entsorgen Sie die Teile der Maus, die nicht pro Anlage gesammelt wurden ' s Tier Entsorgung Politik.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über den Arbeitsbereich Umwelt und Abbildung 2 zeigt das Post-OP-Feld. Während diese Einstellung die minimale Menge an Ausrüstung bietet und Inszenierung, Einzelpersonen dies am besten individuell verändern können. Das Protokoll sollte entsprechend den spezifischen Bedürfnissen des Experiments optimiert werden. Dieses Verfahren wird in einer Weise durchgeführt, die das Leben einer Maus, erfordern angemessene Euthanization9beendet. Wenn der Forscher bereit ist, befindet sich die Maus in die Kammer der Anästhesie mit Isofluran-getränkten Pads (Abbildung 3).
Sobald die Maus bewusstlos ist, entfernen Sie die Maus und legen Sie es dorsalen Seite auf dem Brett. Ein Zeh-Prise Verfahren sollte durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Maus reagiert nicht auf Schmerzen (Abbildung 4). Gelten Sie 70 % Ethanol zum Sterilisieren der erste Schnitt-Bereich. Das terminal Blutentnahme muss zuerst vor dem Pankreas entfernen, um ausreichend Blut Abruf zu gewährleisten durchgeführt werden. Vor dem Blut entfernen sollte das Perikard zur Vermeidung verstopfen der Öffnung 21 G Nadel entfernt werden. Nach Abschluss der terminal Blut zu zeichnen, das Herz wird als sekundäre Methode der Euthanasie gelöst und die Bauchspeicheldrüse wird dann entfernt.
Beginnen Sie mit der Ortung der Magen, bietet einen guten Ausgangspunkt für die Entfernung der Bauchspeicheldrüse (Abbildung 5). Hinweis: Äußerste Vorsicht sollte ausgeübt werden, während der Entfernung des Pankreas, die zart und zerbrechlich Gewebe ist, und deshalb sollten alle Vorgänge mit sanfter Gewalt durchgeführt werden. Mit Pinzette, zunächst die Dissektion beginnen, ziehen vorsichtig die Bauchspeicheldrüse vom Magen und weiterhin die Bauchspeicheldrüse-Gewebe von der äußeren Auskleidung des Gastrointestinaltraktes (GI) arbeiten aus dem Magen, Duodenum, Jejunum und Ileum ( trennen Abbildung 6). Sobald der Blinddarm erreicht ist, erfolgt einfacher Entfernung der Bauchspeicheldrüse durch Neupositionierung der Zange, so dass eine Zange ist im Besitz der Blinddarm und die anderen Zange dient weiterhin die Bauchspeicheldrüse von den Dickdarm (Abbildung 7) zu trennen. Nach der Entnahme aus dem Dickdarm, Bauchspeicheldrüse befindet sich auf der rechten Seite der Maus und alle übrigen Anlagen sind abgetrennte()Abbildung 8).
Die Bauchspeicheldrüse sollte zur Inspektion aufgefächert werden und keine Auffälligkeiten sollte aufgezeichnet (Abbildung 9). In der Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / + Maus Belastung die Bauchspeicheldrüse kann potenziell einen gehärteten Tumor (Abbildung 10) enthalten. Andere Organe sollten auch mögliche Metastasen untersucht werden. Sobald die Bauchspeicheldrüse entfernt wurde, es sollte abgewogen werden und das Gewicht erfasst. Ein Teil der Bauchspeicheldrüse sollte in flüssigem Stickstoff für zukünftige metabolische Profilanalyse Snap eingefroren oder andere Tests und ein Teil der Bauchspeicheldrüse sollten in Formalin für zukünftige histologischen Untersuchung gestellt werden. Abbildung 11 zeigt die ursprüngliche Lagerung der verschiedenen Organe gesammelt aus den Präparierkurs für den Einsatz in der späteren Analyse. Die Organe von Dissektion gesammelt und gespeichert für weitere Untersuchungen richtet sich nach den Zielen des einzelnen Forschers.
Gewebe und Blutproben können für histologische Analysen und metabolic profiling verwendet werden. Ein Beispiel für die histologische Analyse der das Gewebe der Bauchspeicheldrüse ist in Abbildung 12dargestellt. Metabolic profiling auf Snap-gefrorene Gewebeproben und Blutprobe durchgeführt werden kann. Repräsentative magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie (NMR) Spektren der hydrophilen und hydrophoben Komponenten des Pankreas-Gewebe-Extrakte sind in Abbildung 13A und 13 b, bzw. gezeigt. Eine repräsentative NMR-Spektrum gesammelt auf einer Serumprobe aus Blutproben zum Zeitpunkt eines terminal Blut zeichnen Verfahrens vorbereitet ist in Abbildung 14gezeigt.
Abbildung 1 : Inszenierung der Bedienbereich. Allgemeine Layout der richtigen Werkzeuge und Betriebsbedingungen für die Dissektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Inszenierung von postoperativen Bereich. Allgemeine Layout der richtigen Werkzeuge und Betriebsbedingungen für die postoperative Verfahren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Anästhesie Kammer. Richtige Umgebung, um Anästhesie mit Isofluran. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Stimulus Prüfung. Der Impuls-Test durchgeführt auf der Maus vor den ersten Schnitt um Schmerzen oder Unbehagen zu gewährleisten wird nicht ertragen wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Entfernung der Bauchspeicheldrüse ab. Die Ausrichtung der Maus, dem ersten Extrahieren der Bauchspeicheldrüse durch die Zange angegebenen Speicherort angibt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Pankreas-Extraktion entlang der Darm. Prozess die Bauchspeicheldrüse über den Magen-Darm-Trakt zu isolieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Entfernung der Bauchspeicheldrüse bei der Blinddarm. Neupositionierung der Zange einmal der Blinddarm ist erreicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 : Entfernung der Bauchspeicheldrüse. Ort der Bauchspeicheldrüse auf der rechten Seite der Maus. Alle übrigen Anhänge sollten geschnitten werden, um die Bauchspeicheldrüse vollständig zu entfernen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9 : Pankreas Prüfung. Die Bauchspeicheldrüse mit angehängten Milz nach der Entnahme aus der Maus geprüft wird. Milz wird durch den vertikalen Pfeil angezeigt, und die Bauchspeicheldrüse wird durch den horizontalen Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10 : Pankreas Prüfung. Die Bauchspeicheldrüse mit angehängten Milz einen Pankreas-Tumor untersucht nach der Entnahme aus der Maus anzeigen. Milz wird durch den vertikalen Pfeil angezeigt, und die Bauchspeicheldrüse wird durch den horizontalen Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 11 : Lagerung der Organe entfernt. Fachgerechte Lagerung von Organen und Proben gesammelt, für langfristige Lagerung und Zukunftsanalyse vorbereitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 12 : Histologische Analyse der Bauchspeicheldrüse Gewebe. Hämatoxylin und Eosin befleckt Bilder vom Gewebe der Bauchspeicheldrüse. (A) normaler Pankreas-Gewebe aus einem Ptf1aCre /-; LSL-KrasG12D /- Steuerung Maus. (B) PanIN Gewebe aus der Bauchspeicheldrüse von einer Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / + Studie Maus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 13 : Metabolic Profiling Analyse. Eindimensionale Proton magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie (NMR) Spektren von A) hydrophil und (B) hydrophobe Phasenanteile der Bauchspeicheldrüse Gewebe Extrakte nach Gewebe Homogenisierung und Chloroform/Methanol Extraktion unterzogen. Die NMR-Spektren wurden bei 850 MHz erworben und sind geeignet für den Einsatz in metabolic profiling Analysen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 14 : Vertreter-NMR-Spektrum des Serums. Das Blut gesammelt durch das terminal Blut zeichnen Verfahren einsetzbar für metabolische Profilanalyse. Dieses Spektrum zeigt eine typische eindimensionale Proton 850 MHz NMR-Spektrum auf das Serum gewonnen aus einer Klemme Blutprobe Auslosung gesammelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden
Während andere informelle Videos von Maus Sezierungen vorhanden sind, in diesem video Artikel finden die ersten Profi-Qualität, Peer review, visuelle Demonstration aller die detaillierten Schritte erforderlich für die Extraktion und die Ernte von der Maus Bauchspeicheldrüse durch Dissektion10 . Mit der Bauchspeicheldrüse wird eine Hauptorgel für metabolische Aktivität und Insulin ermöglicht Produktion, Dissektion und Ernte der Bauchspeicheldrüse die Erhaltung der physiologischen Eigenschaften11. Durch die Isolierung der Bauchspeicheldrüsenkrebs, kann zukünftige Analysen auf der Probe durchgeführt werden. Dieses Verfahren ermöglicht den Vergleich und die Untersuchung der Wechselwirkungen von anderen Geweben innerhalb des gleichen Organismus innerhalb des gleichen Zeitrahmens.
Grenzen der Technik
Die größte Einschränkung dieses Verfahrens ist die Beendigung der Maus, und verhindert somit längs Sammlung und Probenahme von mehrere Gewebeproben aus der gleichen Maus. Um Trends in Bezug auf Alter, Geschlecht oder anderen Quantifizierer zu analysieren, muss eine Cross-sectional Bevölkerung umgesetzt werden, wie wir für unsere Studie der metabolischen Biomarker des pankreatischen Krebses getan haben. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist die Unfähigkeit, das Verfahren zu unterbrechen. Euthanization eingeleitet wird, muss das Verfahren in seiner Gesamtheit durchgeführt werden.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls
Durchführung des Impuls-Tests durch Kneifen der Hinterpfote der Maus ist von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Maus humane Behandlung erhält. Wenn die Maus nicht auf diesen Reiz zu reagieren, kann dann das Verfahren durchgeführt werden wie geplant. Jedoch sollte die Maus eine notleidende Antwort durch den Impuls-Test angezeigt werden soll, die Maus zurückgegeben werden an die Anästhesie-Kammer für einen weiteren Zeitraum von Zeit und der Test wiederholt, bis eine Reaktion auf den Reiz Test12nicht beachtet wird.
Ebenso die terminal Herz Punktion, gefolgt von der Beseitigung der Anschlüsse zum Herzen unmittelbar nach die terminal Blutprobe gespeichert werden, wenn eine sekundäre Methode der Sterbehilfe das menschliche Opfer der Maus sorgt für. Eine effektive Blutentnahme sollte der Wissenschaftler verwenden, um sicherzustellen eine pumpende Bewegung mit der Spritze, die mit dem Herzschlag der Maus ähnelt ermöglicht maximale Ansammlung von Blut zur Analyse.
Modifikationen und Fehlerbehebung
Wechsel der Organe von Formalin, 70 % Ethanol Lösungen bereitet die Organe für die Einbettung Prozess für histologische Analyse erforderlich. Verschiedenen Storage-Lösungen können erforderlich sein, die Wissenschaftler wählen sollten, um andere Experimente mit den Organen führen. Vor der Analyse ist es wichtig, jede mögliche Auftauen der Organe in den-80 ° C Gefrierschrank für die Erhaltung der Orgel Integrität gespeichert zu begrenzen.
Einsatz von der Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / + Mausmodell minimiert das Auftreten von nicht-Pankreas primäre Tumoren und Erkrankungen13. So ist es wichtig, etwaige Unregelmäßigkeiten, die während der Präparation und Sammlung von Gewebeproben für die Analyse, der Bauchspeicheldrüse und anderen Organen erkennbar sind.
Zukünftige Anwendungen
Ernte der Maus Bauchspeicheldrüse durch Dissektion kann für mehrere Arten der Analyse derselben Probe durchgeführt werden. Die beliebtesten sind, aber sind nicht beschränkt auf, Fluoreszenz-Mikroskopie, Hämatoxylin und Eosin Histologie, Immunhistochemie, Massenspektrometrie und magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie6,7, 14 , 15. Krankheiten wie Diabetes, Pankreatitis und Bauchspeicheldrüsenkrebs können mit den16genannten Techniken untersucht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
MAK bestätigt Unterstützung für diese Arbeit von den National Institutes of Health / National Cancer Institute grant-Nummer - 1R15CA152985-01A1. Dieses Projekt wurde auch von Miami University Undergraduate Research Award Program, die Miami University Doktorat-Studium Möglichkeiten für Scholarship Program und der Miami University Sommer Scholars Program unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Jar | Corning | 3140-150 | The glass jar used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
| Lid of Glass Jar | Corning | 9985-150 | The glass jar lid used in the video has been discontinued. This is its replacement. |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339650 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 9201 | |
| Squeeze bottle | Fisher Scientific | 03-409-10DD | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Formalin | Fisher Scientific | 245-684 | |
| Foam Boards | Therapak | 562908 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 200205SHN | |
| 1 mL 21G Syringes | BD Biosciences | 309624 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 339652 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| Surgical Pads | Fisher Scientific | S67011 | |
| T-Pins Length: 2" | Advance Store Products | X32T-05 | |
| Sterilizing Wipes | Professional Disposables International Inc. | Q85084 | |
| Sharps Container | Fisher Scientific | 14-827-122 | |
| Analytical Balance | Marshall Scientific | ME-AE200 | |
| 4L Dewar | Taylor-Wharton | 4LD | |
| Shallow Wide Mouth Dewar | Fisher Scientific | F3087-V | |
| Floating Microtube Rack | VWR | 60986-100 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile | Fisher Scientific | 10-500-25 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Liquid Nitrogen | Wright Brothers | NIT-60-XX | |
| Mouse Kras Strain | The Jackson Laboratory | OO8179 | |
| Mouse Cre Strain | MMRRC | OOO435-UNC |
References
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