Summary
Dette arbeidet beskriver en protokoll som bruker en komponent-løst tilnærming til å studere sensibilisering til gress pollenallergener i en kohorte av pasienter fra Sør-Kina med allergisk rhinitt og / eller astma.
Abstract
Sensibilisering til gress pollen påfører en global risiko for allergiske luftveis sykdommer. Selv om forebygging er avhengig av lokal undersøkelse av pollen allergenene, er data om dette emnet begrenset i Sør-Kina. Eventuelle tilgjengelige data ble oppnådd ved hjelp av selvrapporterte spørreskjemaer, hudpricktest og totale eller spesifikke IgE-tester ved bruk av rå ekstrakter. Av mange grunner er disse metodene upålitelige. Serum sIgE reaktivitet mot Bermuda gress, Timothy gress og Humulus skandens allergener i en kohorte av pasienter fra Greater Guangzhou (den sørlige Kinas største by og dens utkanter) med allergisk rhinitt og / eller astma ble undersøkt ved hjelp av en fullautomatisert immunanalyseranalysator som en komponent -resolved diagnostics (CRD) verktøy.
For første gang ble det vist en betydelig høy forekomst av Bermuda gres sieg positivitet hos kinesiske sørfolk med allergisk rhinitt og / eller astma. I disse pasientene er en subtil forekomst av sensibiliseringTil Timothy gress og Humulus skandene ble også notert, noe som kan oppstå fra kryssreaktivitet, da de sistnevnte to ikke er vanlige i regionen. Dette ble også støttet av deteksjon av allergenkomponenter.
Fullautomatiserte immunanalysatorer kan gi tilfredsstillende konsistens mellom regioner, laboratorier og institusjoner og over tid. Instrumentets automatikk kan muliggjøre en standardisert deteksjon som ikke ville vært lett avslørt før CRD kom.
Dette er en studie som bruker en CRD-tilnærming til å undersøke sensibilisering til gresspollenallergener i Sør-Kina. Det legger til gjeldende bevis i litteraturen. Fremtidige studier er nødvendig for å validere disse funnene. Imidlertid, selv om CRD er et nyttig verktøy, bør funnene som er gjort med den helautomatiserte immunanalysatoren ikke erstatte andre laboratorieundersøkelser, kliniske evalueringer og legeekspertise.
Introduction
Gress pollen står for nesten 50% av immunoglobulin E (IgE) -relaterte allergier og på grunn av sin luftbårne natur påfører en global risiko for allergiske luftveis sykdommer, spesielt astma og allergisk rhinitt 1 , 2 , 3 , 4 . Forebygging mot gresspollenallergi i en region er avhengig av informasjon om lokal distribusjon av pollen allergenene. Dessverre varierer spekteret av sensibiliserende allergener fra sted til sted-en observasjon kjent som regional spesifisitet.
I Kina er et stort østasiatisk territorium, regional spesifisitet av gress pollen sensibilisering ytterligere komplisert av begrensede data som nå er tilgjengelige fra den sørlige delen av dette landet de siste tiårene 5 . En slik tøffhet i data har ført til vanskeligheter med å vise den generelle gress pollen sensiOpptak i dette store landet 6 . I tillegg ble de svært begrensede dataene fra kinesiske sørfolk i stor grad hentet fra selvrapporterte spørreskjemaer, hudprøveprøver (i stedet for laboratorie serumtester), totale IgE-målinger (i stedet for allergen-spesifikk IgE (sIgE)) og sieg-deteksjon til allergener ( I stedet for allergenkomponentmolekyler).
Selvrapporteringen av allergiske symptomer kan være upålitelig når det gjelder spesielle allergener. Hudpricktester, selv om de er allment tilgjengelige, involverer bruk av ikke-standardiserte, rå allergenekstrakter, som selv kan inneholde andre sensibiliserende komponenter som forstyrrer utfallstolkningen. Pålitelighetens pålitelighet er også kritisk avhengig av dyktig manipulasjon av allergikere eller spesialistsykepleiere, nylig bruk av histamin og pasientoverensstemmelse (noen ganger svært vanskelig for små barn). Totalt IgE er nyttig for screening av en allergi, men bestemmer ikke fornuftig detE støtende allergener hos en pasient. Dessuten inneholder nesten alle allergener en rekke allergenkomponentmolekyler. Sensibilisering til hovedkomponentene ( dvs. Der p 1 og Der p 2 fra husstøvmider) kan foreslå en "ekte" allergi (allergi mot et bestemt allergen, i stedet for falsk positivitet på grunn av kryssreaksjoner med andre allergener), men sensibilisering Til visse ( dvs. den kryssreaktive Der p 10, et tropomyosin) må ikke 7 .
Før komponentoppløst diagnose (CRD) ble introdusert, forhindret disse skuffende tilbakeslagene allergenstudier i Kina. CRD oppdager nøyaktig komponentene i et allergen ved å bruke rekombinante eller rensede allergenmolekyler, og derved gjør målingen lett kvantifiserbar og karakteriserbar 8 . I de siste tiårene har allergi studier ofte brukt rå ekstrakter av allergener som uunngåelig inneholder en rekke irrelevante komponenter. Mange av disse coMponents er inerte, men noen ganger kan noen føre til å forstyrre positive reaksjoner. Bruken av rekombinante eller rensede allergenmolekyler i CRD kan omgå dette og gir derfor bedre testnøyaktighet. Når det behandles i mikroarrays, skjermes en CRD-tilnærming raskt eller identifiserer sensibilisering til hundrevis av allergenmolekyler i individuelle fag. En velfungert CRD-studie om gress pollensensibilisering i Sør-Kina mangler for tiden. Ideelt sett bør en slik studie inneholde en lokal befolkning med betydelig geografisk dekning, redegjøre for gres pollen som vanligvis rapporteres i Kina, og ta opp de tekniske aspektene som er nevnt ovenfor. For å nå et praktisk nivå av klinisk relevans og for å lette rekruttering av serumprøver, kan tidlig undersøkelse av sensibilisering til gress pollen som inhalasjonsallergener også være fokusert på pasienter med allergiske respiratoriske forstyrrelser, snarere enn på den generelle befolkningen.
Dette arbeidet beskriver en metodeBrukes til å teste serumgjenkjen-sivitet mot bermuda gress, timothy gress og humulus skandin hos pasienter fra Greater Guangzhou (Sør-Kinas største by og utkanten) med allergisk rhinitt og / eller astma ved hjelp av CRD-tilnærmingen 5 . Disse funnene på sensibilisering til disse subtropiske og tempererte gress pollenene i Sør-Kina legger til viktige bevis for det som for øyeblikket er i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieprotokollen, inkludert bruk av human serumprøve, ble godkjent av etikkutvalget, første tilknyttet sykehus i Guangzhou Medical University. Alle deltakerne tilbød skriftlig informert samtykke, enten uavhengig eller via foreldrene deres (i tilfelle barn). Protokollen er registrert online (Kinesisk klinisk prøveregister, Reg.nr .: ChiCTR-DCC-13004003, se http://www.chictr.org/cn/).
1. Identifikasjon av studiebefolkningen
MERK: Allergi Informasjonsregisteret for Statens nøkkellaboratorium for respiratoriske sykdommer (AIR-SKLRD) er den primære kilden til pasientrekruttering, fordi AIR er den mest veldokumenterte store databasen av pasienter for allergenstest i Sør-Kina 9 , 10 . AIR har lagret serumprøver av pasienter i nesten et tiår. Kort fortalt ble disse lagrede prøver fremstilt ved sentrifugering 5 ml oF phlebotomized venøst blod i 10 minutter ved 3000 xg og utvinning av supernatanten. Serumblandingene ble plassert i -80 ° C kjøleskap for langvarig lagring. Prøver som møtte pasientens inkluderingskriterier var klare til bruk for alle testene i den foreliggende studien.
- Fra AIR-databasen, hent data om pasienter med allergisk rhinitt og / eller astma som gjennomgikk serumtester for gress allergen sIgE mellom januar 2013 og juni 2015, den forhåndsdefinerte studietiden.
- Velg pasienter med mild til moderat allergisk rhinitt og / eller astma i henhold til Allergic Rhinitis og Impact on Astma (ARIA) 11 og Global Guinea Initiative 12 . Tilordne dem som "studiegruppen".
- Unngå pasienter med ufullstendige medisinske journaler, de som mistes for å følge opp, de som nekter å gi informert samtykke om bruk av deres serumprøver for vitenskapelige formål, de med identifisert jegMmunodeficiency, de som for øyeblikket er på immunterapi eller immunmodulerende midler, eller de som har funnet parasittiske infeksjoner.
- Velg en moderne kohort av pasienter med ikke-respiratoriske allergier ( dvs. eksem, allergisk dermatitt og matallergi) i henhold til de samme ekskluderingskriteriene og tilordne dem som "kontrollgruppen".
- Sørg for at serumprøver ble samlet før noen resept eller behandlinger ble gitt for å minimere forstyrrende effekter på laboratoriefunnene. Ekskluder noen serumprøve som ikke oppfyller dette kravet.
- Sørg for at alle fag er fastboende fra alle deler av Stor-Guangzhou ( dvs. født eller har bodd der i mer enn 10 år).
2. Studiestrøm og målinger av interesse
- Hent serumprøver av kvalifiserte pasienter fra bio-banken. For å teste en allergen / allergen komponent, bruk 140 μL serum (inkludert 100 μL å fylleOpp den døde plassen).
MERK: Det maksimale totale serumvolumet som trengs for hver pasient i denne studien er: 3 spesifikke allergener og 8 allergenkomponenter, sIgE = 140 μL * 11 = 1,540 μL. - Når du bruker dette instrumentet, må du først prøve serumprøver for sIgEs til hele allergener av Bermuda gress, Timothy gress og Humulus skandier . Følg instruksjonene i avsnitt 3.
MERK: Disse pollensene ble valgt for målingene fordi Bermuda gress 13 , 14 , 15 og Humulus skandene 16 har blitt rapportert mye i Kina, mens Timothy gress 17 , 18 , 19 er en typisk planteart som lever i miljøer fra tropisk til temperert Soner og er mest studert over hele verden. - For det andre, test serumprøver identifisert i trinn 2.3 å haSuger til hele allergener for tilstedeværelse av sieg til allergenbestanddeler av Bermuda [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p4 (g208), Phl p5 (g215), Phl p6 (g209) ), Phl p 7 (g210), Phl p 11 (g211) og Phl p12 (g212)] og kryssreaktive karbohydratdeterminanter [CCD (o214)]. Følg instruksjonene i avsnitt 3.
3. Fullautomatisert testprosedyre ved hjelp av immunanalysesystemet
MERK: Hele prosedyren for allergen sieg test, som er fullt automatisert og har blitt beskrevet andre steder 7 , 8 , 9 , 10 , følger produsentens protokoll.
- Start den helautomatiserte immunanalysatoren ( f.eks. ImmunoCAP1000) og bruk den til å utføre immunoassay gjennom hele studien. Slå på den innebygde datainformasjonen (IDM) -datamaskinen.
MERK: Immunanalysen analYzer er rutinemessig i standby-modus. - Med "Primary Power" på, slå på "System Power" og vent 3 min til den innebygde programvaren starter. Klikk på "Load Rinse Solution" og "Load Washing Solution."
- Tilsett 140 μL serum til et hetteglass for hver allergen / allergenkomponent test. Merk hvert hetteglass som inneholder 140 μl serum med et identifikasjonsnummer unikt for hver pasient.
- Fra IDM-grensesnittet, utfør følgende trinn ved å klikke på menyen.
- Kontroller "Request List" -vinduet på IDM for å sikre at "sIgE" er testmetoden som er valgt.
- Legg prøverørene i prøveholderene og kvalitetskontrollrørene i kvalitetskontrollstativene, med strekkoder.
MERK: For hver pasient ble testingen opprinnelig planlagt for sIgE til 3 spesifikke allergener og 8 allergenkomponenter, eller 346 * 11 (3 806) prøverør. For hvert prøverør, 3 kvalitetskontrollrørSom inneholder lave, middels og høye nivåer av kontroll (se Materialebordet for detaljer) ble matchet. Til slutt ble bare 58 pasienter som testet positivt i den primære testen (trinn 2.3), undersøkt i sekundærprøven (trinn 2.3). Lastingen av rør kan settes automatisk på datakonsollen. - Velg "Last Reagents" i "Assay Processing" skjermen. Fullfør lastingen av prøven og kvalitetskontrollstativene, utviklingsløsningen, konjugatene, kalibratorene, bæreren, pipettespissene, stoppløsningen og vaskeoppløsningen i henhold til "Loadlist" (se Materialebordet for detaljer).
- I "Load and Start," trykk "OK".
MERK: På slutten av målingen vises resultatene på IDM. - Fra IDM-grensesnittet, velg dataene som skal eksporteres. Klikk på "Meny", "Godkjenn" og "Lagre som", og eksporter de sIgE måle resultatene som en regnearkfil. Importer regnearkfilen til en statistisk programvare ( f.eks. SPSS) 10 . Ved hjelp av en bestemt modul for Spearmans koeffisienter fra SPSS-menyen, analyser korrelasjonene i sensibilisering mellom disse gress pollensene (positive sIgE til helt allergen) og pollenkomponenter (positive sIgE til allergenmolekyler).
4. Definisjon av sIgE Reaktivitet
MERK: For et ufortynnet serumprøve er området for spesifikk IgE-måling 0,35 til 100 kU / L.
- Fortynn prøvene med sIgE-verdier> 100 kU / L 1: 5 og re-assay. Når verdien fortsatt er høyere enn 100 kU / L, fortsett med ytterligere fortynninger til et sluttpunktnivå opp til 1000 kU / L er nådd.
- Basert på terskelverdien på 0,35 kU / L, vurder et sIgE-nivå som overstiger 0,35 kU / L til å være positivt 5 , 7 , 10 . Vurder den reaktiveKlasse 2 (≥0,70 og <3,50 kU / L), klasse 3 (≥3,50 og <17,50 kU / L), klasse 4 (≥0,70 og <0,70 kU / l) 17,50 og <50,00 kU / L), klasse 5 (≥50,00 og <100,00 kU / L) og klasse 6 (≥ 100,00 kU / L).
5. Statistisk analyse
- Analyser dataene med statistisk programvare ( f.eks. SPSS) 10 . Rapporter kvantitative data som gjennomsnittlig og standardavvik, de kvalitative dataene som median og interkvartile intervaller (IQR), og de kategoriske dataene som andelen positive resultater.
- Bruk en chi-kvadratprøve for mellomgruppens sammenligning av proporsjoner, en uparget t-test for kvantitative data og en rangsumprøve for kvalitative data.
- Bruk Pearson test for korrelasjonsanalyser mellom parametriske data, med korrelasjonskoeffisientene uttrykt som "r" og Spearmans test for ikke-parametriske verdier, med tHan korrelasjonskoeffisientene uttrykt som " r s ." Vurder statistisk betydning for å være når P -verdier <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den fullt automatiserte immunanalysatoranalysatoren anvendt i denne studien har en fastfasestruktur dekket med kovalent koblingsallergener eller allergenkomponenter som reagerer med molekylene av interesse (sIgE) i serumprøver fra pasienten. Med et automatisk program vaskes analysatoren av alle ikke-spesifikke IgE med 150 μl skylløsning og gjentar dette 5 ganger. Deretter legger det til enzymmerkede anti-IgE antistoffer (50 μL) for å generere et kompleks. Det enzymmerkede anti-IgE-antistoffet (konjugat) er et sekundært antistoff som binder til et spesifikt IgE. Ubundne anti-IgE-antistoffer elimineres ved vasking med 150 μl vaskeoppløsning (gjentatt 3 ganger). Det bundne komplekset behandles med et utviklingsmiddel (50 μl) i 9 minutter ved 37 ° C. Utviklingsmiddelet er et enzymfordøyende middel som kutter av alle bundet anti-IgE-antistoffer. Sistnevnte gir fluorescens under alkalisk tilstand. Reaksjonen stoppes medTilsetning av alkalisk stoppløsning. Etter dette komprimerer instrumentet fastfasestrukturen for å klemme ut eluatet og måle fluorescensen av det resulterende eluatet ved en bølgelengde på 470 nm. Fluorescensen er lineært korrelert med det absolutte nivå av analysemolekylene av interesse i eluatet. En høyere fluorescensverdi betyr mer sieg i serumprøven. For å tolke testresultatene, forvandler systemet automatisk svarene til prøver til konsentrasjoner ved hjelp av en kalibreringskurve. Måldataene overføres elektronisk til IDM-programvaren, som integrerer funksjoner for beregning av analyseresultater, beregning av statistikk og resultatrapportering.
Etter inkluderings- og ekskluderingskriteriene, undersøkte den foreliggende studien serum fra 346 pasienter. Studiegruppen inkluderte 78 pasienter med allergisk rhinitt alene, 92 med astma alene og 88 sammenhengendeLider av astma og rhinitt. Kontrollgruppen inkluderte 88 pasienter med ikke-respiratoriske allergier. Disse pasientene var i alderen 1-87 år og ble bekreftet å være fastboende fra alle deler av Greater Guangzhou, målområdet for studien. Alle studiegrupper og kontrollgruppen var sammenlignbare i demografiske og sosiale egenskaper, inkludert kjønn, alder og familiehistorie. Av pasientene i studiegruppen ble 22,5% testet positivt på Bermuda-gress, 13,6% til Timothy-gress og 7,0% for Humulus-skandene . I studiegruppen var følsomhetsgraden til gresk pollen mye høyere enn i kontrollgruppen ( tabell 1 ). Alle Bermudas gress-sieg-negative pasienter var også negative for Timothy gress og Humulus skandene . Det er interessant å merke seg at pasienter med allergisk rhinitt og / eller astma demonstrerte en bemerkelsesverdig høyere sensitiviseringsgrad for bermuda gress (n = 58, 22,5%) enn de med andre allergier (n = 4, 4,5%).
Figur 1 ). Bermudas greske reaktivitetsnivåer viste en signifikant korrelasjon, med sjanser for positivitet til andre gresspollen IgEer ( r s = 0.669, P <0.001).
Timothy gress sensibilisering ble ytterligere vurdert av SIgE til Timothy gress komponenter. Blant de 35 timothy gress-positive pasienter var den mest oppdagede allergenkomponenten Phl p 4 (100%, 35/35), etterfulgt av Phl p 1(17,1%, 6/35). Tre pasienter hver (3/35, 8,6%) var positive for noen av Phl p 5, 6, 7, 11 og 12 ( tabell 2 ). Serum Phl p 4 sIgE nivåer korrelerte sterkt med totalt Timothy gress allergen og CCD sIgE nivåer ( r s = 0,941 og 0,928, P <0,001, Tabell 3 ). 41,4% (24/58) av Bermuda-gresspositive pasienter og 68,6% (24/35) av Timothy-gress-sensibiliserte pasienter var svært positive for CCD. Spearmans rangkorrelasjonsanalyse viste en signifikant tilknytning i sensibilisering mellom CCD og andre gressallergener ( Tabell 3 ).
Figur 1: Kombisensibilisering blant pasienter som er positive for Bermuda Grass SIgE.
Denne figuren viser prosentandelen av pasienter med forskjellige klasser av sIgE reaktivitet mot Bermuda gress (n = 58) og en sammenhengAnt sensibilisering til Timothy gress, Humulus skandene, CCD og andre gress allergen komponenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Vurder av positive tester [% (n / pasienter)] | |||
| Bermuda gress | Timothy gress | Humulus skandene | |
| Pasienter med AR og / eller AS | 22,5% (58/258) †† ‡ | 13,6% (35/258) † | 7,0% (18/258) |
| Pasienter med AR | 21,8% (17/78) †† | 10,2% (8/78) | 7,7% (6/78) |
| Pasienter med AS | 22,8% (21/92)†† | 14,1% (13/92) † | 5,4% (5/92) |
| Pasienter med AR og AS | 22,7% (20/88) †† | 15,9% (14/88) | 8,0% (7/88) |
| Alder | |||
| <14 år eller yngre | 18,6% (8/43) | 14,0% (6/43) | 7,0% (3/43) |
| > 4 år | 23,3% (50/215) | 13,5% (29/215) | 7,0% (15/215) |
| Kjønn | |||
| mann | 25,7% (35/136) | 13,9% (19/136) | 7,4% (10/136) |
| Hunn | 18,8% (23/122) | 13,1% (16/122) | 6,6% (8/122) |
| Pasienter med annen allergi | 4,5% (4/88) ** | 1,1% (1/88) ** | 0 * |
Tabell 1: Pasienter med sIgE-positive test for Bermuda Grass, Timothy Grass og Humulus skandiner Basert på sykdomsenhet og demografiske detaljer. En høyere andel pasienter med allergiske respiratoriske sykdommer var positive for Bermuda gress (χ 2 = 14,35, P <0,001), Timothy gress (χ 2 = 10,88, P <0,001) og Humulus skandene (χ 2 = 5,14, P = 0,02 ) Mot de andre allergikontrollene ( ** P <0,01, * P <0,05). Andelen pasienter med en positiv Bermuda gresstest var bemerkelsesverdig høyere enn andelen for Timothy gress ( ‡; P <0,05) og Humulus-skandene ( †† P <0,01). Andelen pasienter med positiv Timothy gresstest var høyere enn Humulus-skandene ( † P <0,05). Andelen positive tester på Bermuda gress, Timothy gress og Humulus skandene sIgE varierte ikke signifikant mellom de mindre og voksne gruppene (x 2 = 0,07, P = 0,79; x 2 = 0,06, P = 0,80; x 2 = 0,11, P = 0,74). Priser på gress pollen følsomhetene var ikke statistisk forskjellig mellom menn og kvinner (χ 2 = 1,338, P = 0,25, x 2 = 0,063, P = 0,80; x 2 = 0,38, P = 0,54). Tilsvarende ble det ikke indikert signifikante forskjeller i følsomhetsrate mellom rhinitt og astmapasienter (x 2 = 0,030, P = 0,985; x 2 P = 0,558; X 2 = 0,528, P = 0,768; henholdsvis).
| Pasienter (%) | Phl p 4 | Phl p 1 | Phl p 5 | Phl p 6 | Phl s. 11 | Phl p 7 | Phl s. 12 | |
| 28 (80,0%) | + | |||||||
| 4 (11,4%) | + | + | ||||||
| 1 (2,9%) | + | + | + | + | + | + | ||
| 2 (5,7%) | + | + | + + | + | + | + | ||
| Total | 35 (100%) | 6 (17,1%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | 3 (8,6%) | |
| SIgE a (kU / L) | 0,52, 0,06-2,02 | 0,02, 0,01-0,10 | 0,04, 0,03-0,24 | 0,12, 0,03-0,34 | 0,05, 0,02-0,27 | 0,03, 0,02-0,36 | 0,10, 0,04-0,28 |
Tabell 2: Timothy Grass Sensitization i henhold til den positive positiviteten og nivåene av Timothy Grass Components (N = 35). +, Positive tester; A , sIgE nivåer (kU / L) vises som median og IQR. Av de 35 timothy gress-sieg-positive pasientene var 80,0% bare Phl p4-positive, mens 11,4% var positive til Phl p4 eller Phl p1.
| allergen | Bermuda | Timothy | Humulus skandene | CCD |
| Bermuda | - | 0,709 ** | 0,682 ** | 0,565 ** |
| Cyn d 1 | 0,583 ** | 0,787 ** | 0,751 ** | 0,865 ** |
| Timothy | 0,709 ** | - | 0,921 ** | 0,856 ** |
| Phl p 4 | 0,645 ** | 0,941 ** | 0,886 * | 0,928 ** |
| Phl p 1 | 0,616 ** | 0,681 ** | 0,712 ** | 0,507 ** |
| Phl p 5 | 0,46 | 0,273 | 0,590 * | 0,624 * |
| Phl p 6 | 0.445 | 0,306 | 0,583 * | 0,569 |
| Phl p 7 | 0,681 * | 0,481 | 0,632 * | 0,531 |
| Phl s. 11 | 0,589 * | 0,372 | 0,620 * | 0,568 |
| Phl s. 12 | 0,671 * | 0.411 | 0,565 | 0,446 |
| Humulus skandene | 0,682 ** | 0,921 ** | - | 0,853 ** |
Tabell 3: Korrelasjonskoeffisienter † for positivitet mellom CCD og gresspollen allergener. † presenteres som korrelasjonskoeffisienten r s ; Spearmans korrelasjonsanalyser ble utført for dette ikke-parametriske datasettet. * P <0,05, ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fullautomatiserte immunanalysatorer kan gi tilfredsstillende konsistens mellom regioner, laboratorier og institusjoner og over tid. En slik automatisk prosedyre har vist seg å gi vesentlig støtte til benkforskning og kliniske studier, muliggjøre standardisert deteksjon av mange allergener og / eller allergenkomponenter, og identifisere sannsynlig allergen-kryssreaktivitet som ikke ville blitt lett avslørt før adventen av CRD-er. Videre kan hele testprosedyren fullføres med streng kvalitetskontroll, slik at det er mulig å gjennomføre høye gjennomføringsmetoder, slik det kreves i en undersøkelse av et stort geografisk område. Selv om testprosedyren hovedsakelig drives av en datakonsoll, bør det opplyses flere kritiske problemer. Det er obligatorisk at instrumentet brukes i streng overensstemmelse med brukerhåndboken; Enhver aberrasjon kan resultere i unødvendige testfeil, mekanisk skade eller personskade fra laserstråle eller høy elektrisk spenning. Alltid enSikker på at en riktig og riktig kalibreringskurve er lagret i systemet, da dette er knyttet til testens nøyaktighet. Ellers må sIgE-konsentrasjonen av en spesifisert kalibrator måles før serumprøveprøver. Etterpå kan systemet automatisk beregne og lagre kalibreringskurven for senere bruk. Som med andre laboratorieteknikker er det også viktig å observere sikkerheten ved human serummanipulering for å beskytte teknikere mot infeksjoner og for å unngå forurensing av miljøet.
For første gang viste denne undersøkelsen for første gang ved bruk av en fullautomatisert immunanalyseranalysator som en CRD-tilnærming, en betydelig prevalens av Bermuda gres sgg-positivitet (22,5%) hos pasienter med allergisk rhinitt og / eller astma i Guangzhou, Sør-Kina. Siden Timothy gress og Humulus skandene ikke er vanlige, selv ikke-eksisterende, i Guangzhou, positiviteten av Timothy gress (13,6%) og Humulus scandens sIgE (7,0%) mAy skyldes kryssreaktivitet blant gress pollen.
Ved å analysere gresspollenallergener ble det tydelig vist at alle Timothy gress IgE-positive pasienter også var positive for det spesifikke Timothy gressantigen Phl p 4. Svært få (17,1%) testet positivt til Phl p 1, som var overraskende forskjellig fra data I Europa, hvor positiviteten til Phl p 1 er mye høyere enn Phl p 4 18 , 20 , 21 . Siden Phl p 1 er hovedkomponenten av Timothy-gress, kan den overordnede frekvensen av Phl p 4 positivitet over Phl p 1 i denne studip populasjonen også foreslå sannsynlig kryssreaktivitet annet enn "ekte" sensibilisering fordi Phl p 4 deler en strukturell likhet Med CCD og en rekke andre allergener, inkludert trær, grønnsaker og tropiske frukter 19 , 22 , 23, 24 . Den kliniske relevansen av denne observasjonen kan være at flertallet av Timothy-gress-positive pasienter i denne studien aldri burde ha blitt rådet til å motta Timothy gressimmunterapi, som for tiden bruker Phl p 1 25 .
Flere begrensninger av studiemetoder og teknikker må nevnes. For det første, siden opptil 3 forskjellige kalibratorstrimler kan plasseres i en pipette / reagensbakk i immunanalysator analysatoren, kan det maksimalt tre testbatcher kjøres samtidig. Når en tung arbeidsbelastning kreves, som i en større regional undersøkelse, tar det fortsatt betydelig tid å behandle. For det andre er kryssreaktiviteten med humant IgA, IgD, IgM og IgG ikke-eksisterende ved fysiologiske konsentrasjoner ved bruk av analysatoren fra denne studien, slik at andre undersøkelsesmetoder er nødvendige når kryssreaktivitet med disse immunoglobuliner er opptatt. Tredje, til tross for raffinement av devicE, funnene som ble gjort med den helautomatiserte immunoassayanalysatoren, bør ikke erstatte andre laboratorieundersøkelser, kliniske evalueringer og legeekspertise når en endelig diagnose blir utført. For det fjerde, på grunn av den sentrale introduksjonen av allergen-CRD i Kina, er flere kommersielle produkter av subtropiske gress pollenkomponenter utilgjengelige eller ikke godkjent for forskning til nylig. Derfor bruker denne teknikken som en CRD-tilnærming til allergener, i hovedsak avhengig av den kommersielle tilgjengeligheten av produktforsyninger fra produsenten for spesifikk bruk i en region. I tropiske og subtropiske regioner med allestedsnærværende kompleksitet av plante pollens, kan en CRD studie være utilstrekkelig og vanskelig på grunn av mangel på tilsvarende allergenprodukter for testene. Et slikt dilemma kan i stor grad kompromittere effektiviteten av denne teknikken.
Likevel, til det siste av vår kunnskap, er dette en banebrytende studie som bruker CRD-tilnærmingen tO undersøke sensibilisering til gress pollen allergener i Sør-Kina. Videre studier kan fortsette i denne vene og validere disse funnene.
Hittil har teknikker som bruker den helautomatiske immunoanalysatoren blitt akseptert som gullstandarden for in vitro allergen sIgE-tester 26 , 27 . Gitt de svært begrensede dataene om allergenfølsomhet innenfor det store territoriet i Kina, kan store utvalgsstudier som bruker den fullautomatiserte immunanalysen som en CRD-tilnærming fylle hullene og legge til bevisene som er tilgjengelige i dette feltet. Det er viktig å merke seg at slike studier, vanligvis multisenter og landsomfattende samarbeid, kan nødvendiggjøre nettverk av immunoassays basert på en standardprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Yueming Su for hans hjelp med å forberede figuren. Denne studien ble finansiert av Guangdong-fonden for vitenskap og teknologi (prosjekt nr .: 2014A020212352), Guangzhou Education Bureau (1201630044; 1201630393) og National Natural Science Foundation of China (NSFC 81572063; NSFC 81601394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImmunoCAP 1000 Instrument | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia Information Data Manager Software Package | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| Software Package, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 (Bermuda grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 (Timothy grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 (Japanese Hop) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 Cross-reacting carbohydrate determinants (CCDs) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| Specific IgE Conjugate 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| Specific IgE Calibrator Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| Specific IgE Curve Control Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| Specific IgE Anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Negative Control | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control L | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control M | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control H | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| Development Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| Stop Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| Washing Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| Maintenance Solution Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
References
- Scadding, G. K. BSACI guidelines for the management of allergic and non-allergic rhinitis. Clin Exp Allergy. 38 (1), 19-42 (2007).
- Pollart, S. M., Reid, M. J., Fling, J. A., Chapman, M. D., Platts-Mills, T. A. Epidemiology of emergency room asthma in northern California: association with IgE antibody to rye grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 82 (2), 224-230 (1988).
- Wang, Q. Lower airway inflammation and hyperresponsiveness in non-asthmatic patients with non-allergic rhinitis. J Thorac Dis. 7 (10), 1756-1764 (2015).
- Ma, Y. The link between mold sensitivity and asthma severity in a cohort of northern Chinese patients. J Thorac Dis. 7 (4), 585-590 (2015).
- Luo, W. Major grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Mol Immunol. 78, 105-112 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, L. Prevalence of allergic rhinitis in china. Allergy Asthma Immunol Res. 6 (2), 105-113 (2014).
- Zeng, G., Zheng, P., Luo, W., Huang, H., Wei, N., Sun, B. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Mol Immunol. 74, 1-9 (2016).
- Kleine-Tebbe, J., Matricardi, P. M., Hamilton, R. G. Allergy work-up including component-resolved diagnosis: how to make allergen-specific immunotherapy more specific. Immunol Allergy Clin North Am. 36 (1), 191-203 (2016).
- Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, southern China. PLoS One. 9 (5), e94776 (2014).
- Zeng, G. Component-resolved diagnostic study of Dermatophagoides pteronyssinus major allergen molecules in a southern Chinese cohort. J Investig Allergol Clin Immunol. 25 (5), 343-351 (2015).
- Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA). Management of Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma Pocket Guide. , Available from: http://www.whiar.org/docs/ARIA_PG_08_View_WM.pdf (2015).
- Global Initiative for Asthma (GINA). Pocket Guide for Asthma Management and Prevention. , Available from: http://ginasthma.org/wp-content/uploads/2016/01/GINA_Pocket_2015.pdf (2015).
- Liu, J., Guo, A., Guo, H. Morphological variation and types of Cynodon dactylon. Acta Prataculture Sinica. 12 (6), 99-104 (2003).
- Zhang, H., Xi, J. Study on the germplasm resource and ecological characteristics of wild carpet grass (Axonopus compressus) in Guangdong. Grassland and Turf. 13 (1), 25-28 (2005).
- Kao, S. H., Su, S. N., Huang, S. W. Sub-proteome analysis of novel IgE-binding proteins from Bermuda grass pollen. Proteomics. 5 (14), 3805-3813 (2005).
- Ouyang, Y. H., Zhang, D. S., Fan, E. Z., Li, Y., Zhang, L. Correlation between symptoms of pollen allergic rhinitis and pollen grain spreading in summer and autumn. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Waike Zazhi. 47 (8), 623-627 (2012).
- Westritschnig, K. Analysis of the sensitization profile towards allergens in central Africa. Clin Exp Allergy. 33 (1), 22-27 (2003).
- Rossi, R. E., Monasterolo, G., Monasterolo, S. Measurement of IgE antibodies against purified grass-pollen allergens (Phl p 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, and 12) in sera of patients allergic to grass pollen. Allergy. 52 (12), 1180-1185 (2001).
- Zafred, D., Nandy, A., Pump, L., Kahlert, H., Keller, W. Crystal structure and immunologic characterization of the major grass pollen allergen Phl p 4. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 696-703 (2013).
- Chabre, H. Molecular variability of group 1 and 5grass pollen allergens between Pooideae species: implications for immunotherapy. Clin Exp Allergy. 40 (3), 505-519 (2010).
- Mari, A. Skin test with a timothy grass (Phleum pratense) pollen extract vs.IgE to a timothy extract vs. IgE to rPhl p 1 rPhl p 2, nPhl p 4, rPhl p 5, rPhl p 6, rPhl p 7, rPhl p 11, and rPhl p 12: epidemiological and diagnostic data. Clin Exp Allergy. 33 (1), 43-51 (2003).
- Grote, M., Stumvoll, S., Reichelt, R., Lidholm, J., Rudolf, V. Identification of an allergen related to Phl p 4, a major timothy grass pollen allergen, in pollens, vegetables, and fruits by immunogold electron microscopy. Biol Chem. 383 (9), 1441-1445 (2002).
- Andersson, K., Lidholm, J. Characteristics and immunobiology of grass pollen allergens. Int Arch Allergy Immunol. 130 (2), 87-107 (2003).
- Tripodi, S. Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: implications for specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 129 (3), 834-839 (2012).
- Stumvoll, S., et al. Purification, structural and immunological characterization of a timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen Phl p 4, with cross-reactive potential. Biol Chem. 383 (9), 1383-1396 (2002).
- Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Ann Allergy Asthma Immunol. 99 (1), 34-41 (2007).
- Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (IgE) tests performed by different assay systems. J Allergy Clin Immunol. 121 (5), 1219-1224 (2008).
