Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bytbar akustisk och optisk upplösning Photoacoustic Microscopy for Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55810
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Här visas ett system för akustisk upplösning (AR) och optisk upplösning (OR), fotoakustisk mikroskopi (AR-OR-PAM) som kan användas för både högupplösande avbildning vid grunt djup och djupvävnad med låg upplösning på samma prov in vivo .

Abstract

Photoacoustic microscopy (PAM) är en snabbväxande invivo imagingmodalitet som kombinerar både optik och ultraljud, vilket ger penetration utöver den optiska medelfria vägen (~ 1 mm i huden) med hög upplösning. Genom att kombinera optisk absorptionskontrast med ultraljudets höga rumsliga upplösning i en enda modalitet kan denna teknik penetrera djupa vävnader. Fotoakustiska mikroskopiosystem kan antingen ha en låg akustisk upplösning och sond djupt eller en hög optisk upplösning och sond nedåt. Det är utmanande att uppnå stor rymdupplösning och stor djupinträngning med ett enda system. I detta arbete presenteras ett AR-OR-PAM-system som kan användas både i högupplösande avbildning på grunda djup och med lågupplösning av djupvävnad av samma prov in vivo . En lateral upplösning på 4 μm med 1,4 mm bilddiameter med optisk fokusering och en sidoprocess på 45 μm med 7,8 mm bilddiameter med akustisk fokusering lyckadesDemonstreras genom att använda det kombinerade systemet. Här utföres in vivo avbildning av blodkärlsvasculatur för att visa sin biologiska avbildningskapacitet.

Introduction

Högupplösta optiska bildhanteringsmodaliteter, såsom optisk koherens-tomografi, konfokalmikroskopi och multiphotonmikroskopi, har många fördelar. Den rumsliga upplösningen minskar emellertid signifikant då bilddjupet ökar. Detta beror på den diffusa naturen av ljustransport i mjukvävnad 1 , 2 . Integreringen av optisk excitering och ultraljuddetektering ger en lösning för att övervinna utmaningen med optisk bildbehandling med hög upplösning i djupa vävnader. Photoacoustic microscopy (PAM) är en sådan modalitet som kan ge djupare avbildning än andra optiska bildhanteringsmodaliteter. Det har framgångsrikt använts för in vivo strukturell, funktionell, molekylär och cellbildning 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 studier genom att kombinera den starka optiska absorptions kontrasten med den höga rumsliga upplösningen från ultraljud.

I PAM bestrålar en kort laserpuls vävnaden / provet. Ljusabsorptionen av kromoforer ( t.ex. melanin, hemoglobin, vatten etc. ) resulterar i en temperaturökning, vilket i sin tur resulterar i produktion av tryckvågor i form av akustiska vågor (fotoakustiska vågor). De genererade fotoakustiska vågorna kan detekteras av en bredbandig ultraljudstransduktor utanför vävnadsgränsen. Användning av svag optisk och stram akustisk inriktning kan bildas med djupvävnad i akustisk upplösningsfotoakustisk mikroskopi (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . I AR-PAM, en sidoprocess på 45 μm och ett bilddjup upp till 3 mm har visats 15 . För att lösa enskilda kapillärer (~ 5 μm) akustiskt krävs ultraljudsgivare som arbetar med> 400 MHz centrala frekvenser. Vid sådana höga frekvenser är penetrationsdjupet mindre än 100 pm. Problemet som orsakas av hårt akustisk fokusering kan lösas med tät optisk fokusering. Optisk upplösning fotoakustisk mikroskopi (OR-PAM) kan lösa enskilda kapillärer, eller till och med en enda cell 17 , och en lateral upplösning av 0,5 μm har uppnåtts 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Användningen av en fotonisk nanojet kan hjälpa till att uppnå en upplösning utöver den diffraktion begränsade resolutioN 25 , 26 . I OR-PAM är penetrationsdjupet begränsat på grund av ljusfokusering och det kan bilda upp till ~ 1,2 mm inuti den biologiska vävnaden 23 . Därför kan AR-PAM bilden djupare, men med en lägre upplösning, och OR-PAM kan bild med mycket hög upplösning, men med begränsat bilddiameter. Bildhastigheten för AR- och OR-PAM-systemet beror huvudsakligen på pulsrepetitionshastigheten hos laserkällan 27 .

Kombinera AR-PAM och OR-PAM kommer att vara till stor nytta för applikationer som kräver både högupplösning och djupare bildbehandling. Liten ansträngning har gjorts för att kombinera dessa system tillsammans. Vanligtvis används två olika bildskannrar för bildbehandling, vilket kräver att provet flyttas mellan båda systemen, vilket gör det svårt att utföra in vivo bildbehandling. Imidlertid möjliggör hybridbildning med både AR och OR PAM bildbehandling med skalbara resolutioner aNd djup. I ett tillvägagångssätt används en optisk fiberbunt för att leverera ljus för både AR- och OR-PAM. I detta tillvägagångssätt används två separata lasrar (en högenergilaser vid 570 nm för AR och en låg-energi, högrepetitionshastighetslaser vid 532 nm för OR), vilket gör systemet obekvämt och dyrt 28 . OR-PAM-laservåglängden är fast, och många studier, t.ex. på syremättnad, är inte möjliga med detta kombinerade system. Jämförande studier mellan AR och OR PAM är inte heller möjliga på grund av skillnaden i laservåglängder mellan AR och OR. Dessutom använder AR-PAM ljusfältbelysning; Därför begränsar starka bildakustiska signaler från hudytan bildkvaliteten. Av detta skäl kan systemet inte användas för många bioimaging applikationer. I ett annat tillvägagångssätt för att utföra AR och ELLER PAM, skiftas det optiska och ultraljudsfokus, vilket gör att fokuseringen på ljus och ultraljud inte är inriktad. Bildkvaliteten är således inte optimal 30 . I alla dessa fall använde AR-PAM inte mörkfältbelysning. Användningen av mörkfältbelysning kan minska genereringen av starka fotoakustiska signaler från hudytan. Därför kan djupvävnadsavbildning utföras med användning av ringformad belysning, eftersom detekteringsfrekvensen hos djupa fotoakustiska signaler blir högre jämfört med ljusfältbelysningen.

I det här arbetet rapporteras ett omkopplingsbart AR- och OR-PAM-system (AR-OR-PAM) som möjliggör både högupplösta bilder och lågupplösning av djupvävnad av samma prov, med samma laser och scanner för båda systemenems. Utförandet av AR-OR-PAM-systemet karakteriserades genom att bestämma den rumsliga upplösningen och bildningsdjupet med hjälp av fantomförsök. In vivo blodkärl avbildades på ett musör för att demonstrera dess biologiska avbildningskapacitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes enligt de godkända bestämmelserna och riktlinjerna för den institutionella djurvårds- och användningskommittén för Nanyang Technological University, Singapore (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263).

1. AR-OR-PAM-system ( Figur 1 )

  1. Systemkonfiguration: AR-PAM
    1. Använd ett nanosekund avstämbart lasersystem som består av en diodpumpad, solid state Nd-YAG laser (532 nm) och en färglaser med ett avståndsintervall på 559-576 nm som den optiska bestrålningskällan. Ställ in laservåglängden till 570 nm med hjälp av en extern styrenhet och laserrepetitionshastigheten till 1 kHz med hjälp av lasersoftwaren.
    2. Placera en stråleprovtagare i 45 ° vinkel framför lasern för att avleda 5% av laserkraften till en fotodiod genom ett filter med variabelt neutraltäthet (NDF1; OD = 0-4,0).
    3. Vidarebefordra laserstrålen efter strålprovtagaren vid 90 ° med användningEn rätvinkelprisma (RAP1).
    4. Använd en annan rätvinkelprisma (RAP2) för att låta strålen passera genom ett variabelt neutraltäthetsfilter (NDF2; OD = 0-4.0) och på en multimodefiber (MMF), rikta den via en fiberkopplare (FC) -a Kombination av mål (numerisk bländare (NA): 0,25) och en XY-översättare.
    5. Fixa fibern på scanningsteget med hjälp av en XY-översättare. Placera en plano-konvex lins (L1) 25 mm bort från fiberutgångens ände för att kollimera strålen ur fibern.
    6. Passera den kollimerade strålen genom en konisk lins med en toppvinkel på 130 ° för att generera en ringformad stråle. Svag fokusera den ringformade strålen på motivet med hjälp av en hemgjord optisk kondensor (OC) med konvinklar på 70 ° och 110 ° och med ett hål i mitten.
    7. Placera en 50 MHz ultraljudstransduktor (UST) med en akustisk lins (AL) i mitten av den hemlagade kondensorn.
  2. Systemkonfiguration: OR-PAM
    1. Använda enNanosekund avstämbart lasersystem bestående av en diodpumpad ND-YAG-laser (532 nm) i fast tillstånd och en färglaser med ett avståndsintervall på 559 - 576 nm som den optiska bestrålningskällan. Ställ in laservåglängden vid 570 nm med hjälp av en extern styrenhet och laserrepetitionshastigheten vid 5 kHz med hjälp av lasersoftwaren.
    2. Rotera det datorstyrda rotationssteget (håll RAP1) med 90 ° för att avleda laserstrålen på en iris för omformning.
    3. Dämpa laserstrålen genom att placera ett variabelt neutralt täthetsfilter (OD: 0-4.0) längs strålen och fokusera sedan strålen med en kondensorlins (CL). Passera det genom en pinhål (PH) 75 mm från CL för rumsfiltrering.
    4. Starta den rumsfiltrerade strålen på en enkelfibrer (SMF) med en enkelkopplad fiberkopplare (FC) bestående av ett 0,1 NA-objekt att fokusera ljusstrålen på SMF.
    5. Justera fiberkopplaren för att uppnå maximal kopplingseffektivitet.
    6. Fixa fibern på tHan skannar scenen med en glidplatta (SP). Placera en achromatisk lins (L2) 50 mm från SM-fibern för att kollimera laserstrålen.
    7. Vidarebefordra den kollimerade strålen med 90 ° med hjälp av en kinematisk styrbar elliptisk spegel (M) för att fylla bakåten på en annan identisk achromatisk lins (L3). Placera den achromatiska linsen som används för att fokusera på ett översättningsfäste (TM2) med ett linsrör (LT).
    8. Passera fokuseringsstrålen genom en hemmagjord optoakustisk strålkombination bestående av en rätvinklad prisma (RA) och en rhomboid prisma (RP), med ett lager av kiselolja (SO) däremellan.
      OBS: Silikonoljeskiktet fungerar som optiskt transparent och akustiskt reflekterande film.
    9. Fäst en akustisk lins (AL) för att ge akustisk fokusering (brännvidd: ~ 46 μm) längst ner på rhomboidprismen.
    10. Placera ultraljudstransducern med en 50 MHz-centerfrekvens ovanpå rhomboidprismen; Använd ett epoxilager för effektiv koppling.
    3. 2. Systemväxling och justering

    1. Fixera (genom att skruva fast) den hemlagade omkopplingsplattan till ett 3-axels motoriserat steg styrt av en 3-axelriktare som är ansluten till datorn.
    2. Fäst AR- och OR-bursystemet till den hemlagade plattan med hjälp av monteringsfästen för montering, så att du enkelt kan växla mellan AR- och OR-skanningshuvudena. Skjut skannhuvudet ovanpå bildområdet.
    3. Använd Z-scenen för att sänka underdelen av AR-OR-PAM-skannerns huvud i en vattenfylld akryltank (13 cm x 30 cm x 3 cm) för akustisk koppling.
    4. Öppna ett bildfönster med en diameter på 7 cm på tankens bottenplatta och tät den med ett polyetenmembran för optisk och akustisk transmission.
    5. Använd en puls-ekoförstärkare och ett oscilloskop för att rikta in ultraljudsgivaren i fokus.
      1. Ställ in förstärkningen i pulsekomförstärkaren till 24 db i sändnings- / mottagningsläge.
      2. Använd synkroniseringssignalen frOm puls-ekoförstärkaren som utlösare och detektera den backscatterade signalen från en glasskiva (insatt från botten av vattentanken) med ett oscilloskop.
        OBS! Glidret ska ha svart tejp fast vid det.
      3. Flytta Z-axeln för att maximera amplituden för puls-ekosignalen (ses på oscilloskopet).
        OBS! När glasplattan är i fokus kommer ekot att ha sin maximala amplitud.
    6. Slå på lasern och anslut UST till två förstärkare, vardera med 24 dB fixad förstärkning, med BNC-kablar.
      OBS: Förstärkarnas utgångar är anslutna till datakörkortet (DAQ).
    7. Använd signalen från fotodioden (PD) placerad framför lasern som en trigger för datainsamlingssystemet.
    8. I AR-PAM varierar avståndet mellan den koniska linsen (con.L) och den optiska kondensorn (OC) för att maximera amplituden för den fotoakustiska signalen som genereras från testobjektet (svart tejp fast på en glasskiva).Se till att de optiska och akustiska fokuserna är konfokala genom att bestämma den maximala bildakustiska (PA) signalamplituden.
      1. Observera fördröjningen av de maximala PA-signalerna. Använd detta senare för att kontrollera fokuseringen i datainsamlingsprogrammet.
    9. Lossa skruven i skanningshuvudet och byt skanningshuvudet manuellt från AR-PAM till OR-PAM. Dra sedan åt skruvarna.
    10. I OR-PAM varierar avståndet mellan den fokuserande achromatiska dubleten (inuti linsröret (LT)) och den optoakustiska kombinationsenheten för att maximera PA-signalamplituden som visas på oscilloskopet.
      1. Observera fördröjningen av de maximala PA-signalerna.
        OBS: Finetuning är nödvändig för att bestämma konfokala arrangemanget.

    3. Experimentella steg

    1. Lateral upplösning och bilddjupskvantifiering
      1. Använd guld nanopartiklar 100 nm i diameter för att bestämma sidans upplösning av AR anD OR-systemet.
      2. Späd 0,1 ml nanopartikellösning med en lika stor mängd vatten. Distribuera 0,1 ml utspädd lösning på en skyddsplatta och placera den i kontakt med polyetylenmembranet under tanken.
      3. Kontrollera att AR-PAM och OR-PAM är i fokus i datainsamlingsprogrammet (se materialet) innan du skannar (steg 2.8 och 2.10).
        OBS! Genom att känna till mikrosekundsfördröjningen för de maximala PA-signalerna från steg 2.9 och 2.10 multiplicerat med samplingsfrekvensen (250 MS / s) kommer bilden att vara i fokus i datainsamlingsprogrammet. Förseningen som måste utelämnas vid datainsamling kan bestämmas i mjukvaran för att spara endast de nödvändiga datapunkterna för efterbehandling.
      4. Ställ in parametrarna för AR-PAM och tryck på "Scan" -knappen för att starta raster-skanning.
        1. Ställ in skanningsparametrarna för AR-PAM i datainsamlingsprogramvaran vid "4" mm / s skanningshastighet i "hastigheten"; Fliken "1" kHz i fliken "Pulsrepetition", "0,5" mm i fliken "Y-scan-intervall" och "0,5" mm i fliken "X-scan-intervall". Ställ in steget i x-riktningen vid "4" μm i fliken "dx".
          OBS: Stegstorleken i y-riktningen bestäms automatiskt av skanshastighetshastigheten för scenen och pulsrepetitionshastigheten (i detta fall 4000 μm / 1000 Hz = 4 μm)
      5. Ställ in skanningsparametrarna för OR-PAM och tryck på "Scan" -knappen för att starta raster-skanning.
        1. Ställ in skanningsparametrarna i datainsamlingsprogrammet vid "2.5" mm / s skanningshastighet i fliken "hastighet", "5" kHz i fliken "Pulsrepetition", "0,5" mm i "Y-scan-intervallet" Fliken och "0.5" mm i fliken "X-scan-intervall". Ställ in steget i x-riktningen en "0.5" μm i fliken "dx".
          OBS: sTepstorleken i y-riktningen bestäms automatiskt av skanshastighetshastigheten för scenen och pulsrepetitionshastigheten (i detta fall 2.500 μm / 5000 Hz = 0,5 μm).
      6. Se till att under skanningsprocessen tas data kontinuerligt och lagras på datorn
        OBS: Data kommer endast att fångas i en rörelse av Y-scenen.
      7. Använd flera B-scan-data som är lagrade i datorn för att hämta maximal amplitudprojektion (MAP) -bilder med hjälp av bildbehandlingsprogram (se materialet ).
      8. Använd en enda nanopartikelbild (av flera bilder) från skanningen för att bestämma sidoprocessen genom att manuellt rita en linje genom den centrala regionen av nanopartikelbilden för att få en punktspridningsfunktion som liknar Gaussisk kurva. Se figur 2 .
      9. Montera punktspridningsfunktionen som erhålls från en enda nanopartikelbild med hjälp av en GauSsian-passningsfunktion och mäta full bredd vid halva maximalt (FWHM) med hjälp av bildbehandlingsprogram (se Materialetabellen ). Använd detta som sidoprocessen. Se figur 2 .
      10. Sätt in en bit svart tape snett på en bit skivad kycklingväv som målobjekt för djupbildning. Placera vävnaden med tejpen i vattentanken.
        OBS! Det svarta tejpet sitter fast på en metallplatta med en skarp spets som hjälper till att fästa bandet i vävnaden.
      11. Ställ in parametrarna för AR-PAM i datainsamlingsprogrammet och tryck sedan på "Scan" -knappen för att ta fram en enda B-scan-bild för att bestämma det maximala bilddiametern.
        1. Ställ in skanningsparametrarna vid "15" mm / s skanningshastighet i fliken "hastighet", "1" kHz i fliken "Pulsrepetition", "5" cm i fliken "Y-scan-intervall" och "0,1" "Mm i fliken" X-scan-intervall ". Ställ tHan steget i x-riktningen vid "0.1" mm i "dx" fliken.
      12. Ställ in skanningsparametrarna för OR-PAM och tryck på "Scan" -knappen för att ta fram en enda B-scan-bild för att bestämma det maximala avbildningsdept.
        1. Ställ in skanningsparametrarna i datainsamlingsprogrammet som "15" mm / s skanningshastighet i fliken "hastighet", "5" kHz i fliken "Pulsrepetition", "2" cm i "Y-scan-området" Fliken och "0.1" mm i fliken "X-scan-intervall". Ställ in steget i x-riktningen vid "0.1" mm i fliken "dx".
          OBS! Eftersom X-scan-intervallet och dx är desamma kommer bara en B-skanning att fångas. De tidsupplösta PA-signalerna multiplicerade med ljudets hastighet i mjukvävnad (1.540 m / s) ger en A-linje-bild. Flera A-linjer fångas under Y-scenens kontinuerliga rörelse för att producera en B-scan.
    2. In vivo </ Em> avbildning av musörets öron blodkar
      1. Använd en kvinnlig mus med en kroppsvikt på 25 g och en ålder av 4 veckor.
      2. Bedöda djuret med en cocktail av ketamin (120 mg / kg) och xylazin (16 mg / kg) injicerad intraperitonealt (dosering av 0,1 ml / 10 g).
      3. Ta bort håret från djuröret med hjälp av hårborttagningskräm. Torka området rent. Täck djurets öga med en steril okulär salva för att undvika spridd laserstråle som faller på ögonen.
      4. Placera djuret på ett stadium som också har en miniatyrplatta för att placera örat.
      5. Behålla anestesi med inandad isofluran (0,75% i 1 liter / min syre) under bildningsperioden.
      6. Kläm en puls oximeter till musbenet eller svansen och övervaka den fysiologiska statusen. Låt bildningsområdet ligga i kontakt med polyetenmembranet med ultraljudsgel.
      7. Ställ in skanningsparametrarna för AR-PAM och tryck på "Scan" knappen för att starta raster scanning.
        1. Ställ in skanningsparametrarna för AR-PAM i datainsamlingsprogrammet vid "15" mm / s skanningshastighet i fliken "hastighet", "1" kHz i fliken "Pulsrepetition", "10 mm" i " Y-scan-intervall "och" 6 "mm i fliken" X-scan-intervall ". Ställ in steget i x-riktningen som "30" μm i fliken "dx".
          OBS! Stegstorleken i y-riktningen bestäms automatiskt av skanshastighetshastigheten för scenen och pulshöjningsfrekvensen (i detta fall 15.000 μm / 1000 Hz = 15 μm).
      8. Efter avslutad AR-PAM-skanning byt du bildlägespositionen från AR-PAM till OR-PAM (som beskrivs i avsnitt 2).
      9. Ställ in skanningsparametrarna för OR-PAM och tryck på "Scan" -knappen för att starta raster-skanning.
        1. Ställ in skanningsparametrarna för OR-PAM i datainsamlingsprogramvaran vid "15" mm / s skanningshastighet i "välocitY "fliken" 5 "kHz i fliken" Pulsrepetition "," 10 "mm i fliken" Y-scan-intervall "och" 6 "mm i fliken" X-scan-intervall ". Ställ in steget I x-riktningen som "6" μm i "dx" -fliken.
          OBS: Stegstorleken i y-riktningen bestäms automatiskt från skanshastighetshastigheten för scenen och pulsrepetitionshastigheten (i detta fall 15.000 μm / 5000 Hz = 2 μm).
      10. Använd flera B-scan-data som är lagrade i datorn för att hämta MAP-bilderna med hjälp av bildbehandlingsprogram.
      11. Observera djuret under hela avbildningsperioden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Schematiken för AR-OR-PAM-systemet visas i Figur 1 . I denna inställning integrerades samtliga komponenter i en optisk burinstallation. Användningen av ett bursystem gör AR-OR-PAM-skanningshuvudet kompakt och enkelt monterat, inriktat och integrerat på ett enda skanningsteg.

Tvådimensionell kontinuerlig rasterskanning av bildhögtalaren användes under bildupptagning. De tidsupplösta PA-signalerna multiplicerades med ljudets hastighet (1.540 m / s) för att erhålla en A-linje. Flera A-linjer fångade under Y-scenens kontinuerliga rörelse skapade den tvådimensionella B-scanningen. Flera B-skanningar av avbildningsområdet fångades och lagrades i datorn och användes för att bearbeta och producera MAP-fotoakustiska bilder.

För att bestämma upplösningen av det växlingsbara systemet, MAP-bilden av en enda nanopartikel användes 31 . Den fotoakustiska amplituden längs den centrala laterala riktningen av bilden ritades och monterades på en Gaussisk funktion. FWHM av Gaussian passform betraktades som den laterala upplösningen. Den uppmätta laterala upplösningen för AR-PAM var 45 pm, såsom visas i figur 2a . På liknande sätt monterades en enda nanopartikelbild som förvärvades med användning av OR-PAM längs den centrala sidoriktningen för att bestämma upplösningen av OR-PAM, såsom visas i figur 2b . Den uppmätta laterala upplösningen var 4 jim, bestämd från FWHM. Inlägget i figuren visar motsvarande MAP-bild av guldnanopartikeln. Teoretiskt är den optiska diffraktionsbegränsade laterala upplösningen för AR-PAM 45 μm bestämd med användning av följande ekvation: 0,72 A / NA, där A är den centrala akustiska våglängden och NA är den numeriskaUltraljudsgivarens öppning. Den teoretiska resolutionen överensstämmer väl med experimentdata. På liknande sätt är den teoretiska sidoprocessen för OR-PAM 2,6 μm, som beräknad med följande ekvation: 0,51 A / NA, där A är laservåglängden och NA är målets numeriska öppning. Den experimentellt uppmätta sidoprocessen för OR-PAM var sämre än diffraktionsgränsberäkningen, som kan bero på vågfrontavvikelser. Eftersom både AR och OR använder en liknande transducer och akustisk lins, kommer den teoretiska axiella upplösningen att vara 30 μm enligt 0,88 c / A f , där c är ljudets hastighet i mjukvävnad och Af är frekvensbandbredden hos ultraljudsomvandlaren . Vidare varierar sidoprocessen längs axiell riktning för både OR-PAM 20 och AR-PAM 32 . De rapporterade sidoprocesserna är här på fokalplanet.

Figur 3a visar fotografiet av den svarta tejpen på kycklingsvävnad. En enda B-scan-bild togs med både AR-PAM och OR-PAM. Figur 3b och Figur 3c visar den enda B-scan PA-bilden av AR-PAM respektive OR-PAM. Det framgår av figur 3 b att AR-PAM-systemet tydligt kan bilda det svarta tejpen ner till ~ 7,8 mm under vävnadsytan. På samma sätt kunde man med hjälp av OR-PAM-systemet tydligt avbilda det svarta tejpen ner till ~ 1,4 mm under vävnadsytan ( Figur 3 c ). Signal-till-brus-förhållandet (SNR) bestämdes också av bilderna. SNR definieras som V / n , där <Em> V är topp-till-topp-PA-signalamplituden och n är standardavvikelsen för bakgrundsbruset. SNR-mätt vid 4,6 mm och 7,8 mm bilddiameter var 2,6 respektive 1,4. För OR-PAM var SNR vid ett 1,4 mm bilddjup 1,4. För att visa den biologiska avbildningsförmågan hos det bytbara AR-OR PAM-systemet utfördes in vivo blodvaskulärbildning på ett musör. Ett fotografi som visar den vaskulära anatomin hos det levande musöret som används för avbildning visas i figur 4a . Med användning av AR-PAM avbildades en 10 mm x 6 mm avsökningsregion med en stegstorlek på 15 μm i Y-riktningen och 30 μm i X-riktningen. Bildbehandling tog 10 minuter att slutföra. För närvarande förvärvar bildsystemet endast data i en riktning; Anskaffningstiden kan minskas till nästan hälften genom att modifiera programmet för att få en dubbelriktad datainsamlingskapacitet. En kartbild av AR-PAM visas i figur 4B. Närbilden av intresseområdet visas i figur 4 c . En liknande area som skannats med OR-PAM, med en stegstorlek på 3 μm i Y-riktningen och 6 μm i X-riktningen, visas i Figur 4 d . Avbildningen tog 46 minuter att slutföra. Närbilden av intresseområdet visas i Figur 4 e . OR-PAM kan tydligt lösa enskilda kapillärer, vilket AR-PAM inte kan lösa. AR-PAM kan lösa fartyg tjockare än 45 μm.

Sammanfattningsvis har ett omkopplingsbart AR-OR-PAM-system som kan åstadkomma högupplösta bilder med snäv optisk fokusering och djupvävnadsbildning med akustisk fokusering utvecklats. Utförandet av det omkopplingsbara AR-OR-PAM-systemet kvantifierades med användning av lateral upplösning och bilddjupmått. In vivo studDet har också utförts för att visa sin biologiska avbildningskapacitet. Detta växlingsbara fotoakustiska mikroskopiosystem kan ge hög temporal och rumslig upplösning, vilket gör systemet viktigt för applikationer, inklusive bildbehandling av angiogenes, drogrespons etc. , där avbildning av enkla kapillärer samt djupa vaskulaturer är viktig. Ytterligare modifikationer eller förbättringar av systemet kan göras genom att byta ut den hemlagade omkopplingsplattan med ett 10 cm färdigt motoriserat steg (y-axel). Sidoprocessen hos OR-PAM kan förbättras ytterligare genom att korrigera vågfrontavvikelserna. Att leverera en högre pulsenergi till AR-PAM förbättrar även SNR och bilddjup.

När det gäller OR-PAM, förutsatt att det optiska fokuset är 150 μm under hudytan för in vivo- bildbehandling, var ytpunktsstorleken 22,5 μm i diameter. Att leverera en enda laserpuls på 90 nJ ger en maXimal puls energi på 20,4 mJ / cm 2 . För AR-PAM var laserfokusen 2 mm i diameter. Att leverera en enda laserpuls på 50 μJ ger en maximal pulsenergi vid brännpunkten 1,6 mJ / cm 2 , väl inom ANSI-säkerhetsgränsen på 20 mJ / cm 2 , 33 .

Figur 1
Figur 1 : Schematisk av AR-OR-PAM Imaging System. ( A ) BS: strålprovtagare, NDF: Neutraldensitetsfilter, RAP - Högervinkelprisma, PD: Fotodiod, CL: Kondensorlins, PH: Pinhole, FC: Fiberkopplare, UST: Ultraljudsgivare, MMF: Multimodefiber, SMF: Single-mode fiber, DAQ: dataöverföringskort, TS: översättningssteg, Con.L: konisk lins, L1: konvex lins, L2 och L3: akromatisk lins, RA: rätvinkelprisma, RP: rhomboid prisma, OC: optisk Kondensor, M: mIrror, SP: glidplatta, LT: linsrör, TM: översättningsfäste, KMM: kinematisk spegelfäste och AL: akustisk lins. ( B ) Fotografi av prototypen AR-OR-PAM-systemet. ( C ) Närbild på den optoakustiska strålkombinationen. ( D ) Närbild på den optiska kondensorn med en UST i mitten. Reprinted från referens 34 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2 : Lateralt upplösningstest av AR-OR-PAM-systemet: Lateral upplösning uppskattad genom bildbehandling av guld nanopartiklar ~ 100 nm i diameter. Svarta (*) prickar: fotoakustisk signal; Blå linje: Gaussian-anpassad kurva för ( a ) AR-PAM och ( b )ELLER-PAM. Inlägget visar den representativa AR-PAM-bilden i (a) och OR-PAM-bilden i (b) av den enda guldnanopartikeln. Reprinted från referens 34 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3 : Bilddjupmått: Enkel B-scan PA-bild av ett svart band infogat snett på kycklingsvävnad. (A) schematiskt diagram ( B ) AR-PAM-bild. ( C ) OR-PAM-bild. Reprinted från referens 34 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.


Figur 4 : Inovivo fotoakustisk bild av ett musör: ( a ) Fotografi av musörörsvaskulaturen. (B) AR-PAM-bild. ( C ) Närbild av intresseområdet (ROI) i ( b ), som visas med en vit streckad linje. ( D ) OR-PAM-bild. ( E ) Region av intresse (ROI) i ( d ), som visas med en vit streckad linje. ( F ) Närbild av ROI-vitlinjen i (e) med en enda kapillär. Reprinted från referens 34 med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammanfattningsvis har ett omkopplingsbart AR- och OR-PAM-system som kan uppnå både högupplösande avbildning vid lägre bilddjup och bildbehandling med lägre upplösning vid högre bilddjup har utvecklats. Sidans upplösning och bildningsdjup för det omkopplingsbara systemet bestämdes. Fördelarna med detta omkopplingsbara PAM-system inkluderar: (1) högupplösande avbildning med snäv optisk fokusering; (2) djupvävnadsbildningen med hjälp av akustisk fokusering; 3) mörkfältbelysningen för AR-PAM, vilket förhindrar starka PA-signaler från att förekomma på hudytan; 4) förmågan att hålla provet på ett ställe, utan att flytta det mellan olika system; 5) möjligheten att undvika att använda flera lasrar och avsökningssteg; Och 6) minimal användning av hemlagade komponenter. Detta är den första rapporterade kombinationen av OR-PAM och dark-field AR-PAM som ger högupplösta, grunda bilder och bilder med låg upplösning, djupvävnad av samma prov utan att flytta provet / obJect. Användningen av samma scanningsteg och laser gör systemet effektivt och kostnadseffektivt. Det kombinerade systemet har en 4 μm sidoprocess med ett 1,4 mm bilddjup samt en 45 μm sidoprocess med ett 7,8 mm bilddjup. Systemet är tillverkat av ett optiskt bursystem med minimala hemlagade komponenter, vilket gör det enklare att montera, justera och byta mellan AR och OR PAM. Det kombinerade avsökningshuvudet är kompakt och kan enkelt monteras i ett enda skanningsläge. Användning av det kombinerade systemet visades framgångsrikt in vivo bildbehandling.

Det utvecklade systemet kan användas för preklinisk bildbehandling. Viktiga prekliniska tillämpningar innefattar bildbehandling av angiogenes, tumörmikroenomgivning, mikrocirkulation, drogrespons, hjärnfunktioner, biomarkörer och genaktiviteter. Systemets begränsningar inkluderar skanningstiden. En lång skanningstid behövs för närvarande, men det kan minskas genom att man förvärvar data i botH riktningar. Samtidigt bildköp mellan OR-PAM och AR-PAM är inte möjlig för närvarande. För närvarande är manuell växling mellan OR-PAM och AR-PAM nödvändig, vilket kan undvikas genom att använda ett översättningssteg som har minst 10 cm Y-riktningsrörelse. Kritiska steg i protokollet innefattar konfokal bestämning av det optiska och akustiska fokuset; Uppnåendet av en optisk spotstorlek mindre än 5 μm för OR-PAM, till bild-enstaka kapillärer; Och utformningen av den optoakustiska strålkombinationen för OR-PAM och den optiska kondensorn för AR-PAM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla djurförsök utfördes enligt de godkända riktlinjerna och föreskrifterna i Institutet för djurvård och användning av Nanyang Technological University, Singapore (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263). Författarna har inga relevanta ekonomiska intressen i manuskriptet och inga andra potentiella intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna skulle vilja erkänna det ekonomiska stödet från ett Tier 2-bidrag finansierat av utbildningsdepartementet i Singapore (ARC2 / 15: M4020238). Författarna skulle också vilja tacka mr Chow Wai Hoong Bobby för hjälp med maskinbutiken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q-switched Nd:YAG laser Edgewave BX80-2-L Pump laser 
Credo-High Repetition Rate Dye Laser Spectra physics CREDO-DYE-N Dye laser
Precision Linear Stage Physik Instrumente PLS 85  XY raster scanning stage
Translation stage Physik Instrumente VT 80  Confocal determine
Mounted Silicon photodiode Thorlabs SM05PD1A Triggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage  Thorlabs CR1/M-Z7 Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND Filter Thorlabs NDC-50C-4M Intensity variable
Fiber Patch Cable Thorlabs M29L01 Multimode fiber
Microscope objective Newport M-10X Objective 
XY translating mount Thorlabs CXY1 Translating mount
Plano convex lens Thorlabs LA1951 Collimating lens
Conical lens  Altechna APX-2-B254 Ring shape beam
Translation stage Thorlabs CT1 Translating stage
Optical condenser Home made
Ultrasonic transducer Olympus-NDT V214-BB-RM 50MHz transducer
Plano concave lens Thorlabs LC4573 Acoustic lens
Pulser/Receiver Olympus-NDT 5073PR Pulse echo amplifier 
Mounted standard iris Thorlabs ID12/M Beam shaping
Plano convex lens Thorlabs LA4327 Condenser lens
Mounted precision pinhole Thorlabs P50S Spatial filtering
Single mode fiber patch cable Thorlabs P1-460B-FC-1 Single mode fiber
Fiber coupler Newport F-91-C1 Single mode coupling
Achromatic doublet lens Edmund Optics 32-317 Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirror Thorlabs PFE10-P01 Mirror
Right angle kinematic mirror mount Thorlabs KCB1 Mirror mount
Z-Axis Translation Mount Thorlabs SM1Z z translator
Lens tube Thorlabs SM05L10
UV Fused Silica Right-Angle Prism Thorlabs PS615 Right angle prism
Rhomboid prism Edmund Optics 47-214 Shear wave
Dimethylpolysiloxane Sigma Aldrich DMPS1M Silicon oil
Amplifier Mini Circuits ZFL-500LN Amplifier
16 bit high speed digitizer Spectrum M4i.4420 Data acquisition card
Oscilloscope Agilent Technologies DS06014A
Mice  InVivos Pte.Ltd ICR Animal model
Ultrasound gel  Progress/parker acquasonic gel PA-GEL-CLEA-5000 Acoustic coupling
Water tank Home made
Translation stage Homemade Switching AR-OR
Gold nanoparticles Sigma Aldrich 742031 Lateral resolution
Sterile ocular ointment Alcon Duratears Animal imaging
1951 USAF resolution test target Edmund Optics 38257 Confocal alignment
Data acquisition software National Instrument Labview Home made software using Labview
Image Processing software Mathworks Matlab Home made program using Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
  2. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  3. Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
  4. Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
  5. Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
  6. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
  7. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
  8. Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
  9. Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
  10. Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
  11. Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
  12. Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
  13. Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
  14. Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
  15. Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
  16. Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
  17. Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
  18. Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
  19. Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
  20. Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
  21. Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006 (2014).
  22. Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
  23. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
  24. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
  25. Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
  26. Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
  27. Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
  28. Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
  29. Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
  30. Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
  31. Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
  32. Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
  33. ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , NY. (2000).
  34. Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).

Tags

Bioengineering Akustisk upplösning fotoakustisk mikroskopi optisk upplösning fotoakustisk mikroskopi fotoakustisk bildbehandling fotoakustik, AR-PAM OR-PAM mikroskopi kombinerat mikroskopi system
Bytbar akustisk och optisk upplösning Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In vivo</em&gt; Blodvasculature Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moothanchery, M., Sharma, A.,… More

Moothanchery, M., Sharma, A., Pramanik, M. Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging. J. Vis. Exp. (124), e55810, doi:10.3791/55810 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter