Summary
Aquí se demuestra un sistema de microscopía fotoacústica (AR-OR-PAM) de resolución acústica conmutable (AR) y resolución óptica (AR-OR-PAM) capaz tanto de imágenes de alta resolución en profundidad superficial como de imágenes de tejido profundo de baja resolución en la misma muestra in vivo .
Abstract
La microscopía fotoacústica (PAM) es una modalidad de imagen in vivo de rápido crecimiento que combina óptica y ultrasonido, proporcionando una penetración más allá de la trayectoria libre media óptica (~ 1 mm en la piel) con alta resolución. Al combinar el contraste de absorción óptica con la alta resolución espacial del ultrasonido en una sola modalidad, esta técnica puede penetrar tejidos profundos. Los sistemas de microscopía fotoacústica pueden tener una baja resolución acústica y una sonda profunda o una alta resolución óptica y una sonda poco profunda. Es difícil lograr una alta resolución espacial y una gran penetración en profundidad con un único sistema. Este trabajo presenta un sistema AR-OR-PAM capaz tanto de imágenes de alta resolución a profundidades poco profundas como de imágenes de tejido profundo de baja resolución de la misma muestra in vivo . Una resolución lateral de 4 μm con una profundidad de imagen de 1,4 mm utilizando enfoque óptico y una resolución lateral de 45 μm con una profundidad de imagen de 7,8 mm utilizando enfoque acústico fueron exitosasDemostrado utilizando el sistema combinado. En este caso, se realiza una proyección de imagen vascular de sangre de animal pequeño in vivo para demostrar su capacidad de formación de imágenes biológicas.
Introduction
Las modalidades ópticas de imágenes de alta resolución, como la tomografía de coherencia óptica, la microscopía confocal y la microscopía multifotónica, tienen numerosos beneficios. Sin embargo, la resolución espacial disminuye significativamente a medida que aumenta la profundidad de formación de imágenes. Esto se debe a la naturaleza difusa del transporte ligero en tejidos blandos 1 , 2 . La integración de la excitación óptica y la detección de ultrasonidos proporciona una solución para superar el reto de la imagen óptica de alta resolución en tejidos profundos. La microscopía fotoacústica (PAM) es una modalidad de este tipo que puede proporcionar imágenes más profundas que otras modalidades de imagen óptica. Se ha aplicado con éxito a imágenes estructurales, funcionales, moleculares y de células in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 combinando el fuerte contraste de absorción óptica con la alta resolución espacial del ultrasonido.
En PAM, un pulso láser corto irradia el tejido / muestra. La absorción de luz por los cromóforos ( por ejemplo, melanina, hemoglobina, agua, etc. ) produce un aumento de la temperatura, que a su vez produce la producción de ondas de presión en forma de ondas acústicas (ondas fotoacústicas). Las ondas fotoacústicas generadas pueden ser detectadas por un transductor ultrasónico de banda ancha fuera del límite del tejido. Utilizando óptica débil y acústica de enfoque apretado, imágenes de tejidos profundos se puede lograr en la microscopía fotoacústica de resolución acústica (AR-PAM) [ 14 , 15 , 16] . En ar-PAM, se ha demostrado una resolución lateral de 45 μm y una profundidad de imagen de hasta 3 mm 15 . Con el fin de resolver acústicamente capilares individuales (~ 5 μm), se requieren transductores ultrasónicos que funcionen a frecuencias centrales de> 400 MHz. A tales frecuencias altas, la profundidad de penetración es inferior a 100 μm. El problema causado por el enfoque acústico apretado puede ser resuelto usando el enfoque óptico apretado. La microscopía fotoacústica de resolución óptica (OR-PAM) es capaz de resolver capilares únicos, o incluso una sola célula 17 , y una resolución lateral de 0,5 μm se ha logrado 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . El uso de un nanojet fotónico puede ayudar a lograr una resolución más allá de la resolución limitada por difracciónN 25 , 26 . En OR-PAM, la profundidad de penetración es limitada debido al enfoque de la luz, y puede imagen hasta ~ 1,2 mm dentro del tejido biológico [ 23] . Por lo tanto, AR-PAM puede imagen más profunda, pero con una resolución más baja, y OR-PAM puede imagen con una resolución muy alta, pero con una profundidad de imagen limitada. La velocidad de formación de imágenes del sistema AR y OR-PAM depende principalmente de la velocidad de repetición del impulso de la fuente láser 27 .
La combinación de AR-PAM y OR-PAM será de gran beneficio para las aplicaciones que requieren una alta resolución y una imagen más profunda. Se ha hecho poco esfuerzo para combinar estos sistemas. Por lo general, se utilizan dos escáneres de imágenes diferentes para la formación de imágenes, lo que requiere que la muestra se mueva entre ambos sistemas, lo que dificulta la realización de imágenes in vivo . Sin embargo, la imagen híbrida con AR y OR PAM permite la creación de imágenes con resoluciones escalables aNd profundidades. En un enfoque, se utiliza un haz de fibras ópticas para suministrar luz tanto para AR como para OR PAM. En este enfoque, se utilizan dos láseres separados (un láser de alta energía a 570 nm para el AR y un láser de baja energía y alta frecuencia de repetición a 532 nm para el OR), lo que hace que el sistema resulte inconveniente y caro 28 . La longitud de onda del láser OR-PAM es fija, y muchos estudios, como la saturación de oxígeno, no son posibles utilizando este sistema combinado. Los estudios comparativos entre AR y OR PAM tampoco son posibles debido a la diferencia en las longitudes de onda del láser entre AR y OR. Además, AR-PAM utiliza iluminación de campo brillante; Por lo tanto, las señales fotoacústicas fuertes de la superficie de la piel limitan la calidad de la imagen. Por esta razón, el sistema no puede utilizarse para muchas aplicaciones de bioimagen. En otro enfoque para realizar AR y OR PAM, el enfoque óptico y ultrasónico se desplaza, lo que hace que el enfoque de la luz y el enfoque ultrasónico no estén alineados. Por lo tanto, la calidad de imagen no es óptima 30 . En todos estos casos, AR-PAM no utilizó iluminación de campo oscuro. El uso de la iluminación de campo oscuro puede reducir la generación de señales fotoacústicas fuertes de la superficie de la piel. Por lo tanto, la formación de imágenes de tejidos profundos se puede realizar utilizando iluminación en forma de anillo, ya que la sensibilidad de detección de las señales fotoacústicas profundas será mayor comparada con la de la iluminación de campo brillante.
Este trabajo reporta un AR conmutable y OR PAM (AR-OR-PAM) sistema de imagen capaz de tanto de alta resolución de imágenes y de baja resolución de imágenes de tejido profundo de la misma muestra, utilizando el mismo láser y escáner para ambos sistemasEms El rendimiento del sistema AR-OR-PAM se caracterizó por la determinación de la resolución espacial y la profundidad de la imagen utilizando experimentos fantasma. Se realizó imágenes de vasculatura sanguínea in vivo en un oído de ratón para demostrar su capacidad de formación de imágenes biológicas.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones y directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur (Número de Protocolo Animal ARF-SBS / NIE-A0263).
1. Sistema AR-OR-PAM ( Figura 1 )
- Configuración del sistema: AR-PAM
- Utilice un sistema de láser sintonizable de nanosegundos que consista en un láser Nd-YAG de estado sólido bombeado por diodo (532 nm) y un láser de colorante con un rango de afinabilidad de 559-576 nm como fuente de irradiación óptica. Ajuste la longitud de onda del láser a 570 nm usando un controlador externo y la velocidad de repetición del láser a 1 kHz usando el software láser.
- Coloque un sampler de haz en un ángulo de 45 ° delante del láser para desviar el 5% de la potencia del láser a un fotodiodo a través de un filtro de densidad neutral variable (NDF1; OD = 0-4.0).
- Desviar el rayo láser tras el muestreador de haz a 90 °Un prisma de ángulo recto (RAP1).
- Utilice otro prisma de ángulo recto (RAP2) para permitir que el haz pase a través de un filtro de densidad neutra variable (NDF2; OD = 0-4.0) y sobre una fibra multimodo (MMF), dirigiéndola a través de un acoplador de fibra Combinación de objetivos (apertura numérica (NA): 0,25) y un traductor XY.
- Fijar la fibra en la etapa de escaneo utilizando un traductor XY. Coloque una lente plano-convexa (L1) a 25 mm del extremo de salida de la fibra para colimar el haz de la fibra.
- Pase el haz colimado a través de una lente cónica con un ángulo de vértice de 130 ° para generar un haz en forma de anillo. Enfocar débilmente el haz en forma de anillo sobre el sujeto usando un condensador óptico hecho en casa (OC) con ángulos de cono de 70 ° y 110 ° y con un agujero en el centro.
- Coloque un transductor ultrasónico de 50 MHz (UST) con una lente acústica (AL) en el centro del condensador hecho en casa.
- Configuración del sistema: OR-PAM
- Usar unaNanosecondable que consta de un láser Nd-YAG de estado sólido bombeado por diodo (532 nm) y un láser de colorante con un rango de afinabilidad de 559-576 nm como fuente de irradiación óptica. Ajuste la longitud de onda del láser a 570 nm usando un controlador externo y la tasa de repetición del láser a 5 kHz usando el software láser.
- Gire la etapa de rotación controlada por ordenador (sujetando el RAP1) en 90 ° para desviar el rayo láser sobre un iris para remodelar.
- Atenuar el haz láser colocando un filtro de densidad neutra variable (DO: 0-4.0) a lo largo del haz y luego enfocar el haz con una lente condensadora (CL). Pasar a través de un agujero de alfiler (PH) 75 mm de distancia de la CL para el filtrado espacial.
- Lanzar el haz filtrado espacialmente a una fibra monomodo (SMF) usando un acoplador de fibra monomodo (FC) que consiste en un objetivo de 0,1 NA para enfocar el haz de luz en el SMF.
- Ajuste el acoplador de fibra para lograr la máxima eficiencia de acoplamiento.
- Fijar la fibra en tEscaneo con una placa deslizante (SP). Colocar una lente acromática (L2) a 50 mm de distancia de la fibra SM para colimar el rayo láser.
- Desvía el haz colimado en 90 ° utilizando un espejo elíptico controlable cinemático (M) para llenar la apertura posterior de otra lente acromática idéntica (L3). Coloque la lente acromática utilizada para enfocar un soporte de translación (TM2) con un tubo de lente (LT).
- Pasar el haz de enfoque a través de un combinador de haz optoacústico hecho en casa que consiste en un prisma rectángulo (RA) y un prisma romboidal (RP), con una capa de aceite de silicio (SO) en el medio.
NOTA: La capa de aceite de silicio actuará como película ópticamente transparente y acústicamente reflectante. - Conecte una lente acústica (AL) para proporcionar un enfoque acústico (diámetro focal: ~ 46 μm) en la parte inferior del prisma romboidal.
- Coloque el transductor ultrasónico con una frecuencia central de 50 MHz sobre el prisma romboidal; Utilizar una capa de epoxi para el acoplamiento eficaz.
- Fije (atornillando firmemente) la placa conmutable casera a una etapa motorizada de 3 ejes controlada por un regulador de 3 ejes conectado a la computadora.
- Conecte el sistema de jaula AR y OR a la placa hecha en casa usando los soportes de montaje de la jaula para permitir una fácil conmutación entre los cabezales de exploración AR y OR. Deslice el cabezal de exploración en la parte superior del área de imagen.
- Utilice la etapa Z para sumergir la parte inferior de la cabeza del escáner AR-OR-PAM en un tanque de acrílico lleno de agua (13 cm x 30 cm x 3 cm) para el acoplamiento acústico.
- Abra una ventana de imagen con un diámetro de 7 cm en la placa inferior del tanque y séllela con una membrana de polietileno para la transmisión óptica y acústica.
- Utilice un amplificador de eco de pulso y un osciloscopio para alinear el transductor de ultrasonido en foco.
- Ajuste la ganancia en el amplificador de eco de pulsos a 24 db en el modo de transmisión / recepción.
- Utilice la señal de salida de sincronización frOm el amplificador de eco de pulso como el gatillo y detectar la señal retrodispersada de un portaobjetos de vidrio (insertado desde el fondo del tanque de agua) utilizando un osciloscopio.
NOTA: La diapositiva debe tener cinta negra adherida a ella. - Mueva el eje Z para maximizar la amplitud de la señal de eco de pulso (vista en el osciloscopio).
NOTA: Cuando la placa de vidrio esté enfocada, el eco tendrá su amplitud máxima.
- Encienda el láser y conecte el UST a dos amplificadores, cada uno con una ganancia fija de 24 dB, utilizando cables BNC.
NOTA: Las salidas de los amplificadores están conectadas a la tarjeta de adquisición de datos (DAQ). - Utilice la señal del fotodiodo (PD) colocado delante del láser como disparador del sistema de adquisición de datos.
- En AR-PAM, varíe la distancia entre la lente cónica (con.L) y el condensador óptico (OC) para maximizar la amplitud de la señal fotoacústica generada a partir del objeto de prueba (cinta negra pegada en una diapositiva de vidrio).Asegúrese de que los focos ópticos y acústicos son confocales al determinar la amplitud máxima de la señal fotoacústica (PA).
- Observe el retardo de las señales PA máximas; Use esto más tarde para comprobar el enfoque en el software de adquisición de datos.
- Afloje el tornillo del cabezal de escaneado y cambie manualmente el cabezal de escaneo de AR-PAM a OR-PAM. A continuación, apriete los tornillos.
- En OR-PAM, varíe la distancia entre el doblete acromático de enfoque (dentro del tubo de la lente (LT)) y el combinador optoacústico para maximizar la amplitud de la señal PA mostrada en el osciloscopio.
- Observe el retardo de las señales PA máximas.
NOTA: El ajuste finito es necesario para determinar la disposición confocal.
- Observe el retardo de las señales PA máximas.
3. Pasos Experimentales
- Cuantificación de la resolución lateral y de la profundidad de la imagen
- Utilizar nanopartículas de oro de 100 nm de diámetro para determinar la resolución lateral de la AR yD o sistema.
- Diluir 0,1 ml de solución de nanopartículas con una cantidad igual de agua. Distribuir 0,1 ml de solución diluida en un cubreobjetos y colocarlo en contacto con la membrana de polietileno debajo del tanque.
- Asegúrese de que el AR-PAM y el OR-PAM están enfocados en el software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales) antes de escanear (pasos 2.8 y 2.10).
NOTA: Al conocer el retardo de microsegundo de las señales PA máximas de los pasos 2.9 y 2.10, multiplicado por la velocidad de muestreo (250 MS / s), la imagen estará enfocada en el software de adquisición de datos. El retardo que debe omitirse durante la adquisición de datos se puede determinar en el software para guardar sólo los puntos de datos necesarios para el post-procesamiento. - Establezca los parámetros de escaneado para el AR-PAM y presione el botón "escanear" para iniciar el escaneado raster.
- Establezca los parámetros de exploración para el AR-PAM en el software de adquisición de datos a "4" mm / s de velocidad de exploración en la "velocidad"; , "1" kHz en la pestaña "frecuencia de repetición de pulso", "0,5" mm en la pestaña "rango de exploración Y" y "0,5" mm en la pestaña "rango de exploración X". Ajuste el tamaño del paso en la dirección x en "4" μm en la pestaña "dx".
NOTA: El tamaño del paso en la dirección y se determina automáticamente a partir de la velocidad de la velocidad de escaneado de la etapa y la velocidad de repetición del pulso (en este caso, 4.000 μm / 1.000 Hz = 4 μm)
- Establezca los parámetros de exploración para el AR-PAM en el software de adquisición de datos a "4" mm / s de velocidad de exploración en la "velocidad"; , "1" kHz en la pestaña "frecuencia de repetición de pulso", "0,5" mm en la pestaña "rango de exploración Y" y "0,5" mm en la pestaña "rango de exploración X". Ajuste el tamaño del paso en la dirección x en "4" μm en la pestaña "dx".
- Establezca los parámetros de escaneo para el OR-PAM y presione el botón "scan" para iniciar el escaneo raster.
- Ajuste los parámetros de exploración en el software de adquisición de datos a una velocidad de barrido de "2.5" mm / s en la pestaña "velocidad", "5" kHz en la pestaña "frecuencia de repetición de pulso", "0.5" Y "0,5" mm en la pestaña "rango de exploración X". Ajuste el tamaño del paso en la dirección x un "0,5" μm en la pestaña "dx".
NOTA: Los sEl tamaño de tep en la dirección y se determina automáticamente a partir de la velocidad de la velocidad de escaneo de la etapa y de la velocidad de repetición de impulsos (en este caso, 2,500 μm / 5,000 Hz = 0,5 μm).
- Ajuste los parámetros de exploración en el software de adquisición de datos a una velocidad de barrido de "2.5" mm / s en la pestaña "velocidad", "5" kHz en la pestaña "frecuencia de repetición de pulso", "0.5" Y "0,5" mm en la pestaña "rango de exploración X". Ajuste el tamaño del paso en la dirección x un "0,5" μm en la pestaña "dx".
- Asegúrese de que durante el proceso de escaneado, los datos se capturan y almacenan continuamente en el ordenador
NOTA: Los datos serán capturados sólo en una dirección de movimiento de la etapa Y. - Utilice los múltiples datos de B-scan almacenados en el ordenador para recuperar las imágenes de proyección de amplitud máxima (MAP) utilizando el software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales ).
- Utilice una sola imagen de nanopartículas (de múltiples imágenes) de la exploración para determinar la resolución lateral trazando manualmente una línea a través de la región central de la imagen de nanopartículas para obtener una función de propagación de puntos, que se parece a la curva de Gauss. Vea la Figura 2 .
- Ajustar la función de propagación de puntos obtenida a partir de una única imagen de nanopartículas usando un GauSsian ajustar la función y medir el ancho completo a la mitad de máximo (FWHM) utilizando software de procesamiento de imágenes (consulte la tabla de materiales ). Use esto como la resolución lateral. Vea la Figura 2 .
- Inserte un pedazo de cinta negra oblicuamente sobre un pedazo de tejido de pollo en rodajas como objeto objetivo para la obtención de imágenes en profundidad. Coloque el tejido con la cinta en el tanque de agua.
NOTA: La cinta negra se pega a una placa metálica con una punta afilada, lo que ayuda a sujetar la cinta al tejido. - Establezca los parámetros de exploración para el AR-PAM en el software de adquisición de datos y luego presione el botón "escanear" para capturar una sola imagen B-scan para determinar la profundidad máxima de imagen.
- Ajuste los parámetros de escaneo a una velocidad de barrido de "15" mm / s en la pestaña "velocidad", "1" kHz en la pestaña "frecuencia de repetición de pulso", "5" cm en la pestaña "gama Y-scan" y "0.1 "Mm en la pestaña" rango X-scan ". ConjuntoEl tamaño del paso en la dirección x en "0,1" mm en la pestaña "dx".
- Establezca los parámetros de escaneado para el OR-PAM y presione el botón "scan" para capturar una sola imagen B-scan para determinar el departamento de imágenes máximo.
- Ajuste los parámetros de exploración en el software de adquisición de datos como "15" mm / s velocidad de exploración en la "velocidad" tabulación, "5" kHz en la "tasa de repetición de pulso" pestaña, "2" cm en el "Y-scan rango" Y "0,1" mm en la pestaña "rango X-scan". Ajuste el tamaño del paso en la dirección x en "0,1" mm en la pestaña "dx".
NOTA: Dado que el rango X-scan y dx son los mismos, sólo se captura un B-scan. Las señales de PA resueltas en el tiempo multiplicadas por la velocidad del sonido en tejidos blandos (1.540 m / s) darán una imagen en línea. Múltiples líneas A se capturan durante el movimiento continuo de la etapa Y para producir un B-scan.
- Ajuste los parámetros de exploración en el software de adquisición de datos como "15" mm / s velocidad de exploración en la "velocidad" tabulación, "5" kHz en la "tasa de repetición de pulso" pestaña, "2" cm en el "Y-scan rango" Y "0,1" mm en la pestaña "rango X-scan". Ajuste el tamaño del paso en la dirección x en "0,1" mm en la pestaña "dx".
- In vivo/ Em> imágenes de la vasculatura sanguínea del oído del ratón
- Utilice un ratón hembra con un peso corporal de 25 gy una edad de 4 semanas.
- Anestesiar al animal con un cóctel de ketamina (120 mg / kg) y xilazina (16 mg / kg) inyectada por vía intraperitoneal (dosis de 0,1 ml / 10 g).
- Retire el cabello de la oreja de los animales con crema depilatoria. Limpie el área limpia. Cubra el ojo del animal con un ungüento ocular estéril para evitar que cualquier rayo láser disperso caiga sobre los ojos.
- Coloque al animal en un escenario que también tenga una placa en miniatura para colocar la oreja.
- Mantener la anestesia con isoflurano inhalado (0,75% en 1 L / min de oxígeno) durante el período de formación de imágenes.
- Sujete un oxímetro de pulso a la pierna o la cola del ratón y supervise el estado fisiológico. Permitir que la región de formación de imágenes esté en contacto con la membrana de polietileno usando gel de ultrasonidos.
- Establezca los parámetros de escaneo para el AR-PAM y presione el botón "escanear" para iniciar raster scannEn g.
- Ajuste los parámetros de escaneo para AR-PAM en el software de adquisición de datos a "15" mm / s velocidad de escaneo en la pestaña "velocidad", "1" kHz en la pestaña "tasa de repetición de pulso", "10 mm" Escala Y "y" 6 "mm en la pestaña" rango X-scan ". Ajuste el tamaño del paso en la dirección x como "30" μm en la pestaña "dx".
NOTA: El tamaño del paso en la dirección y se determina automáticamente a partir de la velocidad de la velocidad de escaneado de la etapa y de la velocidad de repetición del pulso (en este caso, 15.000 μm / 1.000 Hz = 15 μm).
- Ajuste los parámetros de escaneo para AR-PAM en el software de adquisición de datos a "15" mm / s velocidad de escaneo en la pestaña "velocidad", "1" kHz en la pestaña "tasa de repetición de pulso", "10 mm" Escala Y "y" 6 "mm en la pestaña" rango X-scan ". Ajuste el tamaño del paso en la dirección x como "30" μm en la pestaña "dx".
- Después de terminar la exploración AR-PAM, cambie la posición del cabezal de imagen de AR-PAM a OR-PAM (como se describe en la sección 2).
- Establezca los parámetros de escaneo para el OR-PAM y presione el botón "scan" para iniciar el escaneo raster.
- Ajuste los parámetros de escaneo para el OR-PAM en el software de adquisición de datos a una velocidad de escaneo de "15" mm / s en el "velocitY "," 5 "kHz en la pestaña" frecuencia de repetición de pulso "," 10 "mm en la pestaña" rango de exploración Y "y" 6 "mm en la pestaña" intervalo de exploración X. Establezca el tamaño del paso En la dirección x como "6" μm en la pestaña "dx".
NOTA: El tamaño del paso en la dirección y se determina automáticamente a partir de la velocidad de la velocidad de escaneado de la etapa y de la velocidad de repetición del pulso (en este caso, 15.000 μm / 5.000 Hz = 2 μm).
- Ajuste los parámetros de escaneo para el OR-PAM en el software de adquisición de datos a una velocidad de escaneo de "15" mm / s en el "velocitY "," 5 "kHz en la pestaña" frecuencia de repetición de pulso "," 10 "mm en la pestaña" rango de exploración Y "y" 6 "mm en la pestaña" intervalo de exploración X. Establezca el tamaño del paso En la dirección x como "6" μm en la pestaña "dx".
- Utilice los múltiples datos de B-scan almacenados en la computadora para recuperar las imágenes MAP utilizando el software de procesamiento de imágenes.
- Observe al animal durante todo el período de formación de imágenes.
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Representative Results
El esquema del sistema AR-OR-PAM se muestra en la Figura 1 . En esta configuración, todos los componentes se integraron y montaron en una configuración de jaula óptica. El uso de un sistema de jaula hace que la cabeza de exploración AR-OR-PAM sea compacta y fácilmente ensamblada, alineada e integrada en una única etapa de escaneado.
Durante la adquisición de imágenes se utilizó un escaneo ráster bidimensional continuo de la cabeza de formación de imágenes. Las señales de PA resueltas en el tiempo se multiplicaron por la velocidad del sonido (1.540 m / s) para obtener una línea A. Múltiples A-líneas capturadas durante el movimiento continuo de la etapa Y produjo el B-scan bidimensional. Múltiples escaneos B del área de imágenes fueron capturados y almacenados en el ordenador y se utilizaron para procesar y producir las imágenes fotoacústicas MAP.
Para determinar la resolución del sistema conmutable, La imagen MAP de una sola nanopartícula se utilizó [ 31] . La amplitud fotoacústica a lo largo de la dirección lateral central de la imagen se representó y se ajustó a una función de Gauss. El FWHM del ajuste gaussiano se consideró la resolución lateral. La resolución lateral medida para el AR-PAM fue de 45 μm, como se muestra en la Figura 2 a . De forma similar, una única imagen de nanopartícula adquirida usando OR-PAM se ajustó a lo largo de la dirección lateral central para determinar la resolución del OR-PAM, como se muestra en la Figura 2b . La resolución lateral medida fue de 4 μm, determinada a partir del FWHM. El recuadro de la figura muestra la imagen MAP correspondiente de la nanopartícula de oro. Teóricamente, la resolución lateral limitada por difracción óptica para AR-PAM es de 45 μm, determinada usando la siguiente ecuación: 0.72λ / NA, donde λ es la longitud de onda acústica central y NA es el valor numéricoAbertura del transductor ultrasónico. La resolución teórica coincide con los datos experimentales. De forma similar, la resolución lateral teórica para OR-PAM es de 2,6 μm, calculada con la siguiente ecuación: 0,51λ / NA, donde λ es la longitud de onda del láser y NA es la apertura numérica del objetivo. La resolución lateral medida experimentalmente para OR-PAM fue más pobre que la estimación de límite de difracción, lo que podría deberse a aberraciones de frente de onda. Dado que tanto AR como OR utilizan un transductor y una lente acústica similares, la resolución axial teórica será de 30 μm de acuerdo con 0.88 c / Δ f , donde c es la velocidad del sonido en el tejido blando y Δ f es el ancho de banda de frecuencia del transductor ultrasónico . Adicionalmente, la resolución lateral variará a lo largo de la dirección axial tanto para OR-PAM 20 como para AR-PAM 32 . Las resoluciones laterales reportadas aquí están en el plano focal.
La figura 3a muestra la fotografía de la cinta negra sobre el tejido de pollo. Se capturó una sola imagen B-scan utilizando AR-PAM y OR-PAM. La Figura 3b y la Figura 3c muestran la única imagen PA de B-scan de AR-PAM y OR-PAM, respectivamente. Es evidente a partir de la figura 3b que el sistema AR-PAM puede representar claramente la cinta negra hasta ~ 7,8 mm por debajo de la superficie del tejido. De forma similar, utilizando el sistema OR-PAM, fue posible hacer una imagen clara de la cinta negra hasta ~ 1,4 mm por debajo de la superficie del tejido ( Figura 3c ). La relación señal-ruido (SNR) también se determinó a partir de las imágenes. SNR se define como V / n , donde <Em> V es la amplitud de señal PA de pico a pico yn es la desviación estándar del ruido de fondo. La SNR medida a las profundidades de imagen de 4,6 mm y 7,8 mm fue de 2,6 y 1,4, respectivamente. Para OR-PAM, la SNR a una profundidad de formación de imágenes de 1,4 mm fue de 1,4. Para demostrar la capacidad de formación de imágenes biológicas del sistema AR-OR PAM conmutable, se realizó una formación de imagen de vasculatura sanguínea in vivo en un oído de ratón. En la Figura 4 a se muestra una fotografía que muestra la anatomía vascular del oído vivo del ratón utilizado para la obtención de imágenes. Utilizando AR-PAM, se visualizó una región de exploración de 10 mm x 6 mm, con un tamaño de paso de 15 μm en la dirección Y y 30 μm en la dirección X. La imagen tardó 10 minutos en completarse. Actualmente, el sistema de formación de imágenes adquiere datos sólo en una dirección; El tiempo de adquisición se puede reducir a casi la mitad modificando el programa para tener una capacidad bidireccional de adquisición de datos. Una imagen MAP de AR-PAM se muestra en la Figura 4B. El primer plano de la región de interés se muestra en la Figura 4 c . En la Figura 4 d se muestra un área similar escaneada usando OR-PAM, con un paso de 3 μm en la dirección Y y 6 μm en la dirección X. La imagen tardó 46 minutos en completarse. El primer plano de la región de interés se muestra en la Figura 4 e . OR-PAM puede resolver claramente los capilares individuales, que AR-PAM no puede resolver. AR-PAM puede resolver los vasos más gruesos de 45 μm.
En resumen, se ha desarrollado un sistema AR-OR-PAM conmutable que puede conseguir imágenes de alta resolución utilizando enfoque óptico ajustado, así como imágenes de tejidos profundos usando enfoque acústico. El rendimiento del sistema AR-OR-PAM conmutable se cuantificó usando medidas de resolución lateral y de profundidad de formación de imágenes. Stud in vivoTambién se realizaron para mostrar su capacidad de imagen biológica. Este sistema de microscopía fotoacústica conmutable puede proporcionar una alta resolución temporal y espacial, lo que hace que el sistema sea importante para aplicaciones que incluyen imágenes de angiogénesis, respuesta de fármacos, etc. , donde es importante la formación de capilares individuales así como vasculares profundas. Otras modificaciones o mejoras al sistema pueden hacerse reemplazando la placa conmutable hecha en casa con una etapa motorizada de 10 cm (eje Y). La resolución lateral del OR-PAM puede mejorarse adicionalmente corrigiendo las aberraciones del frente de onda. La entrega de una mayor energía de pulso al AR-PAM mejorará también la SNR y las profundidades de formación de imágenes.
En el caso de OR-PAM, asumiendo que el foco óptico es de 150 μm por debajo de la superficie de la piel para la formación de imágenes in vivo , el tamaño del punto superficial era de 22,5 μm de diámetro. La entrega de un solo pulso láser de 90 nJ da una maEnergía de pulso máxima de 20,4 mJ / cm2. Para AR-PAM, el foco láser fue de 2 mm de diámetro. El suministro de un solo pulso láser de 50 μJ proporciona una energía máxima del pulso en el punto focal de 1,6 mJ / cm 2 , dentro del límite de seguridad ANSI de 20 mJ / cm2 , 33 .
Figura 1 : Esquema del sistema de imágenes AR-OR-PAM. (A) BS: sampler de haz, NDF: filtro de densidad neutra, RAP - prisma de ángulo recto, PD: fotodiodo, CL: lente de condensador, PH: agujero de alfiler, FC: acoplador de fibra, UST: transductor de ultrasonido, MMF: Fibra monomodo, DAQ: tarjeta de adquisición de datos, TS: etapa de traducción, Con.L: lente cónica, L1: lente convexa, L2 y L3: lente acromática, RA: prisma de ángulo recto, RP: prisma romboidal, OC: óptico Condensador, M: mIrror, SP: placa de deslizamiento, LT: tubo de lente, TM: montaje de traslación, KMM: montaje de espejo cinemático, y AL: lente acústica. ( B ) Fotografía del prototipo del sistema AR-OR-PAM. C ) Primer plano del combinador de haz optoacústico. ( D ) Primer plano del condensador óptico con un UST en el centro. Reimpreso de la referencia 34 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Prueba de Resolución Lateral del Sistema AR-OR-PAM: Resolución lateral estimada por nanopartículas de oro con imágenes de ~ 100 nm de diámetro. Puntos negros (*): señal fotoacústica; Línea azul: curva ajustada gaussiana para ( a ) AR-PAM y ( b )OR-PAM. La inserción muestra la imagen AR-PAM representativa en (a) y la imagen OR-PAM en (b) de la nanopartícula de oro único. Reimpreso de la referencia 34 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Mediciones de Profundidad de Imagen: Una sola imagen B-scan PA de una cinta negra insertada oblicuamente sobre el tejido de pollo. A) Diagrama esquemático. ( B ) imagen AR-PAM. ( C ) imagen de OR-PAM. Reimpreso de la referencia 34 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Imagen fotoacústica in vivo de un oído de ratón: ( a ) Fotografía de la vasculatura del oído del ratón. (B) imagen AR-PAM. ( C ) Primer plano de la región de interés (ROI) en ( b ), como se muestra con una línea blanca discontinua. ( D ) imagen de OR-PAM. ( E ) Región de interés (ROI) en ( d ), como se muestra con una línea punteada blanca. ( F ) Imagen en primer plano de la línea blanca de ROI en (e) que muestra un solo capilar. Reimpreso de la referencia 34 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En conclusión, se ha desarrollado un sistema AR y OR PAM conmutable que puede conseguir tanto imágenes de alta resolución a profundidades de formación de imágenes inferiores como imágenes de baja resolución a profundidades de formación de imágenes más altas. Se determinó la resolución lateral y la profundidad de formación de imágenes del sistema conmutable. Las ventajas de este sistema PAM conmutable incluyen: (1) la formación de imágenes de alta resolución utilizando enfoque óptico ajustado; (2) la obtención de imágenes de tejidos profundos usando enfoque acústico; 3) la iluminación de campo oscuro para AR-PAM, que impide que aparezcan fuertes señales PA en la superficie de la piel; 4) la capacidad de mantener la muestra en un lugar, sin moverla entre diferentes sistemas; 5) la posibilidad de evitar el uso de múltiples láseres y etapas de escaneo; Y 6) el uso mínimo de componentes caseros. Esta es la primera combinación reportada de OR-PAM y AR-PAM de campo oscuro que proporciona imágenes de alta resolución, de poca profundidad e imágenes de fondo profundo de baja resolución de la misma muestra sin mover la muestra / obJect El uso de la misma etapa de escaneo y el láser hace que el sistema sea eficiente, así como rentable. El sistema combinado tiene una resolución lateral de 4 μm con una profundidad de imagen de 1,4 mm, así como una resolución lateral de 45 μm con una profundidad de imagen de 7,8 mm. El sistema está hecho de un sistema de jaulas ópticas con un mínimo de componentes hechos en casa, lo que hace más fácil de montar, alinear y cambiar entre el AR y OR PAM. La cabeza de exploración combinada es compacta y se puede montar fácilmente en una única etapa de escaneado. Utilizando el sistema combinado, se demostró con éxito la obtención de imágenes in vivo .
El sistema desarrollado puede utilizarse para imágenes preclínicas. Las principales aplicaciones preclínicas incluyen la imagen de angiogénesis, microambientes tumorales, microcirculación, respuesta a fármacos, funciones cerebrales, biomarcadores y actividades génicas. Las limitaciones del sistema incluyen el tiempo de escaneado. Actualmente se necesita un tiempo de exploración largo, pero se puede reducir mediante la adquisición de datos en botH. La adquisición simultánea de imágenes entre OR-PAM y AR-PAM no es posible en la actualidad. En la actualidad, es necesario cambiar manualmente entre OR-PAM y AR-PAM, lo que puede evitarse utilizando una etapa de traducción que tenga al menos 10 cm de movimiento en Y. Los pasos críticos en el protocolo incluyen la determinación confocal del foco óptico y acústico; La obtención de tamaños de puntos ópticos menores de 5 μm para OR-PAM, para capilar capilares únicos de imagen; Y el diseño del combinador de haz optoacústico para el OR-PAM y del condensador óptico para el AR-PAM.
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Disclosures
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas y los reglamentos de la Institutional Animal Cuidado y Comité de Uso de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur (Animal Protocolo Número ARF-SBS / NIE-A0263). Los autores no tienen intereses financieros relevantes en el manuscrito y no hay otros posibles conflictos de interés que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el apoyo financiero de una subvención de Nivel 2 financiada por el Ministerio de Educación de Singapur (ARC2 / 15: M4020238). Los autores también quisieran agradecer al Sr. Chow Wai Hoong Bobby por la ayuda de la tienda de maquinaria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
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