Summary
Hierbij is een AR-OR-PAM-systeem (AR) of schakelbare akoestische resolutie (AR) en optische resolutie (OR), die zowel in hoge resolutie als in hoge resolutie kan worden ingezet, met een lage resolutie van diepe weefsels op een zelfde monster in vivo .
Abstract
Photoacoustic microscopy (PAM) is een snelgroeiende invivo imaging modaliteit die zowel optica als ultrasound combineert, waardoor penetratie boven het optische gemiddelde vrije pad (~ 1 mm in de huid) met hoge resolutie wordt bereikt. Door optisch absorptiecontrast te combineren met de hoge ruimtelijke resolutie van echografie in een enkele modaliteit, kan deze techniek diep diepe weefsels penetreren. Photoacoustic microscopiesystemen kunnen een lage akoestische resolutie hebben en een diep of een hoge optische resolutie en sonde ondiep maken. Het is uitdagend om een hoge ruimtelijke resolutie en grote dieptepenetratie met een enkel systeem te bereiken. Dit werk presenteert een AR-OR-PAM systeem dat zowel op hoge vlakken beeldvorming op vlakke diepten mogelijk maakt en diepte-weefselbeelden met een lage resolutie van hetzelfde monster in vivo mogelijk maken . Een laterale resolutie van 4 μm met een beelddiepte van 1,4 mm met optische focus en een zijdelingse resolutie van 45 μm met een beelddiepte van 7,8 mm met behulp van akoestische focus was succesvolHet is aangetoond dat het gecombineerde systeem gebruikt wordt. Hier wordt in vivo kleine dieren bloedvasculaire beeldvorming uitgevoerd om zijn biologische beeldvormingsvermogen te demonstreren.
Introduction
Optische beeldvormingsmodaliteiten met hoge resolutie, zoals optische coherentie-tomografie, confocal microscopie en multiphoton microscopie, hebben veel voordelen. De ruimtelijke resolutie neemt echter aanzienlijk af, aangezien de beelddiepte toeneemt. Dit komt door de diffuse aard van lichtvervoer in zachte weefsels 1 , 2 . De integratie van optische excitatie- en ultrageluiddetectie biedt een oplossing om de uitdaging van optische beeldoplossing met hoge resolutie te overwinnen in diepe weefsels. Photoacoustic microscopy (PAM) is een dergelijke modaliteit die diepere beeldvorming kan bieden dan andere optische beeldvormende modaliteiten. Het is succesvol toegepast op in vivo structurele, functionele, moleculaire en celbeelden 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 studies door het sterke optische absorptiecontrast te combineren met de hoge ruimtelijke resolutie van echografie.
In PAM bestralt een korte laserpuls het weefsel / monster. De absorptie van licht door chromophoren ( bijv. Melanine, hemoglobine, water, enz. ) Resulteert in een temperatuurverhoging, wat op zijn beurt resulteert in de productie van drukgolven in de vorm van akoestische golven (foto-akoestische golven). De gegenereerde foto-akoestische golven kunnen gedetecteerd worden door een breedband-ultrasone transducer buiten de weefselgrens. Met behulp van een zwakke optische en strakke akoestische focus, kan beeldweergave worden verkregen in fotocoustische microscopie met een akoestische resolutie (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . In AR-PAM, een zijdelingse resolutie van 45 μm en een beelddiepte tot 3 mm is aangetoond 15 . Om eenvormige capillairen (~ 5 μm) akoestisch op te lossen, zijn ultrasone transducers die werken bij> 400 MHz centrale frequenties nodig. Bij dergelijke hoge frequenties is de penetratiediepte minder dan 100 μm. Het probleem veroorzaakt door strakke akoestische focus kan worden opgelost met behulp van strakke optische focus. Optische resolutie fotoacoustic microscopie (OR-PAM) kan single capillaries oplossen, of zelfs een enkele cel 17 , en een laterale resolutie van 0,5 μm is bereikt 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Het gebruik van een fotonische nanojet kan helpen om een resolutie te bereiken buiten de diffractie beperkte resolutioN 25 , 26 . In OR-PAM is de penetratiediepte beperkt door lichtfocus en het kan tot 1,2 mm in het biologische weefsel 23 afbeelden. Daarom kan AR-PAM beeld dieper, maar met een lagere resolutie, en OR-PAM een beeld met een zeer hoge resolutie, maar met een beperkte beelddiepte hebben. De beeldsnelheid van het AR- en OR-PAM-systeem hangt voornamelijk af van de pulsherhalingssnelheid van de laserbron 27 .
Het combineren van AR-PAM en OR-PAM is van groot voordeel voor toepassingen die zowel een hoge resolutie als dieper beeldvorming vereisen. Er is weinig moeite gedaan om deze systemen samen te combineren. Gewoonlijk worden twee verschillende afbeeldingsscanners gebruikt voor beeldvorming, wat vereist dat het monster tussen beide systemen wordt verplaatst, waardoor het moeilijk is in vivo beeldvorming te maken. Hybride beeldvorming met zowel AR als OR PAM maakt imaging met schaalbare resoluties a mogelijkDiepte. In één benadering wordt een optische vezelbundel gebruikt om licht te leveren voor zowel de AR- als OR-PAM. In deze aanpak worden twee afzonderlijke lasers (een hoge-energie laser bij 570 nm voor de AR en een laser met lage energie, hoge repetitiesnelheid bij 532 nm voor de OR) gebruikt, waardoor het systeem ongemakkelijk en duur is 28 . De OR-PAM laser golflengte is vast en veel studies, zoals op zuurstofverzadiging, zijn niet mogelijk met dit gecombineerde systeem. Vergelijkende studies tussen AR en OR PAM zijn ook niet mogelijk vanwege het verschil in laser golflengten tussen de AR en OR. Bovendien gebruikt AR-PAM helderveldverlichting; Daarom beperken sterke beeld-akoestische signalen van het huidoppervlak de beeldkwaliteit. Om deze reden kan het systeem niet worden gebruikt voor veel bioimaging toepassingen. In een andere aanpak om AR en OR PAM uit te voeren, wordt de optische en ultrasone focus verplaatst, waardoor de focus op de lichtfocus en de ultrasone focus ongewijzigd wordt. Zo is de beeldkwaliteit niet optimaal 30 . In al deze gevallen heeft AR-PAM geen gebruik gemaakt van donkere veldverlichting. Het gebruik van donkere veldverlichting kan de generatie van sterke foto-akoestische signalen van het huidoppervlak verminderen. Derhalve kan diepvliesafbeelding worden uitgevoerd met behulp van ringvormige verlichting, aangezien de detectiegevoeligheid van diepe foto-akoestische signalen hoger zal zijn dan die van verlichte veldverlichting.
Dit werk rapporteert een omschakelbaar AR en OR PAM-beeldscherm (AR-OR-PAM), dat zowel beeldscherm met hoge resolutie mogelijk maakt en met een lage resolutie beeldweergave van hetzelfde beeld, met dezelfde laser en scanner voor beide systems. De prestatie van het AR-OR-PAM-systeem werd gekenmerkt door het bepalen van de ruimtelijke resolutie en beelddiepte door middel van fantoom experimenten. In vivo bloedvasculatuur beeldvorming werd uitgevoerd op een muis oor om zijn biologische beeldvorming vermogen te demonstreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde voorschriften en richtlijnen van het Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee van Nanyang Technologische Universiteit, Singapore (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263).
1. AR-OR-PAM-systeem ( figuur 1 )
- Systeem configuratie: AR-PAM
- Gebruik een nanoseconde afstelbaar lasersysteem dat bestaat uit een diodepompde ND-YAG laser (532 nm) en een kleurstoflaser met een afstelbereik van 559-576 nm als de optische bestralingsbron. Stel de laser golflengte in op 570 nm met behulp van een externe controller en de herhalingssnelheid van de laser tot 1 kHz met behulp van de lasersoftware.
- Plaats een straalsamensteller bij een 45 ° -hoek voor de laser om 5% van de laservermogen naar een fotodiode door een variabel neutraaldichtheidsfilter (NDF1; OD = 0-4.0) af te leiden.
- Verwijder de laserstraal na de beam sampler op 90 ° met behulp vanEen rechthoekig prisma (RAP1).
- Gebruik een ander rechtshoekig prisma (RAP2) om de bundel door een variabele neutrale dichtheidsfilter (NDF2; OD = 0-4.0) en op een multimodevezel (MMF) door te geven via een vezelkoppeling (FC) -a Combinatie van doelstellingen (numerieke diafragma (NA): 0,25) en een XY-vertaler.
- Bevestig de vezel op de aftastfase met behulp van een XY-vertaler. Plaats een plano-convexe lens (L1) 25 mm van het uiteinde van de vezeluitgang om de bundel uit de vezel te bundelen.
- Passeer de collimated beam door een conische lens met een hoekhoek van 130 ° om een ringvormige balk te genereren. Scherp de ringvormige balk op het onderwerp met behulp van een zelfgemaakte optische condensor (OC) met kegelhoeken van 70 ° en 110 ° en met een gat in het midden.
- Plaats een 50 MHz ultrasone transducer (UST) met een akoestische lens (AL) in het midden van de zelfgemaakte condensor.
- Systeemconfiguratie: OR-PAM
- Gebruik eenNanoseconde afstembaar lasersysteem bestaande uit een diode-gepompde ND-YAG laser (532 nm) en een kleurstoflaser met een afstellingsbereik van 559 - 576 nm als de optische bestralingsbron. Stel de laser golflengte op 570 nm aan met behulp van een externe controller en de herhalingssnelheid van de laser bij 5 kHz met behulp van de lasersoftware.
- Draai de computer gestuurde draaistadium (houd de RAP1) 90 ° om de laserstraal op een iris af te leiden om te herstellen.
- De laserstraal verzwakken door een variabel neutraal dichtheidsfilter (OD: 0-4.0) langs de balk te plaatsen en de balk vervolgens met een condensorlens (CL) te richten. Verzend het via een pinhole (PH) 75 mm van de CL voor ruimtelijke filtering.
- Start de ruimtelijk gefilterde straal op een single-mode fiber (SMF) met een single-mode fiber coupler (FC) bestaande uit een 0,1 NA objectief om de lichtbundel op de SMF te concentreren.
- Stel de vezelkoppeling aan om de maximale koppelingsefficiëntie te bereiken.
- Zet de vezel uit op tHij scant podium met behulp van een slipplaat (SP). Plaats een achromatische lens (L2) 50 mm van de SM-vezel om de laserstraal te collimeren.
- Breng de collimated beam door 90 ° door middel van een kinematische regelbare elliptische spiegel (M) om de achterste opening van een andere identieke achromatische lens (L3) te vullen. Plaats de achromatische lens die wordt gebruikt voor het concentreren op een translation mount (TM2) met behulp van een lensbuis (LT).
- Ga de focusstraal door een zelfgemaakte optoacoustic beam combiner, bestaande uit een rechthoekig prisma (RA) en een rhomboid prisma (RP), met een laag siliciumolie (SO) tussenin.
OPMERKING: De siliciumolielaag zal optreden als optisch transparante en akoestisch reflecterende film. - Bevestig een akoestische lens (AL) om akoestische focus te geven (brandpuntsdiameter: ~ 46 μm) aan de onderkant van het rhomboid prisma.
- Plaats de ultrasone transducer met een 50 MHz-middenfrequentie bovenop het rhomboid prisma; Gebruik een epoxielaag voor effectieve koppeling.
2. Systeem schakelen en uitlijnen - Zet de zelfgemaakte schakelbare plaat vast (door de schroefdraad vast te zetten) op een 3-assige gemotoriseerde trap die wordt geregeld door een 3-assige controller die op de computer is aangesloten.
- Bevestig het AR- en OR-koetsysteem op de zelfgemaakte plaat met behulp van kooi-bevestigingsbeugels, zodat u gemakkelijk tussen de AR- en OR-scankoppen kunt schakelen. Schuif de scankop bovenop het beeldgebied.
- Gebruik de Z-fase om het onderkant van de AR-OR-PAM-scannerkop in een water-gevulde acrylreservoir (13 cm x 30 cm x 3 cm) te onderdompelen voor akoestische koppeling.
- Open een afbeeldingsvenster met een diameter van 7 cm op de bodemplaat van de tank en sluit het met een polyethyleenmembraan voor optische en akoestische overbrenging.
- Gebruik een puls-echoversterker en een oscilloscoop om de ultrasone transducer in focus te richten.
- Stel de versterking in de pulse-echo versterker op 24 db in de transmissie / ontvangstmodus.
- Gebruik het synchronisatie-signaal frOm de pulse-echo versterker als de trigger en detecteer het teruggespredende signaal van een glazen glijbaan (ingevoegd vanaf de bodem van de watertank) met behulp van een oscilloscoop.
OPMERKING: op de dia moet een zwarte band er op zitten. - Verplaats de Z-as om de amplitude van het pulse-echosignaal te maximaliseren (gezien op de oscilloscoop).
OPMERKING: wanneer de glasplaat in focus is, zal de echo zijn maximale amplitude hebben.
- Zet de laser aan en verbind de UST met twee versterkers, elk met 24 dB vaste gain, met behulp van BNC-kabels.
OPMERKING: De uitgangen van de versterkers zijn aangesloten op de data acquisition card (DAQ). - Gebruik het signaal van de fotodiode (PD) die voor de laser is geplaatst als trigger voor het data-acquisitie systeem.
- In AR-PAM varieer de afstand tussen de conische lens (con.L) en de optische condensor (OC) om de amplitude van het foto-akoestische signaal dat wordt gegenereerd uit het testobject (maximale band vast op een glasdia) te maximaliseren.Zorg ervoor dat de optische en akoestische focusen confocaal zijn door de maximale foto-akoestische (PA) signaal amplitude te bepalen.
- Let op de vertraging van de maximale PA signalen; Gebruik dit later om de focus in de data acquisition software te controleren.
- Draai de schroef van de aftastkop los en schakel de aftastkop handmatig van AR-PAM naar OR-PAM. Draai vervolgens de schroeven vast.
- In OR-PAM, varieer de afstand tussen de focusende achromatische dubbele (in de lensbuis (LT)) en de opto-akoestische combinator om de PA-signaal amplitude die op de oscilloscoop wordt weergegeven, te maximaliseren.
- Let op de vertraging van de maximale PA signalen.
OPMERKING: Finetuning is nodig om de confocale regeling te bepalen.
- Let op de vertraging van de maximale PA signalen.
- Laterale resolutie en beelddieptekwantificatie
- Gebruik gouden nanodeeltjes 100 nm in diameter om de laterale resolutie van de AR an te bepalenD OF systeem.
- Verdun 0,1 ml nanodeeltjesoplossing met een gelijke hoeveelheid water. Verdeel 0,1 ml verdunde oplossing op een deklaag en plaats het in contact met het polyethyleenmembraan onder de tank.
- Zorg ervoor dat de AR-PAM en OR-PAM in de gegevensverzamelingssoftware (zie de Tabel van Materialen) voor het scannen (stappen 2.8 en 2.10) in focus zijn.
OPMERKING: Door de microsecondvertraging van de maximale PA-signalen van stappen 2.9 en 2.10 te weten, vermenigvuldigd met de bemonsteringssnelheid (250 MS / s), wordt de afbeelding in focus in de data-acquisitie software. De vertraging die moet worden weggelaten tijdens de gegevensverzameling kan in de software worden bepaald, zodat alleen de benodigde gegevenspunten voor de verwerking worden opgeslagen. - Stel de scanparameters voor de AR-PAM in en druk op de "scan" -knop om het raster-scannen te starten.
- Stel de scanparameters voor de AR-PAM in de gegevensverzamelingssoftware bij de "snelheid" van "4" mm / s scansnelheid in.; Tabblad "1" kHz in het tabblad "Pulsherhalingstijd", "0,5" mm in het tabblad "Y-scanbereik" en "0,5" mm in het tabblad "X-scanbereik". Stel de stapgrootte in de x-richting op "4" μm in het tabblad "dx".
OPMERKING: De stapgrootte in de y-richting wordt automatisch bepaald op basis van de snelheid van het scansnelheid van het podium en de pulsherhalingssnelheid (in dit geval 4000 μm / 1000 Hz = 4 μm)
- Stel de scanparameters voor de AR-PAM in de gegevensverzamelingssoftware bij de "snelheid" van "4" mm / s scansnelheid in.; Tabblad "1" kHz in het tabblad "Pulsherhalingstijd", "0,5" mm in het tabblad "Y-scanbereik" en "0,5" mm in het tabblad "X-scanbereik". Stel de stapgrootte in de x-richting op "4" μm in het tabblad "dx".
- Stel de scanparameters voor de OR-PAM in en druk op de "scan" -knop om het raster-scannen te starten.
- Stel de scanparameters in de gegevensverzamelingssoftware op met de "2.5" mm / s scansnelheid in het tabblad "snelheid", "5" kHz in het tabblad "Pulsherhalingstijd", "0,5" mm in het bereik "Y-scan" Tabblad en "0.5" mm in het tabblad "X-scan bereik". Stel de stapgrootte in de x-richting een "0,5" μm in het tabblad "dx".
OPMERKING: De sTape grootte in de y-richting wordt automatisch bepaald op basis van de snelheid van de scansnelheid van het podium en de pulsherhalingssnelheid (in dit geval 2,500 μm / 5000 Hz = 0,5 μm).
- Stel de scanparameters in de gegevensverzamelingssoftware op met de "2.5" mm / s scansnelheid in het tabblad "snelheid", "5" kHz in het tabblad "Pulsherhalingstijd", "0,5" mm in het bereik "Y-scan" Tabblad en "0.5" mm in het tabblad "X-scan bereik". Stel de stapgrootte in de x-richting een "0,5" μm in het tabblad "dx".
- Zorg ervoor dat tijdens het scannen de gegevens continu worden opgeslagen en opgeslagen op de computer
OPMERKING: Gegevens worden alleen in één bewegingsrichting van de Y-fase ingehaald. - Gebruik de meervoudige B-scan data die in de computer is opgeslagen om de maximale amplitude projectie (MAP) afbeeldingen op te halen met behulp van beeldverwerkingssoftware (zie de Tabel van Materialen ).
- Gebruik een enkel nanopartikelbeeld (uit meerdere afbeeldingen) van de scan om de laterale resolutie te bepalen door handmatig een lijn te plotten via het centrale gebied van het nanopartikelbeeld om een puntverdeling te verkrijgen, die lijkt op de Gaussische kromme. Zie figuur 2 .
- Pas de puntenspreidingsfunctie aan die uit een enkel nanopartikelbeeld wordt verkregen met behulp van een GauSsian fit functie en meet de volledige breedte bij half maximum (FWHM) met behulp van beeldverwerkingssoftware (zie de Tabel van Materialen ). Gebruik dit als de laterale resolutie. Zie figuur 2 .
- Steek een stuk zwarte band schuin op een stuk gesneden kipweefsel als het doelobject voor dieptebeelden. Plaats het weefsel met de band in de watertank.
OPMERKING: De zwarte band zit vast aan een metalen plaat met een scherpe punt, die helpt om de band aan het weefsel te bevestigen. - Stel de scanparameters voor de AR-PAM in de data acquisition software en druk vervolgens op de scan knop om een enkele B-scan afbeelding vast te leggen om de maximale beelddiepte te bepalen.
- Stel de scanparameters in bij de "15" mm / s scansnelheid in het tabblad "snelheid", "1" kHz in het tabblad "Pulsherhalingstijd", "5" cm in het tabblad "Y-scan" en "0,1" "Mm in het tabblad" X-scan bereik ". Stel tHij stapformaat in de x-richting bij "0,1" mm in het tabblad "dx".
- Stel de scanparameters voor de OR-PAM in en druk op de "scan" -knop om een enkel B-scanbeeld vast te leggen om de maximale afbeeldingsdept te bepalen.
- Stel de scanparameters in de gegevensverzamelingssoftware in als "15" mm / s scansnelheid in het tabblad "snelheid", "5" kHz in het tabblad "Pulsherhalingssnelheid", "2" cm in het bereik "Y-scan" Tabblad en "0.1" mm in het tabblad "X-scan bereik". Stel de stapgrootte in de x-richting op "0.1" mm in het tabblad "dx".
OPMERKING: Aangezien het X-scan bereik en dx hetzelfde zijn, wordt er slechts één B-scan vastgelegd. De tijdopgeloste PA signalen vermenigvuldigd met de geluidssnelheid in zacht weefsel (1.540 m / s) geven een A-lijn beeld. Meerdere A-lijnen worden vastgelegd tijdens de continue beweging van de Y-fase om een B-scan te produceren.
- Stel de scanparameters in de gegevensverzamelingssoftware in als "15" mm / s scansnelheid in het tabblad "snelheid", "5" kHz in het tabblad "Pulsherhalingssnelheid", "2" cm in het bereik "Y-scan" Tabblad en "0.1" mm in het tabblad "X-scan bereik". Stel de stapgrootte in de x-richting op "0.1" mm in het tabblad "dx".
- In vivo </ Em> beeldvorming van de muisoorbloedvasculatuur
- Gebruik een vrouwelijke muis met een lichaamsgewicht van 25 g en een leeftijd van 4 weken.
- Verdoof het dier met behulp van een cocktail van ketamine (120 mg / kg) en xylazine (16 mg / kg) intraperitoneaal geïnjecteerd (dosering van 0,1 ml / 10 g).
- Verwijder het haar van het dieroor met behulp van haarverwijderingsroom. Veeg het gebied schoon. Bedek het oog van het dier met een steriele oculaire zalf om elke verspreide laserstraal op de ogen te voorkomen.
- Plaats het dier op een podium dat ook een miniatuurplaat heeft om het oor te plaatsen.
- Anesthesie onderhouden met inhalatie isofluraan (0,75% in 1 L / min zuurstof) gedurende de beeldperiode.
- Klem een pulsoximeter aan het muisbeen of de staart en controleer de fysiologische status. Laat de beeldvormende regio in contact komen met het polyethyleenmembraan met behulp van ultrasone gel.
- Stel de scanparameters voor de AR-PAM in en druk op de "scan" knop om de raster scan te startening.
- Stel de scanparameters voor de AR-PAM in de gegevensverzamelingssoftware op "15" mm / s scansnelheid in het tabblad "snelheid", "1" kHz in het tabblad "Pulsherhalingssnelheid", "10 mm" in de " Y-scan bereik "tabblad en" 6 "mm in het tabblad" X-scan bereik ". Stel de stapgrootte in de x-richting in als "30" μm in het tabblad "dx".
OPMERKING: De stapgrootte in de y-richting wordt automatisch bepaald op basis van de snelheid van de scansnelheid van het podium en de pulsherhalingssnelheid (in dit geval 15.000 μm / 1000 Hz = 15 μm).
- Stel de scanparameters voor de AR-PAM in de gegevensverzamelingssoftware op "15" mm / s scansnelheid in het tabblad "snelheid", "1" kHz in het tabblad "Pulsherhalingssnelheid", "10 mm" in de " Y-scan bereik "tabblad en" 6 "mm in het tabblad" X-scan bereik ". Stel de stapgrootte in de x-richting in als "30" μm in het tabblad "dx".
- Na het afronden van AR-PAM scan, schakel de beeldkopkoppositie van AR-PAM naar OR-PAM (zoals beschreven in sectie 2).
- Stel de scanparameters voor de OR-PAM in en druk op de "scan" -knop om het raster-scannen te starten.
- Stel de scanparameters voor de OR-PAM in de data-acquisitie software in bij "15" mm / s scan snelheid in de "velocitY "tabblad" 5 "kHz in het tabblad" Pulsherhalingssnelheid "," 10 "mm in het tabblad" Y-scan "en" 6 "mm in het tabblad" X-scan bereik ". Stel de stapgrootte in In de x-richting als "6" μm in het tabblad "dx".
OPMERKING: De stapgrootte in de y-richting wordt automatisch bepaald op basis van de snelheid van het scansnelheid van het podium en de pulsherhalingssnelheid (in dit geval 15.000 μm / 5000 Hz = 2 μm).
- Stel de scanparameters voor de OR-PAM in de data-acquisitie software in bij "15" mm / s scan snelheid in de "velocitY "tabblad" 5 "kHz in het tabblad" Pulsherhalingssnelheid "," 10 "mm in het tabblad" Y-scan "en" 6 "mm in het tabblad" X-scan bereik ". Stel de stapgrootte in In de x-richting als "6" μm in het tabblad "dx".
- Gebruik de meervoudige B-scan-gegevens die op de computer zijn opgeslagen om de MAP-afbeeldingen op te halen met behulp van beeldverwerkingssoftware.
- Houd het dier gedurende de gehele beeldvormingsperiode in acht.
3. Experimentele stappen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schema van het AR-OR-PAM-systeem is weergegeven in figuur 1 . In deze setup werden alle componenten geïntegreerd en gemonteerd in een optische kooi-installatie. Het gebruik van een kooi systeem maakt de AR-OR-PAM scankop compact en gemakkelijk op elkaar gemonteerd, uitgelijnd en geïntegreerd in een enkele scan fase.
Twee-dimensionale continue raster-scanning van de beeldkop werd gebruikt bij het maken van beelden. De tijdopgeloste PA signalen werden vermenigvuldigd met de geluidsnelheid (1.540 m / s) om een A-lijn te verkrijgen. Meerdere A-lijnen die tijdens de continue beweging van de Y-fase werden gevangen, produceerden de tweedimensionale B-scan. Meerdere B-scans van het beeldgebied werden vastgelegd en opgeslagen in de computer en werden gebruikt om de MAP-foto-akoestische beelden te verwerken en te produceren.
Om de resolutie van het switchable systeem te bepalen, Werd het MAP-beeld van een enkele nanodeeltje gebruikt 31 . De foto-akoestische amplitude langs de centrale zijdelingse richting van de afbeelding werd opgesteld en gemonteerd op een Gaussische functie. De FWHM van de Gaussische fit werd beschouwd als de laterale resolutie. De gemeten laterale resolutie voor de AR-PAM was 45 μm, zoals getoond in figuur 2 a . Op dezelfde manier werd een enkele nanopartikelbeeld verkregen met behulp van OR-PAM aangebracht langs de centrale zijrichting om de resolutie van de OR-PAM te bepalen, zoals getoond in figuur 2b . De gemeten laterale resolutie was 4 μm, bepaald uit de FWHM. De invoegtoepassing van de figuur toont het bijbehorende MAP-beeld van de gouden nanopartikel. Theoretisch is de optische diffractie beperkte laterale resolutie voor AR-PAM 45 μm, bepaald onder gebruikmaking van de volgende vergelijking: 0.72 A / NA, waar A de centrale akoestische golflengte is en NA de numeriekeDiafragma van de ultrasone transducer. De theoretische resolutie komt goed overeen met de experimentele gegevens. Evenzo is de theoretische laterale resolutie voor OR-PAM 2,6 μm, zoals berekend met de volgende vergelijking: 0,51λ / NA, waar λ de laser golflengte is en NA de numerieke diafragma van het doel is. De experimenteel gemeten laterale resolutie voor OR-PAM was slechter dan de diffractie-limiet schatting, die kan zijn te wijten aan wavefront aberraties. Aangezien zowel AR als OR een soortgelijke transducer en akoestische lens gebruikt, is de theoretische axiale resolutie 30 μm volgens 0,88 c / Δf, waarbij c de snelheid van het geluid in zacht weefsel is en Δ f de frequentiebandbreedte van de ultrasone transducer . Bovendien zal de laterale resolutie variëren langs de axiale richting voor zowel OR-PAM 20 als AR-PAM 32 . De gerapporteerde laterale resoluties zijn hier op het brandpunt.
Figuur 3a toont de foto van de zwarte band op kippenweefsel. Een enkel B-scan beeld werd gevangen met zowel AR-PAM als OR-PAM. Figuur 3b en Figuur 3c tonen het enkele B-scan PA beeld van respectievelijk AR-PAM en OR-PAM. Uit figuur 3b blijkt dat het AR-PAM-systeem de zwarte band duidelijk tot ~ 7,8 mm onder het weefseloppervlak kan afbeelden. Op dezelfde manier was het mogelijk om de zwarte tape duidelijk tot ~ 1,4 mm onder het weefseloppervlak duidelijk te maken ( Figuur 3c ). De signaal-ruisverhouding (SNR) werd ook bepaald uit de beelden. SNR is gedefinieerd als V / n , waar <Em> V is de piek-naar-piek-PA signaal amplitude en n is de standaard afwijking van de achtergrondgeluid. De SNR gemeten op respectievelijk 4,6 mm en 7,8 mm beelddiepte waren respectievelijk 2,6 en 1,4. Voor OR-PAM was de SNR bij een beelddiepte van 1,4 mm 1,4. Om het biologische beeldvormingsvermogen van het omschakelbare AR-OR PAM-systeem te demonstreren, werd in vivo bloedvasculatuurbeeldvorming op een muisoor uitgevoerd. Een foto die de vaatanatomie van het levende muisoor toont dat wordt gebruikt voor beeldvorming, wordt getoond in figuur 4a . Met behulp van AR-PAM werd een scangebied van 10 mm x 6 mm afgebeeld, met een stapgrootte van 15 μm in de Y-richting en 30 μm in de X-richting. De beeldvorming duurde 10 minuten om te voltooien. Momenteel verwerft het beeldsysteem slechts gegevens in één richting; De aanschafstijd kan tot bijna de helft worden verminderd door het programma te wijzigen om een tweerichtingsverzamelingsvermogen te verkrijgen. Een kaartbeeld van AR-PAM is in figuur 4 te zienB. De nabijheid van de regio van belang is getoond in figuur 4c . Een soortgelijk gebied dat is gescand met OR-PAM, met een stapgrootte van 3 μm in de Y-richting en 6 μm in de X-richting, wordt getoond in figuur 4 d . De beeldvorming duurde 46 minuten om te voltooien. De nabijheid van de regio van belang is getoond in figuur 4 e . OR-PAM kan duidelijk capillairen oplossen, welke AR-PAM niet kan oplossen. AR-PAM kan schepen dikker dan 45 μm oplossen.
Samengevat is een switch-AR-OR-PAM-systeem dat een hoge resolutie beeldvorming kan maken met een strakke optische focus, evenals diepgeweven beeldvorming met behulp van akoestische focusing. De prestatie van het omschakelbare AR-OR-PAM-systeem werd gekwantificeerd met behulp van laterale resolutie en beelddiepte-metingen. In vivo studIes werden ook uitgevoerd om zijn biologische beeldvormingsvermogen te tonen. Dit omschakelbare foto-akoestische microscopie systeem kan een hoge temporale en ruimtelijke resolutie bieden, waardoor het systeem belangrijk is voor toepassingen, waaronder het imago van angiogenese, drugrespons, enz. , Waarbij imaging single capillaries en deep vasculatures belangrijk is. Verdere wijzigingen of verbeteringen aan het systeem kunnen worden gedaan door de zelfgemaakte omschakelbare plaat te vervangen door een 10 cm rijmotor (y-as). De laterale resolutie van de OR-PAM kan verder worden verbeterd door de wavefront aberraties te corrigeren. Het leveren van een hogere pulsenergie aan de AR-PAM zal de SNR en beelddiepte ook verbeteren.
In het geval van OR-PAM, waarbij de optische focus is 150 μm onder het huidoppervlak voor in vivo beeldvorming, was de grootte van de oppervlakten 22,5 μm in diameter. Het leveren van een enkele laserpuls van 90 nJ geeft een maXimale puls energie van 20,4 mJ / cm 2 . Voor AR-PAM was de laserfocus 2 mm in diameter. Het leveren van een enkele laserpuls van 50 μJ geeft een maximale pulsenergie bij een brandpunt van 1,6 mJ / cm 2 , goed binnen de ANSI veiligheidsgrens van 20 mJ / cm 2 , 33 .
Figuur 1 : Schematisch van het AR-OR-PAM Imaging System. (A) BS: beam sampler, NDF: neutrale dichtheid filter, RAP - rechter hoek prisma, PD: fotodiode, CL: condensor lens, PH: pinhole, FC: vezelkoppeling, UST: ultrasone transducer, MMF: multimode fiber, SMF: Single-mode fiber, DAQ: data acquisition card, TS: vertaalfase, Con.L: conische lens, L1: convexe lens, L2 en L3: achromatische lens, RA: rechthoekig prisma, RP: rhomboid prisma, OC: optisch Condensor, M: mIrror, SP: slipplaat, LT: lensbuis, TM: vertaling mount, KMM: kinematische spiegelbevestiging en AL: akoestische lens. ( B ) Foto van het prototype AR-OR-PAM-systeem. ( C ) Close-up van de optoacoustic beam combiner. ( D ) Close-up van de optische condensor met een UST in het midden. Reprinted van referentie 34 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Laterale resolutie test van het AR-OR-PAM-systeem: Laterale resolutie geschat door beeldvorming van goud nanodeeltjes ~ 100 nm in diameter. Zwarte (*) punten: foto-akoestisch signaal; Blauwe lijn: Gaussische-uitgeruste curve voor ( a ) AR-PAM en ( b )OR-PAM. De inzet toont het representatieve AR-PAM beeld in (a) en OR-PAM afbeelding in (b) van de enkele gouden nanopartikel. Reprinted van referentie 34 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 : Imaging Depth Measurements: Enkel B-scan PA beeld van een zwarte band die schuin op kippenweefsel is geplaatst. (A) Schematisch diagram. ( B ) AR-PAM beeld. ( C ) OR-PAM beeld. Reprinted van referentie 34 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : In vivo foto-akoestische afbeelding van een muizenoor : ( a ) Foto van de muisoorvasculatuur. (B) AR-PAM beeld. ( C ) Close-up van de regio van belang (ROI) in ( b ), zoals getoond door een witte streeplijn. ( D ) OR-PAM beeld. ( E ) Belangrijke regio (ROI) in ( d ), zoals getoond door een witte stippellijn. ( F ) Close-upbeeld van de witte witte ROI in (e) met een enkele capillaire. Reprinted van referentie 34 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ten slotte is een switchable AR- en OR PAM-systeem ontwikkeld die zowel beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maakt bij lagere beelddieptes en beeldvorming met een lagere resolutie bij hogere beelddiepten. De laterale resolutie en beelddiepte van het schakelbare systeem werd bepaald. De voordelen van dit omschakelbare PAM-systeem zijn onder meer: (1) de hoge resolutie beeldvorming met strakke optische focus; (2) het imago van het weefsel door middel van akoestische focusing; 3) de donkere veldverlichting voor AR-PAM, die voorkomt dat sterke PA signalen op het huidoppervlak voorkomen; 4) het vermogen om het monster op één plaats te houden, zonder het te verplaatsen tussen verschillende systemen; 5) de mogelijkheid om te voorkomen dat meerdere lasers en scanstadia gebruikt worden; En 6) het minimale gebruik van zelfgemaakte componenten. Dit is de eerste gerapporteerde combinatie van OR-PAM en donkerveld AR-PAM dat hoge resolutie, ondiepdieptebeelden en lage resolutie, diepe weefselbeelden van hetzelfde monster biedt zonder het monster / ob te verplaatsenject. Het gebruik van hetzelfde scansfase en laser maakt het systeem efficiënt en kosteneffectief. Het gecombineerde systeem heeft een 4 μm zijdelingse resolutie met een 1,4 mm beelddiepte, evenals een 45 μm zijdelingse resolutie met een beelddiepte van 7,8 mm. Het systeem is gemaakt van een optisch kooi systeem met minimale zelfgemaakte componenten, waardoor het gemakkelijker is om te monteren, uitlijnen en om te schakelen tussen de AR en OR PAM. De gecombineerde aftastkop is compact en kan eenvoudig op een enkele scanningstap worden gemonteerd. Met behulp van het gecombineerde systeem is in vivo beeldvorming succesvol aangetoond.
Het ontwikkelde systeem kan worden gebruikt voor preklinische beeldvorming. Belangrijkste preklinische toepassingen omvatten de beeldvorming van angiogenese, tumor microenvironments, microcirculatie, drugrespons, hersenfuncties, biomarkers en genactiviteiten. De beperkingen van het systeem omvatten de scantijd. Er is een lange scantijd nodig, maar het kan worden verminderd door gegevens in bot te verwervenH richtingen. Gelijktijdige beeldverzameling tussen OR-PAM en AR-PAM is momenteel niet mogelijk. Momenteel is handmatige omschakeling tussen OR-PAM en AR-PAM nodig, wat kan worden vermeden door gebruik te maken van een vertaalfase met ten minste 10 cm Y-richtingbeweging. Kritieke stappen in het protocol omvatten de confocal bepaling van de optische en akoestische focus; Het bereiken van een optische vlekgrootte van minder dan 5 μm voor OR-PAM, naar eenvormige capillairen; En het ontwerp van de optoacoustic beam combiner voor de OR-PAM en de optische condensor voor de AR-PAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde richtlijnen en voorschriften van het Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee van Nanyang Technologische Universiteit, Singapore (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263). De auteurs hebben geen relevante financiële belangen in het manuscript en geen andere potentiële belangenconflicten om te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de financiële steun erkennen van een Tier 2 subsidie, gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs in Singapore (ARC2 / 15: M4020238). De auteurs willen ook de heer Chow Wai Hoong Bobby bedanken voor de hulp van de machinewinkel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
- Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
- Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V.
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
- Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
- Beard, P.
- Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
- Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
- Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
- Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
- Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
- Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
- Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
- Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
- Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
- Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
- Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V.
- Danielli, A.
- Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
- Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
- Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
- Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
- Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
- Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
- Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
- Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
- Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
- ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , NY. (2000).
- Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).
