Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Переключаемая акустическая и оптическая разрешающая фотоакустическая микроскопия для Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55810
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Показана возможность переключения системы акустического разрешения (AR) и оптической разрешающей (OR) фотоакустической микроскопии (AR-OR-PAM), которая позволяет получать изображения с высоким разрешением на мелкой глубине и глубокое изображение глубокой ткани с низким разрешением на одном и том же образце in vivo .

Abstract

Фотоакустическая микроскопия (PAM) - это быстрорастущая мода визуализации, которая сочетает в себе как оптику, так и ультразвук, обеспечивая проникновение за пределы оптической длины свободного пробега (~ 1 мм в коже) с высоким разрешением. Комбинируя контраст оптического поглощения с высоким пространственным разрешением ультразвука в одной модальности, этот метод может проникать в глубокие ткани. Системы фотоакустической микроскопии могут иметь низкое акустическое разрешение и зонд глубоко или высокое оптическое разрешение и зонд. Очень сложно добиться высокого пространственного разрешения и большого проникновения глубины с помощью единой системы. Эта работа представляет собой систему AR-OR-PAM, способную как с высоким разрешением, на мелкой глубине, так и с глубоким отображением глубокой ткани с низким разрешением одного и того же образца in vivo . Боковое разрешение 4 мкм с глубиной изображения 1,4 мм с использованием оптической фокусировки и боковое разрешение 45 мкм с глубиной изображения 7,8 мм с использованием акустической фокусировки были успешнымиПродемонстрированный с использованием комбинированной системы. Здесь, in vivo, визуализацию сосудистой сети животного мира проводят, чтобы продемонстрировать свою биологическую способность к визуализации.

Introduction

Модификации оптического изображения с высоким разрешением, такие как оптическая когерентная томография, конфокальная микроскопия и многофотонная микроскопия, имеют многочисленные преимущества. Однако пространственное разрешение значительно уменьшается по мере увеличения глубины изображения. Это связано с диффузным характером переноса света в мягких тканях 1 , 2 . Интеграция оптического возбуждения и ультразвукового обнаружения обеспечивает решение для преодоления проблемы оптической визуализации с высоким разрешением в глубоких тканях. Фотоакустическая микроскопия (PAM) - одна из таких модальностей, которая может обеспечить более глубокое изображение, чем другие оптические методы визуализации. Он успешно применяется для структурной, функциональной, молекулярной и клеточной визуализации in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , объединив сильный контраст оптического поглощения с высоким пространственным разрешением от ультразвука.

В PAM короткий лазерный импульс облучает ткань / образец. Поглощение света хромофорами ( например, меланин, гемоглобин, вода и т. Д. ) Приводит к увеличению температуры, что, в свою очередь, приводит к образованию волн давления в виде волн акустики (фотоакустических волн). Сгенерированные фотоакустические волны могут быть обнаружены широкополосным ультразвуковым преобразователем вне границы ткани. Используя слабую оптическую и плотную акустическую фокусировку, глубокая тканная визуализация может быть достигнута в акустическом разрешении фотоакустической микроскопии (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . В AR-PAM, было показано поперечное разрешение 45 мкм и глубина изображения до 3 мм. 15 . Для того чтобы разрешить одиночные капилляры (~ 5 мкм) акустически, необходимы ультразвуковые преобразователи, работающие на частотах> 400 МГц. На таких высоких частотах глубина проникновения составляет менее 100 мкм. Проблема, вызванная плотной акустической фокусировкой, может быть решена с использованием плотной оптической фокусировки. Фотоакустическая микроскопия с оптическим разрешением (OR-PAM) способна разрешать одиночные капилляры или даже одну ячейку 17 , а латеральное разрешение 0,5 мкм было достигнуто 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Использование фотонного наноэлемента может помочь достичь разрешения, выходящего за пределы разрешающей способности дифракцииN 25 , 26 . В OR-PAM глубина проникновения ограничена из-за фокусировки света, и она может достигать до 1,2 мм внутри биологической ткани 23 . Таким образом, AR-PAM может изображение глубже, но с более низким разрешением, а OR-PAM может иметь изображение с очень высоким разрешением, но с ограниченной глубиной изображения. Скорость формирования изображения AR и OR-PAM в основном зависит от частоты повторения импульсов лазерного источника 27 .

Объединение AR-PAM и OR-PAM будет иметь большую выгоду для приложений, для которых требуется как высокое разрешение, так и более глубокое изображение. Были предприняты небольшие усилия для объединения этих систем. Обычно для визуализации используются два разных сканера изображения, что требует, чтобы образец перемещался между обеими системами, что затрудняло выполнение визуализации in vivo . Однако гибридное изображение с AR и OR PAM позволяет получать изображения с масштабируемыми разрешениямиЙ глубины. В одном подходе пучок оптических волокон используется для подачи света для AR и OR PAM. В этом подходе используются два отдельных лазера (высокоэнергетический лазер при 570 нм для AR и низкоэнергетический лазер с высокой частотой повторения при 532 нм для OR), что делает систему неудобной и дорогостоящей 28 . Длина волны лазера OR-PAM фиксирована, и многие исследования, такие как насыщение кислородом, невозможны с использованием этой комбинированной системы. Сравнительные исследования между AR и OR PAM также невозможны из-за разницы в длинах волн лазера между AR и OR. Кроме того, AR-PAM использует подсветку яркого поля; Следовательно, сильные фотоакустические сигналы с поверхности кожи ограничивают качество изображения. По этой причине система не может использоваться для многих приложений для биоизображения. В другом подходе к выполнению AR и OR PAM оптический и ультразвуковой фокус смещается, что делает фокус и фокусировку ультразвука неравнозначными. Таким образом, качество изображения не является оптимальным 30 . Во всех этих случаях AR-PAM не использовал подсветку темного поля. Использование освещения темного поля может уменьшить генерацию сильных фотоакустических сигналов с поверхности кожи. Поэтому глубокое изображение может быть выполнено с использованием кольцевой подсветки, поскольку чувствительность обнаружения глубоких фотоакустических сигналов будет более высокой, чем чувствительность яркого поля.

В этой работе сообщается о сменевой системе визуализации AR и OR PAM (AR-OR-PAM), способной получать изображения с высоким разрешением и изображения глубокой ткани с низким разрешением одного и того же образца, используя тот же лазер и сканер для обеих системЭмс. Производительность системы AR-OR-PAM характеризовалась определением пространственного разрешения и глубины изображения с использованием фантомных экспериментов. In vivo визуализация сосудистой сети крови проводилась на ухе мыши, чтобы продемонстрировать свою биологическую способность к визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с утвержденными правилами и руководящими принципами Комитета по институциональному уходу и использованию животных Технологического университета Наньян в Сингапуре (номер протокола по борьбе с животными ARF-SBS / NIE-A0263).

1. Система AR-OR-PAM ( рисунок 1 )

  1. Конфигурация системы: AR-PAM
    1. Используйте наносекундную перестраиваемую лазерную систему, состоящую из твердотельного Nd-YAG-лазера на диодной накачке (532 нм) и лазера на красителе с диапазоном перестраиваемости 559-576 нм в качестве источника оптического облучения. Установите длину волны лазера на 570 нм с использованием внешнего контроллера и частотой повторения лазерного излучения до 1 кГц с использованием лазерного программного обеспечения.
    2. Поместите пробоотборник луча под углом 45 ° перед лазером, чтобы отвести 5% мощности лазера на фотодиод через фильтр с переменной нейтральной плотностью (NDF1; OD = 0-4,0).
    3. Отверните лазерный луч после пробоотборника луча при 90 °, используяПрямоугольную призму (RAP1).
    4. Используйте другую прямоугольную призму (RAP2), чтобы позволить лучу проходить через переменный фильтр нейтральной плотности (NDF2; OD = 0-4,0) и на многомодовое волокно (MMF), направляя его через волоконный соединитель (FC) -a Комбинация целей (числовая апертура (NA): 0,25) и переводчик XY.
    5. Закрепите волокно на стадии сканирования с помощью XY-транслятора. Поместите плоско-выпуклую линзу (L1) на расстоянии 25 мм от выходного конца волокна, чтобы выровнять луч из волокна.
    6. Пропустите коллимированный луч через коническую линзу с углом вершины 130 °, чтобы сформировать кольцевой пучок. Слабо фокусируйте кольцевой луч на объект, используя самодельный оптический конденсатор (OC) с углами конуса 70 ° и 110 ° и с отверстием в центре.
    7. Поместите ультразвуковой преобразователь на 50 МГц (UST) с акустической линзой (AL) в центре самодельного конденсатора.
  2. Конфигурация системы: OR-PAM
    1. ИспользоватьНаносекундная перестраиваемая лазерная система, состоящая из твердотельного Nd-YAG-лазера на диодной накачке (532 нм) и лазера на красителе с диапазоном перестраиваемости 559 - 576 нм в качестве источника оптического облучения. Установите длину волны лазера на 570 нм с использованием внешнего контроллера и частоту повторения лазера на частоте 5 кГц с использованием лазерного программного обеспечения.
    2. Поверните управляемый компьютером этап вращения (удерживая RAP1) на 90 °, чтобы отвести лазерный луч на радужную оболочку для изменения формы.
    3. Ослабьте лазерный луч, поместив на лучу переменный фильтр с нейтральной плотностью (OD: 0-4,0), а затем сфокусируйте луч с помощью конденсаторной линзы (CL). Пропустите его через отверстие (PH) на расстоянии 75 мм от CL для пространственной фильтрации.
    4. Запустите пространственно фильтрованный пучок на одномодовое волокно (SMF) с использованием одномодового волоконного соединителя (FC), состоящего из объектива 0,1 NA для фокусировки светового луча на SMF.
    5. Отрегулируйте волоконную муфту для достижения максимальной эффективности сцепления.
    6. Закрепите волокно на tОн сканирует сцену, используя пластину скольжения (SP). Поместите ахроматическую линзу (L2) на расстоянии 50 мм от волокна SM, чтобы объединить лазерный луч.
    7. Переверните коллимированный луч на 90 °, используя кинематическое управляемое эллиптическое зеркало (M), чтобы заполнить заднюю апертуру другой идентичной ахроматической линзы (L3). Поместите ахроматическую линзу, используемую для фокусировки на держателе для трансляции (TM2), используя линзную трубку (LT).
    8. Передайте фокусирующий луч через самодельный оптоакустический пучковый сумматор, состоящий из прямоугольной призмы (RA) и ромбовидной призмы (RP) со слоем силиконового масла (SO) между ними.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Силиконовый масляный слой будет действовать как оптически прозрачная и акустически отражающая пленка.
    9. Прикрепите акустическую линзу (AL) для обеспечения акустической фокусировки (фокусный диаметр: ~ 46 мкм) в нижней части ромбовидной призмы.
    10. Поместите ультразвуковой преобразователь с центральной частотой 50 МГц поверх ромбовидной призмы; Используйте эпоксидный слой для эффективной муфты.
    3. 2. Переключение и выравнивание системы

    1. Закрепите (плотно прикрутите) самодельную переключаемую пластину к 3-осевой моторизованной ступени, управляемой 3-осевым контроллером, подключенным к компьютеру.
    2. Прикрепите систему AR и OR к домашней пластине, используя монтажные кронштейны для установки в клетку, чтобы обеспечить удобное переключение между головками сканирования AR и OR. Сдвиньте сканирующую головку поверх области формирования изображения.
    3. Используйте Z-ступицу для погружения нижней части головки сканера AR-OR-PAM в акриловый резервуар с водой (13 см х 30 см х 3 см) для акустической связи.
    4. Откройте окно изображения с диаметром 7 см на нижней пластине бака и закрепите его полиэтиленовой мембраной для оптической и акустической передачи.
    5. Используйте импульсно-эхо-усилитель и осциллограф, чтобы выровнять ультразвуковой преобразователь в фокусе.
      1. Установите усиление в импульсном эхо-усилителе на 24 дБ в режиме передачи / приема.
      2. Использовать сигнал синхронизации frOm импульсно-эхо-усилитель в качестве триггера и детектирование обратного рассеянного сигнала со стеклянного слайда (вставленного со дна бака для воды) с помощью осциллографа.
        ПРИМЕЧАНИЕ. На слайде должна быть прикреплена черная лента.
      3. Переместите ось Z, чтобы максимизировать амплитуду сигнала импульсного эха (см. Осциллограф).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Когда стеклянная пластина находится в фокусе, эхо будет иметь максимальную амплитуду.
    6. Включите лазер и подключите UST к двум усилителям, каждый с фиксированным усилением 24 дБ, используя BNC-кабели.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выходы усилителей подключаются к карте сбора данных (DAQ).
    7. Используйте сигнал от фотодиода (PD), расположенного перед лазером, в качестве триггера для системы сбора данных.
    8. В AR-PAM измените расстояние между конической линзой (con.L) и оптическим конденсатором (OC), чтобы максимизировать амплитуду фотоакустического сигнала, генерируемого тестовым объектом (черная лента застряла на стеклянном слайде).Убедитесь, что оптическая и акустическая фокусировки конфокальны, определяя максимальную амплитуду фотоакустического (PA) сигнала.
      1. Обратите внимание на задержку максимальных сигналов PA; Используйте это позже, чтобы проверить фокус в программном обеспечении для сбора данных.
    9. Ослабьте винт сканирующей головки и вручную переключите сканирующую головку с AR-PAM на OR-PAM. Затем затяните винты.
    10. В OR-PAM измените расстояние между фокусирующим ахроматическим дублетом (внутри трубки объектива (LT)) и оптоакустическим комбайнером, чтобы максимизировать амплитуду сигнала PA, показанную на осциллографе.
      1. Обратите внимание на задержку максимальных сигналов PA.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Финализация необходима для определения конфокальной компоновки.

    3. Экспериментальные этапы

    1. Боковое разрешение и количественная оценка глубины изображения
      1. Используйте наночастицы золота диаметром 100 нм для определения бокового разрешения ARD OR.
      2. Разбавьте 0,1 мл раствора наночастиц с равным количеством воды. Распределите 0,1 мл разбавленного раствора на крышке и поместите его в контакт с полиэтиленовой мембраной под баком.
      3. Перед сканированием убедитесь, что AR-PAM и OR-PAM находятся в фокусе программного обеспечения для сбора данных (см. Таблицу материалов) (шаги 2.8 и 2.10).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Зная микросекундную задержку максимальных сигналов PA с шагов 2.9 и 2.10, умноженную на частоту дискретизации (250 MS / s), изображение будет в фокусе в программном обеспечении для сбора данных. Задержка, которая должна быть опущена во время сбора данных, может быть определена в программном обеспечении, чтобы сохранить только необходимые точки данных для последующей обработки.
      4. Задайте параметры сканирования для AR-PAM и нажмите кнопку «Сканирование», чтобы запустить растровое сканирование.
        1. Задайте параметры сканирования для AR-PAM в программном обеспечении для сбора данных со скоростью сканирования 4 "мм / с в скорости"; Вкладку «1» кГц на вкладке «Частота повторения импульсов», «0,5» мм на вкладке «Диапазон сканирования Y» и «0,5» мм на вкладке «Диапазон сканирования X». Установите размер шага в направлении x на «4» мкм на вкладке «dx».
          ПРИМЕЧАНИЕ. Размер шага в направлении y автоматически определяется по скорости сканирования скорости ступени и частоте повторения импульсов (в данном случае 4000 мкм / 1000 Гц = 4 мкм)
      5. Задайте параметры сканирования для OR-PAM и нажмите кнопку сканирования, чтобы начать сканирование растра.
        1. Задайте параметры сканирования в программном обеспечении сбора данных со скоростью сканирования 2,5 "мм / с на вкладке« Скорость »,« 5 »кГц на вкладке« Частота повторения импульсов »,« 0,5 »мм в« диапазоне Y-сканирования », Вкладку и «0,5» мм на вкладке «X-scan range». Задайте размер шага в направлении x «0,5» мкм на вкладке «dx».
          ПРИМЕЧАНИЕ.Размер тепа в направлении y автоматически определяется по скорости сканирующей скорости ступени и частоте повторения импульсов (в данном случае 2500 мкм / 5000 Гц = 0,5 мкм).
      6. Убедитесь, что в процессе сканирования данные непрерывно захватываются и сохраняются на компьютере
        ПРИМЕЧАНИЕ. Данные будут записываться только в одном направлении движения Y-сцены.
      7. Используйте множественные данные B-сканирования, хранящиеся на компьютере, для получения изображений максимальной амплитудной проекции (MAP) с помощью программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов ).
      8. Используйте одно изображение наночастиц (из нескольких изображений) из сканирования, чтобы определить боковое разрешение, вручную построив линию через центральную область изображения наночастиц, чтобы получить функцию с расширением точки, которая выглядит как гауссова кривая. См. Рисунок 2 .
      9. Установите функцию распределения точек, полученную из одного изображения наночастиц с помощью GauSsian fit и измерить полную ширину в половине максимума (FWHM) с помощью программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов ). Используйте это как боковое разрешение. См. Рисунок 2 .
      10. Вставьте кусок черной ленты наискось на кусочек нарезанной куриной ткани в качестве целевого объекта для обработки глубины. Поместите ткань лентой в резервуар для воды.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Черная лента прикреплена к металлической пластине с острым наконечником, что помогает прикрепить ленту к ткани.
      11. Задайте параметры сканирования для AR-PAM в программное обеспечение для сбора данных, а затем нажмите кнопку «Сканирование», чтобы захватить одно изображение B-сканирования, чтобы определить максимальную глубину изображения.
        1. Задайте параметры сканирования со скоростью сканирования «15» мм / с на вкладке «Скорость», «1» кГц на вкладке «Частота повторения импульсов», «5» см на вкладке «Диапазон сканирования Y» и «0,1 "Мм на вкладке« X-scan range ». Установите tРазмер шага в направлении x на «0,1» мм на вкладке «dx».
      12. Задайте параметры сканирования для OR-PAM и нажмите кнопку «Сканировать», чтобы захватить одно изображение B-scan, чтобы определить максимальный уровень обработки изображений.
        1. Задайте параметры сканирования в программном обеспечении для сбора данных как скорость сканирования «15» мм / с на вкладке «Скорость», «5» кГц на вкладке «Частота повторения импульсов», «2» см в «диапазоне Y-сканирования», Вкладку и «0,1» мм на вкладке «X-scan range». Задайте размер шага в направлении x на «0,1» мм на вкладке «dx».
          ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку диапазон X-scan и dx одинаковы, будет снято только одно B-сканирование. Сигналы PA с временным разрешением, умноженные на скорость звука в мягких тканях (1540 м / с), получат изображение A-линии. Множество A-линий фиксируются во время непрерывного движения Y-сцены для создания B-сканирования.
    2. In vivo </ Em> визуализация сосудистой системы сосудистой системы мыши
      1. Используйте женскую мышь с массой тела 25 г и возрастом 4 недели.
      2. Анестезируйте животное с помощью коктейля кетамина (120 мг / кг) и ксилазина (16 мг / кг), вводимого внутрибрюшинно (доза 0,1 мл / 10 г).
      3. Удалите волосы из ушей животных, используя крем для удаления волос. Протрите область чистой. Накройте глаз животного стерильной глазной мазью, чтобы избежать попадания рассеянного лазерного луча на глаза.
      4. Поместите животное на сцену, в которой также имеется миниатюрная пластина для размещения уха.
      5. Поддержание анестезии с помощью ингаляционного изофлурана (0,75% в 1 л / мин кислорода) в течение периода визуализации.
      6. Закрепите пульсоксиметр на ноге или хвосте мыши и контролируйте физиологический статус. Позвольте области изображения контактировать с полиэтиленовой мембраной с помощью ультразвукового геля.
      7. Задайте параметры сканирования для AR-PAM и нажмите кнопку «Сканировать», чтобы запустить растровый сканерING.
        1. Задайте параметры сканирования для AR-PAM в программном обеспечении для сбора данных со скоростью сканирования «15» мм / с на вкладке «Скорость», «1» кГц на вкладке «Частота повторения импульсов», «10 мм» в поле « Y-scan range "и" 6 "мм на вкладке« X-scan range ». Задайте размер шага в x-направлении как «30» мкм на вкладке «dx».
          ПРИМЕЧАНИЕ. Размер шага в направлении y определяется автоматически со скоростью сканирования на этапе и частотой повторения импульсов (в данном случае 15 000 мкм / 1000 Гц = 15 мкм).
      8. После завершения сканирования AR-PAM переключите положение головки изображения из AR-PAM в OR-PAM (как описано в разделе 2).
      9. Задайте параметры сканирования для OR-PAM и нажмите кнопку сканирования, чтобы начать сканирование растра.
        1. Задайте параметры сканирования для OR-PAM в программном обеспечении для сбора данных со скоростью сканирования «15» мм / с в режиме «velocityit»Y "," 5 "кГц на вкладке« Частота повторения импульсов »,« 10 »мм на вкладке« Диапазон сканирования Y »и« 6 »мм на вкладке« X-scan range ». Установите размер шага В x-направлении как «6» мкм на вкладке «dx».
          ПРИМЕЧАНИЕ. Размер шага в направлении y автоматически определяется по скорости сканирования скачка ступени и частоте повторения импульсов (в данном случае 15 000 мкм / 5000 Гц = 2 мкм).
      10. Используйте множественные данные B-сканирования, хранящиеся на компьютере, для извлечения изображений MAP с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
      11. Наблюдайте за животным в течение всего периода визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схема AR-OR-PAM показана на рисунке 1 . В этой установке все компоненты были интегрированы и собраны в установку оптического сепаратора. Использование каркасной системы делает сканирующую головку AR-OR-PAM компактной и легко собранной, выровненной и интегрированной на одну ступень сканирования.

Во время получения изображения использовалось двумерное непрерывное растровое сканирование изображения. Сигналы PA с временным разрешением умножались на скорость звука (1540 м / с) для получения A-линии. Несколько A-линий, захваченных во время непрерывного движения Y-сцены, произвели двумерное B-сканирование. Несколько B-сканов области визуализации были захвачены и сохранены в компьютере и использовались для обработки и производства фотоакустических изображений MAP.

Чтобы определить разрешение переключаемой системы, Использовалось изображение MAP одной наночастицы 31 . Фотоакустическая амплитуда вдоль центрального бокового направления изображения была построена и привязана к гауссовой функции. FWHM гауссовской посадки считалась боковым разрешением. Измеренное поперечное разрешение для AR-PAM составляло 45 мкм, как показано на рисунке 2 а . Аналогично, одно изображение наночастиц, полученное с использованием OR-PAM, было установлено вдоль центрального бокового направления для определения разрешения OR-PAM, как показано на рисунке 2b . Измеренное поперечное разрешение составляло 4 мкм, определенное по FWHM. Вставка на рисунке показывает соответствующее изображение MAP золотой наночастицы. Теоретически, боковое разрешение с оптической дифракцией для AR-PAM составляет 45 мкм, определяемое с использованием следующего уравнения: 0.72λ / NA, где λ - центральная длина волны звука, а NA - числовоеАпертура ультразвукового преобразователя. Теоретическая резолюция хорошо согласуется с экспериментальными данными. Аналогично, теоретическое боковое разрешение для OR-PAM составляет 2,6 мкм, рассчитанное по следующему уравнению: 0,51λ / NA, где λ - длина волны лазера, а NA - числовая апертура объекта. Экспериментально измеренное поперечное разрешение для OR-PAM было хуже, чем оценка дифракционного предела, что может быть связано с аберрациями волнового фронта. Так как AR и OR используют аналогичный преобразователь и акустическую линзу, теоретическое осевое разрешение будет составлять 30 мкм в соответствии с 0,88 c / Δ f , где c - скорость звука в мягких тканях, а Δ f - полоса частот ультразвукового преобразователя , Кроме того, боковое разрешение будет варьироваться в осевом направлении как для OR-PAM 20, так и для AR-PAM 32 . Сообщенные боковые разрешения здесь находятся на фокальной плоскости.

На рисунке 3а показана фотография черной ленты на куриной ткани. Одно изображение B-сканирования было захвачено с использованием как AR-PAM, так и OR-PAM. На рисунке 3b и на рисунке 3c показано одиночное изображение PA-AR-PAM и OR-PAM B-scan соответственно. Из рисунка 3 b видно, что система AR-PAM может четко отображать черную ленту до ~ 7,8 мм под поверхностью ткани. Аналогичным образом, используя систему OR-PAM, можно было четко изобразить черную ленту до ~ 1,4 мм под поверхностью ткани ( рис. 3в ). Отношение сигнал / шум (SNR) также определялось из изображений. SNR определяется как V / n , где <Em> V - амплитуда амплитуды сигнала пика к пику, а n - стандартное отклонение фоновых шумов. SNR, измеренное на глубинах изображения 4,6 мм и 7,8 мм, составляло 2,6 и 1,4 соответственно. Для OR-PAM SNR с глубиной обработки 1,4 мм составляла 1,4. Чтобы продемонстрировать биологическую способность визуализации переключаемой системы AR-OR PAM, визуализация сосудистой сети in vivo проводилась на ухе мыши. Фотография, изображающая сосудистую анатомию живого уха мыши, используемого для получения изображений, показана на рисунке 4а . Используя AR-PAM, визуализировали область сканирования размером 10 мм х 6 мм с шагом шага 15 мкм в направлении Y и 30 мкм в направлении X. Для создания изображения потребовалось 10 минут. В настоящее время система обработки изображений получает данные только в одном направлении; Время сбора данных может быть уменьшено почти до половины, изменив программу, чтобы иметь возможность двунаправленного сбора данных. Изображение MAP AR-PAM показано на рисунке 4B. Крупный план интересующей области показан на рисунке 4 с . Аналогичная область, сканированная с использованием OR-PAM, с шагом размером 3 мкм в направлении Y и 6 мкм в направлении X, показана на рисунке 4 d . Для получения изображения потребовалось 46 минут. Крупный план интересующей области показан на рисунке 4 e . OR-PAM может четко разрешать одиночные капилляры, которые AR-PAM не может решить. AR-PAM может разрешать сосуды толщиной более 45 мкм.

Таким образом, была разработана переключаемая система AR-OR-PAM, которая позволяет получать изображения с высоким разрешением с использованием плотной оптической фокусировки, а также глубокое изображение с использованием акустической фокусировки. Производительность переключаемой системы AR-OR-PAM была определена количественно с использованием измерения глубины и глубины изображения. Стул in vivoТакже были выполнены, чтобы продемонстрировать свою биологическую способность к визуализации. Эта переключаемая система фотоакустической микроскопии может обеспечить высокое временное и пространственное разрешение, что делает систему важной для применений, включая визуализацию ангиогенеза, реакцию лекарственного средства и т. Д. , Где важны изображения одиночных капилляров, а также глубокие сосудистые сети. Дальнейшие модификации или усовершенствования системы можно выполнить, заменив самодельную переключаемую пластину на 10-сантиметровый моторизованный ступень (ось Y). Боковое разрешение OR-PAM может быть дополнительно улучшено путем коррекции аберраций волнового фронта. Подача более высокой энергии импульса в AR-PAM также улучшит SNR и глубину изображения.

В случае OR-PAM, предполагая, что оптический фокус составляет 150 мкм ниже поверхности кожи для визуализации in vivo , размер поверхности пятна составляет 22,5 мкм в диаметре. Поставка одного лазерного импульса 90 нДж дает маМинимальная энергия импульса 20,4 мДж / см 2 . Для AR-PAM лазерный фокус был 2 мм в диаметре. Поставка одного лазерного импульса 50 мкДж дает максимальную энергию импульса в фокальной точке 1,6 мДж / см 2 , в пределах пределов безопасности ANSI 20 мДж / см 2 , 33 .

Рисунок 1
Рисунок 1 : Схема системы визуализации AR-OR-PAM. ( A ) BS: лучевой пробоотборник, NDF: фильтр нейтральной плотности, RAP - прямоугольная призма, PD: фотодиод, CL: конденсаторная линза, PH: отверстие, FC: оптоволоконный соединитель, UST: ультразвуковой преобразователь, MMF: многомодовое волокно, SMF: Одномодовое волокно, DAQ: карта сбора данных, TS: ступень трансляции, Con.L: коническая линза, L1: выпуклая линза, L2 и L3: ахроматическая линза, RA: призму прямого угла, RP: ромбовидная призма, OC: оптическая Конденсатор, M: мIrror, SP: пластина скольжения, LT: трубка для объектива, TM: крепление для трансляции, KMM: кинематическое зеркальное крепление и AL: акустическая линза. ( Б ) Фотография прототипа системы AR-OR-PAM. ( C ) Крупный план объединителя оптоакустических лучей. ( D ) Крупный план оптического конденсатора с UST в центре. Перепечатано из ссылки 34 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2 : Тестирование бокового разрешения системы AR-OR-PAM: Боковое разрешение оценивается путем формирования изображений наночастиц золота диаметром ~ 100 нм. Черные (*) точки: фотоакустический сигнал; Синяя линия: гауссова кривая для ( a ) AR-PAM и ( b )ИЛИ-РАМ. На вставке показан репрезентативный образ AR-PAM в (a) и изображении OR-PAM в (b) единственной золотой наночастицы. Перепечатано из ссылки 34 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3 : Измерения глубины изображения: одно изображение B-scan PA черной ленты, вставленной наискось на куриную ткань. (A) Принципиальная схема. ( B ) Изображение AR-PAM. ( C ) Изображение OR-PAM. Перепечатано из ссылки 34 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.


Рисунок 4 : Фотоакустическое изображение в мышином ухе Vivo : ( a ) Фотография сосудистой сети мыши. (B) Изображение AR-PAM. ( C ) Крупный план области интереса (ROI) в ( b ), как показано белой пунктирной линией. ( D ) Изображение OR-PAM. ( E ) Регион интереса (ROI) в ( d ), как показано белой пунктирной линией. ( F ) Крупномасштабное изображение белой линии ROI в (e), показывающее один капилляр. Перепечатано из ссылки 34 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В заключение была разработана переключаемая система AR и OR PAM, которая позволяет получать изображения с высоким разрешением на более низких глубинах изображения и изображения с более низким разрешением на более высоких глубинах изображения. Определено боковое разрешение и глубина изображения переключаемой системы. Преимущества этой переключаемой системы PAM включают: (1) изображение с высоким разрешением с использованием плотной оптической фокусировки; (2) глубокое изображение с использованием акустической фокусировки; 3) подсветка темного поля для AR-PAM, которая предотвращает появление сильных сигналов ПА на поверхности кожи; 4) способность удерживать образец в одном месте, не перемещая его между различными системами; 5) возможность избежать использования нескольких лазеров и ступеней сканирования; И 6) минимальное использование самодельных компонентов. Это первая сообщенная комбинация OR-PAM и AR-PAM с темным полем, которая обеспечивает изображения с высоким разрешением, изображения с малой глубиной и изображения с глубоким тканью с низким разрешением одного и того же образца без перемещения образца / obект. Использование одной и той же стадии сканирования и лазера делает систему эффективной и рентабельной. Комбинированная система имеет боковое разрешение 4 мкм с глубиной изображения 1,4 мм, а также боковое разрешение 45 мкм с глубиной изображения 7,8 мм. Система изготовлена ​​из оптической системы с минимальными самодельными компонентами, что упрощает сбор, выравнивание и переход между AR и OR PAM. Комбинированная сканирующая головка компактна и может быть легко собрана на одной стадии сканирования. Используя комбинированную систему, визуализация in vivo была успешно продемонстрирована.

Разработанная система может использоваться для доклинической визуализации. Основные доклинические применения включают в себя визуализацию ангиогенеза, микросреды опухолей, микроциркуляцию, реакцию лекарственного средства, функции мозга, биомаркеры и активность генов. К ограничениям системы относятся время сканирования. В настоящее время требуется длительное время сканирования, но его можно уменьшить, получив данные в ботеЧ. Одновременное получение изображений между OR-PAM и AR-PAM в настоящее время невозможно. В настоящее время необходимо ручное переключение между OR-PAM и AR-PAM, чего можно избежать, используя ступень трансляции, которая имеет не менее 10 см движения по оси Y. Критические шаги в протоколе включают конфокальное определение оптического и акустического фокуса; Достижение оптических пятен размером менее 5 мкм для OR-PAM для изображения одиночных капилляров; И конструкцию оптоакустического пучкового сумматора для OR-PAM и оптического конденсатора для AR-PAM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами и положениями Комитета по институциональному уходу и использованию животных Технологического университета Наньян в Сингапуре (номер протокола по борьбе с животными ARF-SBS / NIE-A0263). У авторов нет соответствующих финансовых интересов в рукописи и других потенциальных конфликтов интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы хотели бы признать финансовую поддержку гранта уровня 2, финансируемого Министерством образования в Сингапуре (ARC2 / 15: M4020238). Авторы также хотели бы поблагодарить г-на Чоу Вай Хоонга Бобби за помощь в механическом магазине.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q-switched Nd:YAG laser Edgewave BX80-2-L Pump laser 
Credo-High Repetition Rate Dye Laser Spectra physics CREDO-DYE-N Dye laser
Precision Linear Stage Physik Instrumente PLS 85  XY raster scanning stage
Translation stage Physik Instrumente VT 80  Confocal determine
Mounted Silicon photodiode Thorlabs SM05PD1A Triggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage  Thorlabs CR1/M-Z7 Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND Filter Thorlabs NDC-50C-4M Intensity variable
Fiber Patch Cable Thorlabs M29L01 Multimode fiber
Microscope objective Newport M-10X Objective 
XY translating mount Thorlabs CXY1 Translating mount
Plano convex lens Thorlabs LA1951 Collimating lens
Conical lens  Altechna APX-2-B254 Ring shape beam
Translation stage Thorlabs CT1 Translating stage
Optical condenser Home made
Ultrasonic transducer Olympus-NDT V214-BB-RM 50MHz transducer
Plano concave lens Thorlabs LC4573 Acoustic lens
Pulser/Receiver Olympus-NDT 5073PR Pulse echo amplifier 
Mounted standard iris Thorlabs ID12/M Beam shaping
Plano convex lens Thorlabs LA4327 Condenser lens
Mounted precision pinhole Thorlabs P50S Spatial filtering
Single mode fiber patch cable Thorlabs P1-460B-FC-1 Single mode fiber
Fiber coupler Newport F-91-C1 Single mode coupling
Achromatic doublet lens Edmund Optics 32-317 Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirror Thorlabs PFE10-P01 Mirror
Right angle kinematic mirror mount Thorlabs KCB1 Mirror mount
Z-Axis Translation Mount Thorlabs SM1Z z translator
Lens tube Thorlabs SM05L10
UV Fused Silica Right-Angle Prism Thorlabs PS615 Right angle prism
Rhomboid prism Edmund Optics 47-214 Shear wave
Dimethylpolysiloxane Sigma Aldrich DMPS1M Silicon oil
Amplifier Mini Circuits ZFL-500LN Amplifier
16 bit high speed digitizer Spectrum M4i.4420 Data acquisition card
Oscilloscope Agilent Technologies DS06014A
Mice  InVivos Pte.Ltd ICR Animal model
Ultrasound gel  Progress/parker acquasonic gel PA-GEL-CLEA-5000 Acoustic coupling
Water tank Home made
Translation stage Homemade Switching AR-OR
Gold nanoparticles Sigma Aldrich 742031 Lateral resolution
Sterile ocular ointment Alcon Duratears Animal imaging
1951 USAF resolution test target Edmund Optics 38257 Confocal alignment
Data acquisition software National Instrument Labview Home made software using Labview
Image Processing software Mathworks Matlab Home made program using Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
  2. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  3. Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
  4. Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
  5. Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
  6. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
  7. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
  8. Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
  9. Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
  10. Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
  11. Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
  12. Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
  13. Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
  14. Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
  15. Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
  16. Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
  17. Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
  18. Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
  19. Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
  20. Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
  21. Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006 (2014).
  22. Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
  23. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
  24. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
  25. Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
  26. Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
  27. Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
  28. Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
  29. Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
  30. Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
  31. Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
  32. Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
  33. ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , NY. (2000).
  34. Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).

Tags

Биоинженерия выпуск 124 фотоакустическая микроскопия с акустическим разрешением фотоакустическая микроскопия с оптическим разрешением фотоакустическая визуализация фотоакустика, AR-PAM OR-PAM микроскопия комбинированная микроскопическая система
Переключаемая акустическая и оптическая разрешающая фотоакустическая микроскопия для<em&gt; В Виво</em&gt; Масштабная картинка клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moothanchery, M., Sharma, A.,… More

Moothanchery, M., Sharma, A., Pramanik, M. Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging. J. Vis. Exp. (124), e55810, doi:10.3791/55810 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter