Summary
ويرد وصف بروتوكول لتصنيع أجهزة موائع جزيئية البلاستيك مع منافذ عرض شفافة لتصوير الضوء المرئي والأشعة تحت الحمراء.
Abstract
الأشعة تحت الحمراء (IR) الطيف-الفحص المجهري للعينات البيولوجية الحية يعوق امتصاص المياه في حدود منتصف الأشعة تحت الحمراء، وعدم وجود أجهزة موائع جزيئية مناسبة. ويتجلى هنا، بروتوكولا لتصنيع أجهزة موائع جزيئية البلاستيكية، التي تستخدم فيها تقنيات معدني لينة لتضمين شفافة فلوريد الكالسيوم (CaF2) عرض المنافذ فيما يتصل بمراقبة الغرفة (ق). الأسلوب الذي يستند إلى نهجاً صب النسخ متماثلة، حيث أنتجت عن طريق إجراءات معدني القياسية العفن بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) وثم استخدامه كالقالب لإنتاج جهاز بلاستيك. ويتميز الجهاز البلاستيك الأشعة فوق البنفسجية/المرئية/الأشعة تحت الحمراء (الأشعة فوق البنفسجية/Vis/IR)--ويندوز شفافة مصنوعة من CaF2 للسماح للمراقبة المباشرة مع مرئية والضوء الأشعة تحت الحمراء. وتشمل مزايا الطريقة المقترحة: انخفاض حاجة إلى الوصول إلى منشأة الصغرى-تصنيع غرفة نظيفة، وعرض-منافذ متعددة، اتصال سهلة ومرنة لنظام ضخ خارجي عن طريق الجسم البلاستيك، ومرونة التصميم، مثلاً ، فتح/إغلاق القنوات التكوين، وإمكانية لإضافة ميزات متطورة مثل الأغشية نانوبوروس.
Introduction
وقد استخدمت على نطاق واسع الطيف-الفحص المجهري "فورييه تحويل الأشعة تحت الحمراء" (FTIR) كتقنية تصوير خالية من التسمية وغير الغازية لتوفير المعلومات الكيميائية المفصلة من عينة. وهذا يمكن استخراج المعلومات البيوكيميائية لدراسة كيمياء العينات البيولوجية، مع الحد أدنى من الإعداد منذ طيف امتصاص العينة يحمل بصمات الجوهرية في التركيبة الكيميائية1 , 2. في الآونة الأخيرة، فتير طبق متزايدة لدراسة عينات بيولوجية حية، مثلاً، الخلايا3. ومع ذلك، يظهر الماء، وهو وسيلة للخلايا الحية في معظم الحالات، امتصاص قوي في منطقة منتصف الأشعة تحت الحمراء. حتى كطبقة رقيقة، تطغى وجودها يمكن تماما المعلومات الهيكلية الهامة للعينات.
لسنوات عديدة، كان تحديد نهج مشترك أو تجفيف العينات تماما استبعاد إشارة امتصاص المياه في الطيف. غير أن هذا النهج لا يسمح بقياسات الوقت الحقيقي على الخلايا الحية، هو أمر أساسي لدراسة تغيير التركيب الكيميائي والعمليات الخلوية مع مرور الوقت. طريقة واحدة للحصول على موثوقية امتصاص الأطياف من العينات البيولوجية الحية، الحد من طول المسار البصري الكلي في الأجل المتوسط شعاع الأشعة تحت الحمراء إلى أقل من 10 ميكرون4.
اتباع نهج راسخ في المعيشة تجارب الخلية قد تم حتى الآن، تخفيف انعكاس المجموع (ATR)-التصوير فتير، الذي يتيح لقياسات مستقلة عن سمك العينة، يسمح للخلايا أن تكون مستدامة في طبقة أكثر سمكا من المتوسطة مائي. ومع ذلك، يقيد عمق تغلغل الموجه زائل الصغيرة قياسات للعينات إلى فقط ميكرون القليلة الأولى من سطح الكريستال ATR5.
بدلاً من ذلك، قد تم التحايل على الحد امتصاص المياه مع ظهور نظم موائع جزيئية مختلفة، التي تصنف عموما إلى مجموعتين كبير: فتح قناة (واحدة من أسطح السوائل هي التي يتعرض فيها للغلاف الجوي) وإغلاق قناة (حيث اثنين من النوافذ الشفافة الأشعة تحت الحمراء مفصولة بفاصل مع سماكة محددة).
لوثيرباك et al. تطوير جهاز غشاء القناة المفتوحة التي تمكن طويلة الأجل مستمرة الأشعة تحت الحمراء القياسات من خلايا حية لمدة تصل إلى 7 أيام6. الأسلوب يتطلب ارتفاع نسبة الرطوبة في البيئة لمنع تبخر المتوسطة من سطح الخلية. النظام يعمل بشكل أفضل مع الخلايا التي تنمو طبيعيا في واجهات الهواء السائل، مثل الأنسجة الظهارية للجلد، والرئة، والعيون، أو الأغشية الحيوية الميكروبية7.
تكوين القناة المغلقة يهدف إلى خلق طبقة رقيقة، وموحدة بين اثنين من النوافذ الشفافة الأشعة تحت الحمراء الموازية، حيث يتم الاحتفاظ بالخلايا في وسائل الإعلام مائي. سمك هذا التجويف أن هذه إشارة امتصاص المياه أدناه التشبع. يمكن ثم طرح المياه الخلفية للحصول على الأطياف عينة الصحيحة. تستخدم معظم الطرق مغلقة-قناة بلاستيك فاصل يفصل بين اثنين من النوافذ لتشكيل دائرة سائل مربع للقطاعات3،،من89. ميزة هذا الأسلوب أنه يتطلب ميكروفابريكيشن؛ ومع ذلك، الهياكل التي أكثر تعقيداً من غرفة قياس مع قنوات لت والخروج صعبة للغاية لتحقيق في مباعدة رقيقة. وهناك أيضا مشكلة مع إمكانية تكرار نتائج طول المسار بين قياسات الأشعة تحت الحمراء بسبب اعتمادها على لقط الميكانيكية. من أجل تحقيق عنصر تحكم أكثر دقة من التباعد لعملية شراء طيف أكثر موثوقية، تم تنفيذ أساليب الطباعة الحجرية الضوئية لنمط مقاوم الضوء على رأس الركيزة الأشعة تحت الحمراء لتحديد فاصل9،10 , 11 , 12-على الرغم من أن هذا يجعل من الممكن لهياكل أكثر تعقيداً تعريف فاصل، الأسلوب يتطلب الوصول إلى مرفق ميكروفابريكيشن لإنتاج نمط على كل سفلية.
في هذه الورقة، نقدم تقنية بسيطة تصنيع جهاز موائع جزيئية المتوافقة مع الأشعة تحت الحمراء، بهدف الحد من تصنيع التكلفة ومتطلبات الوصول إلى منشأة ميكروفابريكيشن. الأسلوب قدم هنا (انظر الشكل 1) استخدامات عملية ثابتة تعرف باسم الطباعة الحجرية الناعمة. قوالب اثنين مطلوبة في هذه الحالة. القالب الأساسي مصنوع من رقاقة سيليكون 4 بوصة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الطباعة حجرية عملية قياسية. العفن الثانوي هي متماثلة لها مصنوعة من PDMS، الذي قطبية معكوسة للنمط في قالب السليكون الأولية ويخدم كالقالب الرئيسي لتصنيع جهاز اللاحقة.
الجهاز يحتوي على طبقات منفصلة اثنين: طبقة أولى مع تخطيط موائع جزيئية (يتكون في القضية المعروضة من القناة موائع جزيئية، وفي السماح/خارج--اسمحوا، ودائرة مراقبة مع منفذ العرض2 CaF)، وطبقة ثانية مع (سطح مستو الذي يتألف من فقط منفذ العرض2 CaF).
هنا لاصق ضوئية الأشعة فوق البنفسجية، نورلاند الضوئية لاصقة 73 (NOA73، من الآن فصاعدا باختصار كنوا)، يستخدم لتشكيل البلاستيك الجسم الرئيسي للجهاز. وهناك العديد من المزايا لاستخدام هذا اللاصق الضوئية: تلفيق منخفضة التكلفة، وسهولة الاتصال بالأنظمة الخارجية وشفافية بصرية جيدة، اللزوجة منخفضة، والأهم من ذلك، توافق مع الحياة13. الكاف2 خيار مناسب كمنفذ العرض نظراً لتوافق مع الحياة و الأشعة تحت الحمراء-الشفافية الممتازة14.
مع هذا النهج الجديد، الوصول إلى مرفق ميكروفابريكيشن دقة مطلوبة فقط من أجل تصنيع القالب الأساسي. يمكن أن تنفذ عمليات التصنيع اللاحقة للجهاز موائع جزيئية البلاستيك في أي مختبر مزودة بمصدر للأشعة فوق البنفسجية-إضاءة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. "إعداد القالب السليكون الأولية"
ملاحظة: مطلوب النبائط لإعداد القالب الأساسي. يمكن النبائط أما شراؤها من مقدمي الخدمات المستقلين أو ملفقة داخليا من خلال إجراءات تصنيع قناع الضوئية القياسية. يتم استخدام النبائط مع قطبية الحقل مشرقة في هذه الحالة ( الشكل 2 )-
- من تعريف نمط
- تدور معطف رقاقة سيليكون 4 بوصة مع مقاوم الضوء السلبية 3010 سو-8 2,300 لفة في الدقيقة لمدة 30 س.
- لينة-خبز مقاوم الضوء على صفيحة 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وثم إلى 95 درجة مئوية للحد الأدنى 8
- فضح مقاوم الضوء للأشعة فوق البنفسجية (i-خط، 365 نانومتر) عن طريق النبائط تحت راصفة قناع لجرعة الطاقة إجمالية من 100-120 مللي جول/سم 2؛ ويفضل وضع الاتصال الثابت للتوصل إلى حل أفضل.
- إزالة يفر وتطبيق خبز تعرض وظيفة 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وثم إلى 95 درجة مئوية للحد الأدنى 2
- وضع الواقي الضوئي باستخدام مطور سو-8 في درجة حرارة الغرفة، ثم شطف بكحول الأيزوبروبيل وضربه بلطف الجافة مع النيتروجين؛ وينبغي أن يكون نمط قياس السمك 10 ميكرون وأدناه. انظر الشكل 2 ب لصورة القالب السليكون الفعلي.
- سيلانيزيشن من السليكون العفن
- علاج العفن السيليكون مع الأكسجين البلازما في 60 واط لمدة 30 ثانية مع 20 sccm من تدفق الأوكسجين. تعيين ضغط الدائرة إلى 1-10 [مبر] أثناء العملية-
- مكان العفن في جرة فراغ مع 50 ميليلتر من سيلاني واترك الجرة في حالة فراغ (1-10 [مبر]) على الأقل 2 حاء
ملاحظة: إنشاء عملية سيلانيزيشن طلاء سطح مسعور مما يحول دون التمسك بالعفن 15 PDMS. لاحظ أن القالب الأساسي يمكن أيضا أن تكون ملفقة استخدام أسلوب بديل، الذي ينطوي على النقش الجاف من السيليكون. في هذه الحالة، ستكون النبائط القطبية المعاكس (حقل الظلام)، وسوف تستخدم تعريف النمط في الخطوة 1، 1 مقاوم الضوء إيجابية.
2. إعداد PDMS الثانوي العفن
- PDMS خلط
- مزيج الاستومر PDMS وعلاج عامل، 10:1؛ والمبلغ الإجمالي أن سمك PDMS الناتج حوالي 1 إلى 1.5 مم-
- بعد خلط دقيق، ديغا المخلوط بتركها في جرة فراغ في حالة فراغ (1-10 [مبر]) لمدة 15 دقيقة تقريبا أو حتى هناك لا فقاعات مرئية؛ وهذا لإزالة أي الهواء المحبوس داخل الخليط.
- النسخ المتماثل العفن
- صب الخليط PDMS على القالب السليكون ملفقة في الخطوة 1 وديغا الخليط لإزالة أي الهواء المحبوس بنفس الإعدادات كما هو الحال في الخطوة 2.1.2. الحرارة عند 70 درجة مئوية ح 2 على لوحة الساخن لعلاج الخليط. إزالة PDMS شُفي من صفيحة
- وندعه يبرد وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة. مع شفرة حلاقة، قطع PDMS على طول حواف القالب السليكون.
- مع زوج من ملاقط، قرصه زاوية واحدة من قطع PDMS وقشر بعناية النسخة المتماثلة PDMS قبالة العفن السليكون؛ وهو نمط موائع جزيئية الناتجة في هذه العفن الثانوية نتوء، وهو الأقطاب المتقابلة (القالب الأساسي الشكل 2 ج).
- سيلانيزيشن من النسخة المتماثلة PDMS (نفسها كما في الخطوة 1، 2)
- علاج العفن PDMS مع الأكسجين البلازما في 60 واط لمدة 30 ثانية مع 20 sccm من تدفق الأوكسجين. تعيين ضغط الدائرة إلى 1-10 [مبر] أثناء العملية-
- مكان العفن في فراغ جرة مع 50 ميليلتر من سيلاني واترك الجرة في حالة فراغ (1-10 [مبر]) على الأقل 2 حاء
3. إعداد قوالب PDMS
ملاحظة: لتوحيد شكل وحجم الأجهزة النهائية وتسهيل المواءمة بين السمات الرئيسية في النصفي، استخدمت قوالب PDMS منفصلة اثنين، التي تحدد الشكل الهندسي للجهاز، وضع إطار شفاف والاتصالات ليت والخروج. قالب PDMS الأولى الإيدز تلفيق نصف منقوشة بالجهاز، بينما الثاني يساعدك على تخفيف تلفيق نصف شقة من الجهاز-
- تصميم القوالب استخدام برامج تصميم (CAD) الحاسوب. الشكل 3 يظهر تخطيط وأبعاد القالب المستخدم لافتعال نصف منقوشة من الجهاز. لافتعال نصف شقة من الجهاز، قم بإزالة ثقوب قطرها 1.5 مم من التصميم-
- الحصول على القوالب من موفر خارجي أو من خلال حلقة عمل ميكانيكية داخلية إذا كانت متوفرة.
ملاحظة: استخدمت اﻷكريليك كقالب المادية بسبب سهولة التصنيع وانخفاض تكلفة يمكن تحقيقها في أي حلقة العمل القياسية. وهناك خيارات بديلة، مثل الطباعة 3D. - مزيج الاستومر PDMS وعلاج عامل 10:1؛ وتأكد من إعداد كمية كافية من PDMS إلى غمر تماما القوالب.
- بعد خلط دقيق، ديغا المخلوط بتركها في جرة فراغ في فراغ الدولة (1-10 [مبر]) لمدة 15 دقيقة تقريبا أو حتى هناك لا تظهر فقاعات (أيهما)؛ وهذا لإزالة أي الهواء المحبوس داخل الخليط.
- صب الخليط PDMS على قوالب اﻷكريليك حتى سطحها الأعلى هو غمرت حوالي 1 ملم تحت سطح السائل. ديغا PDMS مرة أخرى لإزالة أي الهواء المحبوس بنفس الإعدادات كما هو الحال في 3.4. حرارة هذا عند 60 درجة مئوية ح 2 على لوحة الساخن تعادل لعلاج الخليط. إزالة PDMS شُفي من صفيحة
- وندعه يبرد وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة. مع شفرة حلاقة، قطع PDMS على طول حواف القوالب اﻷكريليك.
- مع زوج من ملاقط، قرصه زاوية واحدة من قطع PDMS وقشر بعناية PDMS قبالة القوالب اﻷكريليك.
ملاحظة: يظهر الشكل 3 ب تخطيط وأبعاد PDMS النسخة المتماثلة المستخدمة لافتعال نصف منقوشة من الجهاز- - إعداد النسخة المتماثلة PDMS الثانية لاختلاق الشقة نصف الجهاز بتكرار الخطوات من 3.3 إلى 3.7 لكن استخدام قالب اﻷكريليك دون ثقوب قطرها 1.5 مم-
4. تصنيع جهاز موائع جزيئية
- تلفيق النصف منقوشة من الجهاز (أي، مع تخطيط الجهاز)
- علاج الإطار 2 CaF مع الأكسجين البلازما في 60 واط لمدة 30 ثانية مع sccm 20 من تدفق الأوكسجين. يتم ذلك لتحسين تدفق نوا أثناء تصنيع التالية.
ملاحظة: هذه الخطوة ليست إلزامية.
لوحة - المكان بعناية PDMS القالب الأول (واحد مع أعمدة قطرها 1.5 مم) على سطح مستو، مثلاً، الصودا جير (الشكل 4 ). ضع نافذة 2 CaF تركزت على رأس المكونات PDMS واضغط برفق في الإطار مثل هذا من اتصالات جيدة مع التوصيل ( الشكل 4 ب)-
- تأخذ العفن PDMS في الخطوة 2 ووضع صفيحة رقيقة شفافة الأشعة فوق البنفسجية (في هذه الحالة، لوحة الكوارتز، 500 ميكرومتر سميكة و 1.5 سم × 1.5 سم في الحجم) على مساعدات العفن، تتماشى مع موقع الدائرة المركزية ( الشكل 4 ج)-تأكد من أن لوحة الكوارتز اتصالات جيدة مع العفن PDMS.
ملاحظة: اللوحة مرو ه يمنع المنطقة غير المرغوب فيها من العفن من ملامسة بسهولة في الإطار 2 CaF. - بلطف مكان هذا الوجه العفن PDMS إلى أسفل نحو النافذة 2 CaF مع الدائرة فلويديك بالانحياز إلى مركز النافذة 2 CaF. تأكد من أن كافة العناصر (قالب والعفن والنافذة) على اتصال جيدة والانحياز ( الشكل 4 ج-4 د)-
- تدريجيا الاستغناء عن قطرات نوا في السماح للقالب PDMS والسماح لها بملء التجويف ببطء. مجرد الراتنج يأتي في اتصال مع حافة النافذة، تدفق الشعرية سيتم سد هذه الفجوة رقيقة (~ 10 ميكرومتر) بين العفن PDMS والكاف 2 نافذة ( الشكل 4 ﻫ-4f). علاج
- بعد أن يتم ملء التجويف تماما، نوا بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية (مثلاً، مع نظام تعرض للأشعة فوق البنفسجية-الصمام، الرقم 4 ز)-
ملاحظة: قد تختلف وقت التعرض تبعاً لذلك مع طاقة مصدر الأشعة فوق البنفسجية. ويتطلب النظام التعرض للأشعة فوق البنفسجية-الصمام، الذي يوفر كثافة طاقة 24 ميغاواط/سم 2، حوالي 90 s بقوة 100% ووضع التعرض المستمر. - بعناية إزالة لوحة الكوارتز رقيقة من الجزء الخلفي العفن PDMS وثم بلطف قشر العفن PDMS من الجزء العلوي من طبقة نوا ( الشكل 4 ح). وأخيراً، إزالة طبقة نوا من قالب PDMS ( الشكل 4 أنا)-
ملاحظة: سيكون تخطيط الجهاز الناتجة عن نوا شُفي الأقطاب نفس النمط في القالب السليكون الأولية.
- علاج الإطار 2 CaF مع الأكسجين البلازما في 60 واط لمدة 30 ثانية مع sccm 20 من تدفق الأوكسجين. يتم ذلك لتحسين تدفق نوا أثناء تصنيع التالية.
- تلفيق النصف شقة من الجهاز (أي دون تخطيط الجهاز)
- علاج الإطار 2 CaF مع الأكسجين في البلازما في 60 ث ل 30 ثانية مع 20 sccm من تدفق الأكسجين.
ملاحظة: هذه الخطوة ليست إلزامية. - المكان بعناية PDMS القالب الثاني (واحد دون دعامات قطرها 1.5 مم) على سطح مستو، مثلاً، لوحة الصودا جير. ضع نافذة 2 CaF تركزت على رأس المكونات PDMS واضغط برفق في الإطار مثل هذا من اتصالات جيدة مع المكونات.
- ضع ورقة PDMS 1 مم سميكة بحجم 5 × 3.5 سم أعلى النافذة 2 CaF، مع ورقة PDMS محاذي لمركز القالب PDMS. تأكد من أن الورقة PDMS اتصال جيدة مع النافذة.
- تدريجيا الاستغناء عن قطرات نوا في السماح للقالب PDMS والسماح لها ببطء ملء التجويف. علاج
- بعد أن يتم ملء التجويف تماما، نوا بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية (مثلاً، مع نظام تعرض للأشعة فوق البنفسجية-الصمام).
ملاحظة: قد تختلف وقت التعرض تبعاً لذلك مع مصدر الطاقة الأشعة فوق البنفسجية. مع نظام التعرض للأشعة فوق البنفسجية-الصمام، التي تنص على أن كثافة طاقة 24 ميغاواط/سم 2، وهذا يتطلب حوالي 50 s بقوة 100% ووضع التعرض المستمر- - قشر قبالة PDMS الورقة من الجزء العلوي من طبقة نوا وإزالة طبقة نوا علاجه بعناية من قالب PDMS.
- علاج الإطار 2 CaF مع الأكسجين في البلازما في 60 ث ل 30 ثانية مع 20 sccm من تدفق الأكسجين.
- الرابطة لنصفي الجهاز
- محاذاة النصفي للجهاز حيث يتم محاذاة كلا windows 2 CaF. بلطف الإصبع-الصحافة كلا نصفي في ركن الطبقات نوا أن تحدد موقف النصفي.
- قطع أقراص دائرية اثنين من أصل ورقة PDMS سميكة 1 ملم 8 ملم قطر تثقيب ( الشكل 5 ) باستخدام-
- قص مستطيلات اثنين بنفس الحجم من الجهاز (4 × 2.5 سم) من ورقة PDMS 1 مم سميكة. على كلا مستطيلات PDMS، قص الفتحات المقابلة للقنوات وفي--اسمحوا/الخروج-ليت الجهاز.
ملاحظة: الفتحات قبل قطع مستطيلات PDMS تهدف إلى منع القنوات من الانهيار أثناء الضغط. - المكدس في ما يلي الترتيب من الأسفل: مستطيل PDMS واحد مع الفتحات قبل قطع، قرص PDMS واحد (اتصال أسفل النافذة، وقص في الخطوة 4.3.2)، نصفي الإصبع-الضغط على الجهاز، والقرص PDMS الثاني (يجلس في الإطار العلوي)، وأخيراً المستطيل PDMS الثانية ذات الفتحات قبل قطع ( الشكل 5 ب)- ضع هذه الجمعية في إعداد فراغ الصحافة أن هي تقع بين لوحات 2
- وختم الكيس من البلاستيك ( الشكل 5 ج). قم بتشغيل المضخة الفراغ وإجلاء الجمعية العامة. ترك فراغ مضخة التوصل إلى قاعدة الضغط أو تطبيق الفراغ لمالا يقل عن 10 دقيقة
ملاحظة: ضغط قاعدة تحقق يعتمد على مضخة فراغ المستخدمة ونوعية بوضع ختم الكيس من البلاستيك- - فضح الجمعية الذين تم إجلاؤهم إلى الأشعة فوق البنفسجية مع مصباح غاز Hg الموجه عريضة في 270 ث عن 15 دقيقة بدوره قبالة مضخة فراغ وترك الجمعية ببطء تنفيس للضغط الجوي قبل إزالة الجهاز النهائي من الجمعية العامة-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويعرض الشكل 6 الأطياف منافذه النافذة2 CaF العلامة التجارية الجديدة، نصف منقوشة الجهاز، والجهاز كاملة. يحمل جميع الأطياف الثلاثة الشفافية الممتازة إلى منتصف الأشعة تحت الحمراء مع نفاذية أكبر من 80%. نمط التدخل مرئية في طائفة الجهاز الكامل (المنحنى الأصفر في الشكل) بسبب فجوة الهواء في حدود 9-10 ميكرون بين الإطارين. وتبين هذه الأطياف أن نهج تلفيق المعروضة هنا لا يغير من شفافية CaF2 في منتصف نطاق الأشعة تحت الحمراء.
الشكل 7 يبين مثالاً للنسخ المتماثل جيدة في نوا العفن PDMS الثانوي مع موائع جزيئية تقع السحب. يتم تشكيل هيكل أعلى النافذة2 CaF جيدا بسبب تقشير تنظيف طبقة نوا من العفن PDMS بعد الشفاء جزئيا من الأشعة فوق البنفسجية. ينبغي أن يظل لا نوا في القالب أو على سطح النافذة على اتصال بنتوءات العفن. نوا أي تمسك العفن تترجم إلى هيكل نوا في النافذة، والتي سوف تسبب تسرب أثناء تجارب تدفق الجهاز النهائي في عداد المفقودين. وبالإضافة إلى ذلك، تحقيق ختم جيدة النصفي، نوا ينبغي أن يظل مبتذل بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية من الطبقات نصف. نوا الإفراط علاجه إذا كان غير مبتذل. جرعة التعرض ينبغي أن يكون الأمثل لتحقيق مثل هذه النتيجة.
الشكل 7 بدلاً من ذلك، يظهر ب النسخ المتماثل الفاشلة في نوا فيها النمط في الإطار2 CaF غير معرفة بشكل صحيح. معظمهم من جراء عدم كفاية الأشعة فوق البنفسجية جرعة التعرض، أيتحت علاج نوا. في مثل هذه الحالات، نوا لا تزال رطبة إلى حد ما، مما تسبب في بعض منه إلى التمسك العفن PDMS. ومع ذلك، إذا نوا ما زالت تتمسك بالعفن PDMS حتى ولو أعطيت جرعة التعرض الصحيح، هذا يمكن أن أحد أعراض سيلاني طلاء (أي، طبقة مضادة عصا) يجري المتدهورة على مر الزمن. كما PDMS قالب لينة، ليس كما طويلة الأمد كالقالب الأساسي السليكون. أنه يحتاج إلى استبداله بعد عدد من الاستخدامات.
رقم 1: عملية تصنيع الأجهزة موائع جزيئية البلاستيكية: (أ-ه) التخطيطي لعملية التصنيع. (و) صورة لجهاز الفعلية والتخطيطي للمقطع العرضي لها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نظرة عامة على النبائط والسليكون الابتدائي العفن، والعفن الثانوية PDMS منسوخ من العفن السليكون: () النبائط مع الحقل مشرق قطبية (أعلى اليسار)؛ يكمن في تنفيذ النمط في النبائط (يمين) تتكون من: في السماح والسماح أوت مع أقطار 2 مم (1 و 2) والمسافة 3 سم بينهما، قنوات مع 300 ميكرون العرض (3)، اثنان مرجع الدوائر مع 5.5 مم × 0.75 ملم حجم (4)، والدائرة المركزية مع (حجم 5 × 2.5 مم 5)، حيود المشابك كدليل مرئي مع خطوط 10 ميكرون واسعة و 20 ميكرومتر الفجوة (6)؛ التكبير في وضع-للخروج من الدائرة المركزية تبين الحيود [غرتينغ] (أسفل اليسار). (ب) صورة للقالب السليكون الأولية مع النمط المعرفة في مقاوم الضوء سو-8. (ج) صورة العفن PDMS الثانوي مع عكس القطبية فيما يتعلق بالقالب الأساسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الأدوات قولبة على استعداد لتخفيف تصنيع الجهاز: () اﻷكريليك القالب: القالب الفعلي (أعلى) ورأيه مستعرضة التخطيطي (أسفل). (ب) PDMS نسخة من القالب اﻷكريليك: متماثلة الفعلية (أعلى) ورأيه مستعرضة التخطيطي (أسفل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: عملية تدفق لتصنيع نصف منقوشة للجهاز: () المكان PDMS القالب على سطح مستو. وهنا استخدمنا زجاج الصودا الجير. (ب) CaF يوضع2 تركزت على رأس المكونات PDMS. (ج-د) ويوضع العفن PDMS الوجه أسفل نحو الكاف2 مع الدائرة فلويديك بالانحياز إلى وسط الإطار. التأكد من أن جميع عناصر الاتصال الجيد والانحياز. (ه-و) سباكة نوا عبر في السماح والسماح لها بملء التجويف ببطء. (ز) نوا علاجه بتعريض أنه تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. جرعة التعرض قد تختلف تبعاً لطاقة مصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة. (ح) بعناية قشر العفن PDMS وقالب لإطلاق سراح نوا علاجه. (أنا) اكتمل الجهاز طبقة مع هياكل موائع جزيئية في نوا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : فراغ الصحافة الإعداد للضغط نصفي الجهاز لتشكيل جهاز كاملة: () PDMS قرص دائري (8 مم) ومستطيل PDMS (4 × 2.5 سم) مع الفتحات قبل قطع. يتم قطع كل من ورقة PDMS 1 مم سميكة. (ب) نظرة عامة على الطبقة-المكدس قبل الضغط. (ج) نظرة عامة على الصحافة فراغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : T منتصف الأشعة تحت الحمراء رانسميتانسي الأطياف من مقهى العارية 2 نافذة (أحمر)، نقش نصف الجهاز (أزرق)، وجهاز كامل (أصفر)- جميع الأطياف الثلاثة إبداء الشفافية الممتازة من منتصف الأشعة تحت الحمراء مع نفاذية أكبر من 80% الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
7 الرقم: منقوشة نصف الجهاز: () مثال لهيكل موائع جزيئية شكلت في نوا. ويبين المنطقة أكثر قتامة في الإطار بنية محددة تحديداً جيدا، تبين وضوح الدائرة المركزية، ودائرتي إشارة، والقنوات. (ب) مثال بنية سيئة شكلت موائع جزيئية في نوا بسبب أونديركورينج. وهناك إعادة تدفق نوا كما هو مبين بالأسهم الحمراء. أيضا إحدى الدوائر مرجع مفقود (السهم الأخضر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : الرقصة موائع جزيئية توصيل الجهاز ملفقة للدوائر الخارجية فلويديك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: العفن التنسيب PDMS أثناء تصنيع النصف منقوشة من الجهاز: () مثال جيد الموضع العفن PDMS في الإطار2 CaF. النافذة على اتصال فقط نتوء في القالب PDMS، تبين وضوح الدائرة المركزية، ودائرتي إشارة، والقنوات (يشار إليها بمنطقة أغمق). وتهدف المشابك الحيود حول الجهاز وفي مركز الدائرة المركزية لدليل مرئي أثناء وضع القالب PDMS. (ب) مثال لأحد المواضع السيئة من العفن PDMS في الإطار2 CaF. منطقة أغمق يبين أن هناك أيضا مجالاً غير المرغوب فيها من العفن، وعلى اتصال مع الإطار، كما هو مبين بالأسهم الحمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل تقييم وتحسين البروتوكول تلفيق، قمنا باستخدام تخطيط بسيط لنمط موائع جزيئية مع غرفة مستطيلة كبيرة (حجم 5 × 2.5 مم) مركز، ودائرتي مستطيلة صغيرة (حجم 5.5 مم x 0.75 مم) تفصل الدائرة الرئيسية في الطرفين العلوي والسفلي، و 300 ميكرون واسعة في--واسمحوا/الخروج-ليت القنوات. تستخدم الدائرة المركزية للبذر والمراقبة للخلايا، بينما دائرتي الصغيرة المنفصلة تستخدم لقياس الخلفية الهواء خلال فتير تجارب كدائرة مرجعية، كما ورد في منشور سابق13. في السماح والسماح خارج الاتصال الدائرة المركزية للنظام فلويديك الخارجي.
هنا، يتم عرض أدوات قولبة (راجع الخطوة 3 من البروتوكول) لتسهيل عملية التصنيع. سابقا، كان من الصعب لاستمرار وضع CaF2 windows بالضبط في مركز الجهاز النهائي، والذي تسبب في القضايا عند محاذاة النصفي للجهاز. استخدام قالب يوفر دليل مرئي لوضع الإطار ويضمن هذا الموقع دائماً مماثلة. متطلبات هندسية لهذه القوالب ليست صارمة جداً، ويمكن استخدام تكنولوجيات الإنتاج القياسية ورخيصة. وفي هذه الحالة، قدمنا لهم من البلاستيك اﻷكريليك عن طريق القطع في حلقة، لكن بديلة قابلة للحياة على قدم المساواة ورخيصة 3D الطباعة.
تصميم قوالب اﻷكريليك أن تتميز بما يلي (الشكل 3): (أ) قالب واحد صمم مع اثنين من الثقوب الصغيرة في كل جانب، بينما الثاني دون ثقوب؛ هي الثقوب قطرها 1.5 مم في الحجم و 1.5 ملم في العمق، (ب) كل قوالب حفرة دائرية بقطر 8 مم و 500 ميكرومتر عمق في المركز، و (ج) كلا قوالب يكون نتوء مستطيل تحديد الحجم والشكل، وسمك الجهاز نصف؛ المستطيل هو 4 × 2.5 سم في الطول/العرض و 1.5 مم في السمك.
قوالب PDMS الناتجة منسوخ من قوالب اﻷكريليك سيكون الأقطاب المتقابلة (الشكل 3ب): قالب واحد (أ) سيكون دعامتين على كل جانب بارتفاع 1.5 مم وقطرها 1.5 مم النموذج في السماح والسماح للخارج نصف منقوشة من الجهاز بعد صب نوا؛ القالب الثاني سيكون دون دعائم، (ب) كل قوالب يكون دعامة طوله 500 ميكرومتر في مركز لتخفيف وضع windows2 CaF؛ هذه الميزة سوف يشار إليها باسم "PDMS التوصيل"، وكلا قوالب (ج) مع تجويف، الذي يحدد الشكل النهائي وحجم كل نصف من الجهاز: مستطيل الشكل بسمك 1.5 مم وحجم 4 × 2.5 سم في هذه الحالة.
لتسهيل عملية تصنيع المزيد، أدرجت المشابك حيود في تصميم النبائط للقالب السليكون الأولية. في النسخة المتماثلة PDMS لهذا القالب السليكون، نتوءات الضحلة (التي هي أقل من 10 ميكرون في الطول) من الصعب أن نرى سبب شفافية PDMS الضوئية. ومع ذلك، تولد نتوءات الضحلة إذا رتبت في [غرتينغ] 10 ميكرون خطوط عريضة مع 20 ميكرومتر الفجوة نمط تدخل مرئية بسهولة16. وكان استغلال هذا النمط من التدخل كدليل مرئي تحديد موقف موائع جزيئية تقع السحب في العفن PDMS. تصميم القالب يتضمن إطار مصنوعة من [غرتينغ] لتعريف الهندسة الشاملة للجهاز. كذلك تمت إضافة آخر [غرتينغ] في منتصف الدائرة المركزية للتخطيط موائع جزيئية بغية تسهيل المواءمة مع الإطار2 CaF. تجدر الإشارة إلى أن [غرتينغ] في الدائرة المركزية لن تستنسخ في الجهاز النهائي، وهو يتألف من سلسلة من تجاويف القصيرة التي لا ترتبط بحافة الدائرة المركزية. ولذلك، لن قادراً على الوصول إلى هذه التجاويف نوا المتدفقة.
لحقن الخلايا وتبادل المتوسطة، يحتاج كل جهاز في السماح لها وترك خارج لكمات يدوياً قبل الختم. وادي ذلك إلى وضع غير قابل لإعادة الإنتاج من الثقوب. وهذا لم تحد تشغيل كل جهاز حيث تحقق الاتصال الالتصاق دبوس معدني صغير في إحدى الفتحات وإرفاق خزان بلاستيك في الجانب الآخر كأحد هواة جمع نفايات. ولذلك، اختلاف مواقف الثقوب لا للقلق إلا على حساب نظام تصنيع أكثر تعقيداً. لتبسيط وتوحيد الاستخدام النهائي والاختبار لكل جهاز، رقصة فلويديك مصنوعة خصيصا مع مواقع ثابتة في--واسمحوا/الخروج-ليت هو إزالة إدخال (انظر الشكل 8)، ضرورة إرفاق رقم pin وخزان. ومن ثم، سيقدم ثقوب في--واسمحوا/الخروج-ليت مواقف تتعارض مع مسألة هنا. من خلال دمج اثنين من الثقوب قطرها 1.5 مم في قالب اﻷكريليك ملفقة (الخطوة 3 من البروتوكول)، التي سوف تصبح الدعائم في العفن PDMS، تتم إزالة الحاجة إلى يدوياً لكمه ثقوب في نهايات القنوات موائع جزيئية. وعلاوة على ذلك، تم إصلاح موقفها ونفسه بالنسبة لكل جهاز.
يمكن التحقق من عدم وجود تسرب في الجهاز بنفس الإجراء كما تمت مناقشته في أماكن أخرى13 أي، عن طريق تغذية الجهاز مع حل فلوريسسين في الماء المتأين الشطب.
خطوات حاسمة في البروتوكول
أثناء تصنيع النصف منقوشة من الجهاز، والتنسيب العفن PDMS أعلى النافذة2 CaF بعناية وينبغي. هي هياكل فقط في القالب الذي يسمح للاتصال النافذة نتوءات عالية 10 ميكرون. كلما كان هناك مجال اتصال غير المرغوب فيها، وينبغي إعادة بنائه خطوة الموضع العفن. لتوضيح، الرقم 9 يوضح موضع عناية من العفن في النافذة، بينما الرقم 9ب يوضح مثال على وضع الفقراء، حيث منطقة غير المرغوب فيها من العفن على اتصال مع الإطار. الرقم 9 ب سيؤدي في بنية نوا مفقود في النافذة. لوحة الكوارتز الصغيرة المشار إليها في البروتوكول (الخطوة 4.1.3، الشكل 2ج) يساعد على وضع القالب كما أنه يمنع المنطقة غير المرغوب فيها من القالب بسهولة ملامسة الإطار2 CaF. كل لوحة الكوارتز والعفن PDMS أيضا رقيقة بحيث تكون خفيفة الوزن بما فيه الكفاية وشفاف للأشعة فوق البنفسجية17،18.
العثور على جرعة التعرض للأشعة فوق البنفسجية الصحيح للطبقات نصف أيضا حاسمة بالنسبة لعملية التصنيع. عندما يتعرض نوا بجرعة غير كافية، سوف انحسر نوا أونكوريد أثناء التقشير قبالة، مما تسبب في خسارة لتعريف هيكل وربما تفيض على سطح2 CaF. من ناحية أخرى، مرتفعة للغاية النتائج جرعة التعرض في علاج الإفراط في نوا، تحول نوا في دولة غير مبتذل. الربط اللاحق النصفي سيعاني لأنه سوف لا السندات غير مبتذل نوا على طبقة نصف منقوشة إلى الإطار2 CaF على طبقة نصف شقة. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون الجرعة الصحيحة التعرض أقصرالجرعة التي يسمح نوا لتكرار الهيكل موثوق بها مع الحفاظ على حالته مبتذل. إلى جانب تحديد جرعة التعرض الصحيح، الرابطة النصفي ينبغي القيام بأسرع وقت، خلال 30 دقيقة، كما الالتصاق نوا يتناقص بالتدريج مع مرور الوقت حتى أنه لم يعد ممكناً للترابط.
نقاط أخرى ملاحظة عند استخدام نظام الصحافة فراغ للربط. يجب أن يكون الامتثال الطبقات (أي، رقيقة أوراق PDMS ساندويتشينج الجهاز) سمك موحد نسبيا لتوزيع الضغط موحدة على الجهاز. ولهذا الغرض، استخدمت رقصة اكريليك مصنوعة خصيصا مع سماكة محددة بفاصلة للإدلاء بمثل هذه الأوراق PDMS. أوراق الامتثال ينبغي أن تكون نظيفة لتجنب إدخال الضغط المحلي، لا سيما في الإطار2 CaF هش.
مزايا أسلوب مقارنة بالأساليب القائمة
أثبت نهجنا تصنيع إنتاج البلاستيك جهاز متوافق مع القياسات فتير. نظراً لأن تقنية التصنيع الجزئي يوفر رقابة جيدة على البعد للميزة، التحكم ذروة القنوات موائع جزيئية قابلة للتحقيق أكثر دقة بكثير من ما يمكن الحصول عليها مع نهج تصنيع أخرى (مثلاً، الفواصل البلاستيكية).
ميزة حاسمة من هذا البروتوكول أنه ينتج جهاز بلاستيك مع عرض شفافة من الأشعة فوق البنفسجية-Vis-الأشعة تحت الحمراء-الموانئ؛ وأنتجت كافة الأجهزة المثبتة مسبقاً موائع جزيئية فتير على رأس ركيزة شفافة الأشعة تحت الحمراء كبيرة، التي تتطلب خطوات الطباعة الحجرية لكل جهاز10،،من1112. في النهج الحالي، يتم تقليل التكلفة والتعقيد من التلفيق فقط إنتاج العفن Si تتطلب الطباعة الحجرية.
وأخيراً، باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الشفاء الراتنج (NOA73 في هذه التظاهرة) كما يخفف الجسم البلاستيك الرئيسية ربط الجهاز بنظام التسليم سائل خارجي، أما بالالتصاق أو إرفاق الاتصالات إلى الهيئة البلاستيكية أو باستخدام رقصة فلويديك لأكثر سرعة جهاز الإنتاج أو الاستخدام.
التطبيقات المستقبلية للأسلوب
التحسينات الممكنة والتنمية التي يمكن استكشافها، هما الأكثر فورية وهامة. أولاً، يوحي الشفافية الضوئية ذات النطاق العريض على العرض المنفذ اقتران فتير مع مجهرية الفلورية ذات الدقة العالية على نفس المنصة. وهذا يمكن متابعتها بسهولة بتقليل سمك أحد النوافذ2 CaF بغية الامتثال لمتطلبات مسافة العمل مع أهداف عالية التكبير والفتحة العددية عالية. ثانيا، يمكن أن تسمح هذه الخطة تلفيق لتخطيطات فلويديك أكثر تعقيداً. يمكن تنفيذ عدة دوائر المراقبة والعناصر الوظيفية التي تربط بينهما مثل الخلاطات ووفارزات، ما دام يعرف هندسة تجاويف المفتوحة أسفل النوافذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف بامتنان MBI الدعم المالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical | |||
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS | |
| Norland Optical Adhesive 73 | Norland Products Inc. | 7304 | |
| SU8 3010 photoresist | MicroChem | Y311060 | |
| SU8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| Material | |||
| Silicon wafer, 4 inch, prime grade | Bonda Technology Pte Ltd | ||
| CaF2 IR-grade windows | Crystran, UK | CAFP10-1 | 10 mm diameter, 1 mm thickness |
| Acrylic templates | Custom made | ||
| Equipment | |||
| UV-KUB 2 (UV LED exposure system) | KLOE | Emission spectrum 365nm ± 5nm | |
| Newport UV lamp | Newport | Model 66902 | 50-500 Watt Hg arc lamp |
| CEE Spin coater | Brewer Science | Model 200x | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | ||
| Precision digital hot plate | Harry Gestigkeit GmbH | 2860SR | |
| Plasma Surface Technology | Diener Electronic GmbH + Co. KG | For O2 plasma treatment | |
| IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump | Agilent Technologies | ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar | |
| Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer | Bruker |
References
- Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
- Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
- Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
- Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
- Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
- Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
- Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
- Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
- Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
- Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
- Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
- Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
- Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
- Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
- Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
- Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).
