Summary
פרוטוקול עבור הזיוף של התקנים microfluidic פלסטיק עם תצוגה שקוף-יציאות עבור הדמיה אור גלוי, אינפרא-אדום מתואר.
Abstract
אינפרא-אדום (IR) ספקטרו-מיקרוסקופיה של דגימות ביולוגיות החיים היא הקשו את הספיגה של המים בטווח אמצע-IR ועל ידי חוסר התקנים מתאימים microfluidic. כאן, הוכח פרוטוקול על הזיוף של התקני פלסטיק microfluidic, שבו שיטות ליטוגרפיה רך משמשים להטבעת שקוף סידן פלואורי (CaF2) תצוגה-יציאות בקשר תצפית chamber(s). השיטה מבוססת על הגישה הליהוק של עותק משוכפל, כאשר תבנית polydimethylsiloxane (PDMS) הוא מיוצר באמצעות הליכים ליטוגרפית סטנדרטיים ו ואז להשתמש בו כתבנית כדי לייצר התקן פלסטיק. המכשיר מפלסטיק כולל אולטרה סגול/גלויה/אינפרא-אדום (UV/מול/IR) - בחלונות שקופים גלוי של CaF2 כדי לאפשר התבוננות ישירה עם ואור אינפרא-אדום. היתרונות של השיטה המוצעת כוללים: צורך מופחת גישה מתקן מיקרו-ייצור בחדר נקי, נוף-ביציאות מרובות, חיבור קל ופסיביות למערכת השאיבה חיצוני דרך הגוף פלסטיק, הגמישות של העיצוב, למשל , פתוח/סגור ערוצים, ותצורה של אפשרות להוסיף תכונות מתוחכמות כגון ממברנות nanoporous.
Introduction
אינפרא אדום צורה פורייה ספקטרו-מיקרוסקופ (FTIR) יש כבר מנוצל בהרחבה כמו טכניקה הדמיה לא פולשנית, ללא תווית לספק מידע מפורט כימי של מדגם. דבר זה מאפשר הפקת מידע ביוכימי כדי ללמוד את הכימיה של דגימות ביולוגיות, עם כמות מינימלית של הכנה מאז ספקטרום הבליעה של הדגימה נושא מהותי טביעות אצבעות של ההרכב הכימי שלה1 , 2. לאחרונה, FTIR יותר ויותר הוחל במחקר של דגימות ביולוגיות בשידור חי, למשל, תאים3. עם זאת, המים, המהווה האמצעי עבור תאים חיים ברוב המקרים, מראה של ספיגת חזקה באזור אמצע-IR. אפילו בתור שכבה דקה, נוכחותו יכול להציף לחלוטין את המידע המבני החשוב של דגימות.
במשך שנים רבות, הגישה הנפוצה היה תיקון או ייבוש דגימות לשלול לחלוטין את האות ספיגת מים בספקטרום. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת למדידות בזמן אמת על תאים חיים, שהוא חיוני ללמוד את השינוי של ההרכב הכימי שלהם תהליכים תאיים עם הזמן. דרך אחת להשיג אמין ספקטרום הבליעה של דגימות ביולוגיות בשידור חי, היא להגביל את אורך נתיב אופטי הכולל במדיום של קרן IR פחות מ- 10 מיקרומטר4.
בגישה ומבוססת חי ניסויים התא היה כה, השתקפות הכולל הקלוש (ATR)-FTIR הדמיה, אשר מאפשרת מדידות עצמאי של העובי לדוגמה, המאפשר לתאים להתקיים בשכבה עבה של מדיום מימית. עם זאת, עומק החדירה של הגל evanescent קטן מגבילה מדידות של דגימות רק מיקרונים אחדים הראשון מפני השטח של קריסטל ATR5.
לחלופין, יש כבר עקפו המגבלה ספיגת מים עם הופעתה של מערכות microfluidic שונים, אשר מסווגים בדרך כלל שתי קבוצות גדולות: ערוץ (איפה אחת של נוזל משטחים חשופים האווירה) פתוחות וסגורות ערוץ (ובו שני חלונות שקופים IR מופרדים באמצעות כרווח עם עובי מוגדר).
. Loutherback et al. פיתחה מכשיר ערוץ פתוח ממברנה המאפשרת זמן לטווח רציף IR מדידות של תאים חיים עד 7 ימים6. השיטה מחייבת לחות גבוהה בסביבה כדי למנוע אידוי של המדיום מפני השטח של התא. המערכת פועלת באופן הטוב ביותר עם תאים שגדלים באופן טבעי-ממשקי אוויר נוזלי, כגון רקמות אפיתל של העור, הריאות, ואת העיניים או חיידקים פתוגנים המועברים במזון7.
תצורה בערוץ סגור שואפת ליצור שכבה אחידה, דק בין שני חלונות שקופים IR מקביל, שבו תאים נשמרים בתקשורת מימית שלהם. העובי של חלל זה הוא האות ספיגת מים הוא מתחת רוויה. רקע מים ואז ניתן להפחית להשגת ספקטרום המדגם הנכון. רוב השיטות בערוץ סגור לנצל כרווח פלסטיק להפריד את שני חלונות כדי ליצור תא נוזלי מתקפל3,8,9. היתרון בשיטה זו הוא כי הוא אינו דורש מיקרו-מלאכותית; עם זאת, מבנים מורכבים יותר מאשר תא מדידה עם ערוצים, - ו -out - let קשים מאוד להבין, מרווח דק. יש גם בעיה עם הפארמצבטית אורך הנתיב בין מדידות IR בשל הסתמכותו על מחבר חובק למעקה מכני. על מנת להשיג שליטה מדויקת יותר של המרווח עבור רכישת אמין יותר הספקטרום, ליתוגרפיה אופטי שיטות יושמו במטרה דפוס photoresist על גבי המצע IR כדי להגדיר את מרווח9,10 , 11 , 12. אף-על-פי זה עושה את זה אפשרי עבור מבנים מורכבים יותר להגדיר את מרווח, השיטה דורשת גישה למתקן מיקרו-מלאכותית כדי לייצר את התבנית על כל המצע.
בנייר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה פבריקציה נוספת של התקן התואם ל- IR microfluidic, ועם במטרה להפחית את ייצור עלתה הדרישה של גישה מתקן מיקרו-מלאכותית. השיטה המוצגת כאן שימושים (ראה איור 1) תהליך הוקמה המכונה ליתוגרפיה רך. שתי תבניות נדרשות במקרה זה. כייר הראשי עשוי רקיק 4 אינץ סיליקון באמצעות תהליך רגיל של ליתוגרפיה UV. כייר המשני הוא משוכפל שלה עשוי PDMS, אשר יש של קוטביות הפוכה של התבנית כייר העיקרי סיליקון ומשמש, התבנית בסיס ייצור ההתקן הבאים.
למכשיר יש שתי שכבות נפרדות: שכבה ראשונה עם הפריסה microfluidic (אשר במקרה הציג מורכב של התעלה microfluidic, ב- / out תרשה תא תצפית עם אשנב2 CaF), שכבה נוספת עם (משטח שטוח אשר מורכב רק אשנב2 CaF).
כאן דבק אופטי UV-לריפוי, Norland אופטי דבק 73 (NOA73, באופן מקוצר כנועה מעתה ואילך), משמש כדי ליצור את הגוף פלסטיק העיקרי של המכשיר. ישנם מספר יתרונות של שימוש זה דבק אופטי: עלות ייצור נמוכה, קלות קישוריות עם מערכות חיצוניות, שקיפות אופטית טובה, צמיגות נמוכה, והכי חשוב, הביו13. CaF2 היא בחירה מתאימה כמו האשנב בשל התאימות שלה IR-שקיפות מעולה14.
עם גישה חדשה זו, גישה למתקן מיקרו-מלאכותית נדרשת אך ורק רק הזיוף של העובש העיקרי. תהליכי ייצור עוקבות עבור ההתקן microfluidic פלסטיק יכול להתבצע במעבדה כל מצויד עם מקור UV-תאורה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של סיליקון העיקרי עובש
הערה: photomask נדרש עבור הכנת כייר העיקרי. Photomask יכול להיות לרכוש מספקי עצמאית או מפוברק בארגון באמצעות הליכי ייצור מסכת אופטי סטנדרטי. Photomask עם קוטביות שדה בהיר משמש במקרה זה ( איור 2 ).
- תבנית הגדרת
- ספין מעיל רקיק צורן 4 אינץ עם סו-8 3010 photoresist שלילי-2,300 סל"ד ל 30 ס
- רך-אופים photoresist על פלטה חמה ב- 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות
- לחשוף את photoresist לאור UV (i-line, 365 ננומטר) דרך photomask תחת המסכה aligner עבור מנה האנרגיה הכוללת של 100-120 mJ/cm 2; מצב קשר קשה הוא העדיפו להגיע לפתרון טוב יותר.
- הסר את לחם הקודש ולהחיל פוסט החשיפה אופים ב 65 ° C עבור 1 דקות ולאחר מכן ב 95 ° C עבור 2 דק.
- לפתח את photoresist באמצעות מפתח SU-8 בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם אלכוהול איזופרופיל, ולפוצץ בעדינות יבש עם חנקן; עובי התבנית נמדד צריך להיות 10 מיקרומטר ומטה. ראה איור 2 b עבור התמונה התבנית סיליקון בפועל.
- Silanization סיליקון עובש
- לטפל בתבנית סיליקון עם חמצן פלזמה 60 W ב-30 s עם 20 sccm של זרימת חמצן. הגדר את הלחץ תא mbar 1-10 במהלך התהליך.
- מניחים את התבנית בתוך צנצנת ואקום עם 50 µL של silane ולהשאיר את הצנצנת במדינה ואקום (1-10 mbar) לפחות 2 ה
הערה: תהליך silanization יוצר ציפוי פני השטח הידרופובי אשר מונעת PDMS נשאר עם תבנית ה- 15. שימו לב כי העובש הראשי יכול גם להיות מפוברק באמצעות שיטה חלופית, שכרוך איכול יבש של הסיליקון. במקרה זה, photomask יהיה מול קוטביות (שדה אפל), הגדרת התבנית בשלב 1.1 ישתמש photoresist חיובי של.
2. הכנה של עובש משני PDMS
- PDMS ערבוב
- לערבב את PDMS elastomer ריפוי סוכן, 10:1; הסכום הכולל הוא כזה עובי PDMS המתקבל הוא כ 1 ל 1.5 מ מ.
- לאחר ערבוב יסודי, דגה את התערובת על ידי השארת אותו בתוך צנצנת ואקום במדינה ואקום (1-10 mbar) למשך כ- 15 דקות או עד אין בועות גלוי; זו כדי להסיר את כל האוויר לכודה בתוך התערובת.
- עובש שכפול
- שופכים את התערובת PDMS על העובש סיליקון מפוברק בשלב 1, דגה את התערובת כדי להסיר את כל האוויר לכודה את אותן הגדרות כמו שלב 2.1.2. חום-70 מעלות צלזיוס במשך שעתיים על פלטה חמה כדי לרפא את התערובת.
- להסיר את PDMS נרפא הכיריים ולתת לזה להתקרר עד לטמפרטורת החדר. עם סכין גילוח, לחתוך את PDMS לאורך שולי התבנית סיליקון.
- עם זוג מספריים, קמצוץ באחת מפינות החתך PDMS ו קלף בזהירות את העותק המשוכפל PDMS את העובש הסיליקון; התבנית microfluidic וכתוצאה מכך על זה עובש משנית היא בליטה, אשר קוטביות הפוכה של (עובש הראשי איור 2 ג).
- Silanization של העותק המשוכפל PDMS (כמו שלב 1.2)
- מתייחסים כייר PDMS עם חמצן פלזמה 60 W ב-30 s עם 20 sccm של זרימת חמצן. הגדר את הלחץ תא mbar 1-10 במהלך התהליך.
- המקום כייר בוואקום צנצנת עם 50 µL של silane ולעזוב את הצנצנת במדינה ואקום (1-10 mbar) לפחות 2 ח'
3. הכנת תבניות PDMS
הערה: כדי לתקנן את הצורה והגודל של המכשירים הסופי וכדי להקל את היישור של התכונות העיקריות של שני החצאים, שתי תבניות PDMS נפרד שימשו, המגדיר את הגיאומטריה של המכשיר, מיקום חלון שקוף וב - ו -out - let החיבורים. התבנית הראשונה PDMS מסייע הזיוף של המחצית עם דוגמה של המכשיר, בעוד השני מסייע להקל על הזיוף של המחצית שטוח של המכשיר-
- עיצוב התבניות באמצעות תוכנת העיצוב (CAD) באמצעות מחשב. איור 3 מציגה את לפרוס הממדים של התבנית המשמשת כדי לפברק את החצי עם דוגמה של המכשיר. ולהמציא חצי שטוח של המכשיר, להסיר את החורים בקוטר 1.5 מ מ בעיצוב.
- לרכוש את התבניות של ספק חיצוני או באמצעות וטכני פנימי של אם הוא זמין.
הערה: אקריליק שימש כמו התבנית גשמי בשל קלות פבריקציה נוספת, נמוכה עלות השגה בסדנה סטנדרט כלשהו. קיימות אפשרויות חלופיות, כגון הדפסה תלת-ממדית. - לערבב את PDMS elastomer, ריפוי סוכן 10:1; הקפד להכין כמות מספקת של PDMS לחלוטין ומטביעים את התבניות.
- לאחר ערבוב יסודי, דגה את התערובת על ידי השארת אותו בתוך צנצנת ואקום במדינה ואקום (1-10 mbar) למשך כ 15 דקות, או עד אין בועות גלוי (מביניהם מאוחר יותר); זה כדי להסיר את כל האוויר לכודה בתוך התערובת.
- שופכים את התערובת PDMS על תבניות אקריליק עד פני השטח העליון שלהם שקוע כ- 1 מ מ מתחת לפני השטח נוזלי. דגה את PDMS שוב כדי להסיר את כל האוויר לכודה את אותן הגדרות כמו 3.4. לחמם? את זה ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעתיים על פלטה חמה מפולס כדי לרפא את התערובת.
- להסיר את PDMS נרפא הכיריים ולתת לזה להתקרר עד לטמפרטורת החדר. עם סכין גילוח, לחתוך את PDMS לאורך קצות התבניות אקריליק.
- עם זוג מספריים, קמצוץ באחת מפינות החתך PDMS ו קלף בזהירות את PDMS את התבניות אקריליק.
הערה: איור 3 b מציג את לפרוס ואת הממדים של העותק המשוכפל PDMS נהגה לפברק את החצי עם דוגמה של המכשיר- - להתכונן המשוכפל השני PDMS בדיית הדירה חצי של המכשיר על ידי וחזור על שלבים 3.3 ל 3.7 אלא באמצעות התבנית אקרילי ללא החורים בקוטר 1.5 מ מ.
4. ייצור המכשיר Microfluidic
- פבריקציה נוספת של המחצית עם דוגמה של המכשיר (כלומר, עם התקן פריסה)
- התייחס לחלון 2 קפה עם חמצן פלזמה 60 W ב-30 s עם 20 sccm של זרימת חמצן. זאת במטרה לשפר את הזרימה של נועה במהלך הזיוף הבאה.
הערה: השלב זה אינו חובה. - המקום בזהירות PDMS התבנית הראשונה (אחד עם העמודים בקוטר 1.5 מ מ) על משטח שטוח, למשל, סודה לימון צלחת ( איור 4 ). למקם חלון 2 CaF ממורכז מעל התקע PDMS, לחץ בעדינות את החלון כך נמצא קשר טוב עם התקע ( איור 4 b).
- לקחת את התבנית PDMS שנעשו בשלב 2 ומניחים צלחת UV שקופים דק (בתוך התיק הזה, צלחת קוורץ, עבה 500 מיקרומטר, 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ בגודל) על הישבן של העובש, מיושר עם המיקום של החדר המרכזי ( איור 4 c). לוודא כי המשטח קוורץ הוא בקשר טוב עם העובש PDMS.
הערה: Thצלחת קוורץ e מונע האזור לא רצויים של העובש בקלות במגע עם חלון 2 CaF. - הנח בעדינות את הפנים עובש PDMS למטה לעבר החלון 2 קפה עם תא fluidic מיושר למרכז החלון 2 CaF. ודא כי כל המרכיבים (תבנית, כייר ו חלון) הם בקשר טוב, מיושר ( איור 4 c-4 d).
- בהדרגה לוותר על טיפות של נועה בב-תנו של התבנית PDMS, תנו לו לאט למלא את חלל הבטן. ברגע השרף בא במגע עם הקצה של החלון, הזרם נימי ימלא את הפער דק (~ 10 מיקרומטר) בין PDMS עובש חלון 2 CaF ( איור 4 e-4f).
- לאחר החלל מתמלא לגמרי, לרפא את נועה על ידי חשיפה לאור UV (למשל, עם מערכת חשיפה UV-LED, איור 4 g)-
הערה: זמן החשיפה עשויים להשתנות בהתאם עם האנרגיה של המקור UV. מערכת חשיפה UV-LED, אשר מספק צפיפות כוח של mW/cm 24 2, דורש בסביבות 90 s ב 100% כוח ומצב חשיפה מתמשכת. - הסר בזהירות את הצלחת קוורץ דק מהחלק האחורי של העובש PDMS, ואז מקלפים בעדינות את התבנית PDMS מהחלק העליון של השכבה נועה ( איור 4 h). בסופו של דבר, להסיר את שכבת נועה מהתבנית PDMS ( איור 4 אני).
הערה: הפריסה שתיווצר התקן על נועה נרפא יש קוטביות זהה של התבנית ב כייר סיליקון העיקרית.
- התייחס לחלון 2 קפה עם חמצן פלזמה 60 W ב-30 s עם 20 sccm של זרימת חמצן. זאת במטרה לשפר את הזרימה של נועה במהלך הזיוף הבאה.
- פבריקציה נוספת של המחצית שטוח של המכשיר (כלומר, ללא התקן פריסה)
- מתייחסת לחלון 2 קפה עם חמצן פלזמה 60 W ב-30 s עם 20 sccm של זרימת חמצן.
הערה: השלב זה אינו חובה. - במקום בזהירות את התבנית PDMS השני (אחד ללא עמודי בקוטר 1.5 מ מ) על משטח שטוח, למשל, צלחת סודה לימון. למקם חלון 2 CaF ממורכז מעל התקע PDMS, לחץ בעדינות את החלון כך נמצא קשר טוב עם התקע.
- מקום סדין PDMS בעובי 1 מ מ בגודל 5 ס"מ x 3.5 ס"מ מעל החלון 2 האפריקאית, עם הסדין PDMS מיושר למרכז התבנית PDMS. ודא כי הסדין PDMS על קשר טוב עם החלון.
- בהדרגה לוותר על טיפות של נועה בב-תנו של התבנית PDMS ולתת לו לאט למלא את החלל.
- לאחר החלל מתמלא לגמרי, לרפא את נועה על ידי חשיפה לאור UV (למשל, עם מערכת חשיפה UV-LED).
הערה: זמן החשיפה עשויים להשתנות בהתאם עם מקור האנרגיה UV. עם מערכת חשיפה UV-LED, אשר מספק צפיפות כוח של mW/cm 24 2, זה דורש בסביבות 50 s ב 100% כוח ומצב חשיפה מתמשכת. - פיל הגיליון PDMS מהחלק העליון של השכבה נועה לסירוגין הסר בזהירות את השכבה נועה נרפא מן התבנית PDMS.
- מתייחסת לחלון 2 קפה עם חמצן פלזמה 60 W ב-30 s עם 20 sccm של זרימת חמצן.
- מליטה של שני החצאים של המכשיר
- ליישר את שני החצאים של ההתקן כזה כי מיושרים CaF 2 החלונות. בעדינות אצבע-press שני החצאים בפינה של הרבדים נועה כזה כי המיקום של שני החצאים קבועים.
- גזור שני דיסקים מעגלית מתוך 1 מ מ עבה PDMS גיליון באמצעות של 8 מ מ קוטר ניקוב ( איור 5 ).
- חותכים שני מלבנים באותו הגודל של המכשיר (4 ס מ x 2.5 ס מ) עם מגליון PDMS בעובי 1 מ מ. על שני מלבנים PDMS, לחתוך פתחים התואם את הערוצים ו בתן/out-let של המכשיר-
הערה: הפתחים חתוכות מראש המלבנים PDMS נועדו למנוע את הערוצים קורסת במהלך דחופים. - מחסנית הבאות סדר מלמטה: מלבן אחד PDMS עם פתחים חתוכות מראש, one דיסק PDMS (במגע עם החלון התחתון, לחתוך בשלב 4.3.2), שני החצאים מכבישה האצבע של המכשיר, הדיסק PDMS השני (יושב על החלון העליון), ולבסוף המלבן PDMS השני עם פתחים חתוכות מראש ( איור 5 b).
- למקם הרכבה זו בכיוונון מכבשי וואקום כזה כי זה דחוקה בין שתי צלחות, לסגור את השקית פלסטיק ( איור 5 c). הפעל את משאבת ואקום ולאחר לפנות את ההרכבה. . תן את משאבת ואקום להגיע לחצה על בסיס או להחיל את הואקום במשך לפחות 10 דקות
הערה: הלחץ הבסיס מושגת תלוי משאבת ואקום המשמש ואיכות אטימה של שקית הניילון. - לחשוף את מכלול פונו כדי UV עם מנורת גז פס רחב Hg ב 270 W עבור 15 דקות להפוך את משאבת ואקום ולתת מכלול לאט לפרוק לחץ אטמוספירי לפני הסרת ההתקן האחרון מההרכבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 6 מציג את ספקטרום להדמיה של CaF2 חלון חדש, החצי בדוגמת של המכשיר, ואת המכשיר מלאה. הספקטרום שלושה להפגין שקיפות מעולה כדי IR באמצע עם להדמיה הגדולים מ- 80%. תבנית ההתאבכות גלוי הספקטרום של המכשיר מלאה (צהוב עיקול באיור) נגרמת על ידי הפער אוויר בטווח של 9-10 מיקרומטר בין שני חלונות. ספקטרה אלה מדגימים כי הגישה פבריקציה נוספת המובאת כאן לא לשנות את השקיפות של CaF2 בטווח אינפרא-אדום באמצע.
איור 7 מראה דוגמה של שכפול טוב נועה התבנית משני PDMS עם microfluidic שכב מתוך. המבנה מעל החלון2 קפה טוב נוצר בגלל הפילינג נקי של השכבה נועה מ כייר PDMS אחרי זה UV-נרפא באופן חלקי. נועה לא צריכים להישאר על העובש או על פני חלון עם בליטות עובש. נועה כל דבוקה העובש מיתרגם חסר מבנה נועה על החלון, אשר ייגרמו הדלפות במהלך הניסויים זרימה של המכשיר הסופי. בנוסף, כדי להשיג אטימה טובה של שני החצאים, נועה עדיין צריך להיות דביק לאחר חשיפה UV של השכבות חצי. נועה הוא נרפא יתר על המידה אם זה שאינו דביק. מינון החשיפה צריך להיות מוטבת כדי להשיג תוצאה כזו.
איור 7 b מציג במקום, השכפול נכשלת נועה שם התבנית על החלון2 CaF איננו מוגדר כראוי. היא נגרמת בעיקר לא מספיקות UV מינון החשיפה, קרי, תחת-ריפוי של נועה. במקרים כאלה, נועה הוא עדיין קצת רטוב, גורם חלק ממנו לדבוק כייר PDMS. עם זאת, אם נועה נדבק עדיין PDMS עובש למרות המינון הנכון חשיפה ניתנה, זה יכול להיות סימפטום של ציפוי (כלומר, מקל נגד שכבה) silane להיות מושפל לאורך זמן. כפי PDMS היא תבנית רך, זה לא ארוך שנמשך כמו עובש העיקרי סיליקון. זה צריך להיות מוחלף לאחר מספר שימושים.
איור 1: תהליך ייצור של התקני פלסטיק microfluidic: (-י) תיאור סכמטי של תהליך ייצור. (f) התמונה של התקן בפועל ואת תיאור סכמטי של חתך הרוחב שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סקירה של photomask, סיליקון העיקרי עובש, עובש משני PDMS משוכפלות משרתי כייר הסיליקון: () Photomask עם שדה בהיר קוטביות (למעלה משמאל); לפרוס של הדפוס ב photomask (מימין) המורכב: בתן ותן יותר עם קטרים 2 מ מ (1 ו-2), מרחק של 3 ס מ ביניהם, ערוצי עם 300 µm רוחב (3), שניים הפניה צ'יימברס עם 5.5 מ"מ x 0.75 מ מ בגודל (4), החדר המרכזי עם (גודל 5 מ מ x 2.5 מ מ 5), שבירת סורגי כמדריך חזותי עם קווים 10 מיקרומטר רחב והפער 20 מיקרומטר (6); זום-אין שכב מתוך החדר המרכזי מציג את סריג עקיפה (משמאל למטה). (b) תמונה של כייר העיקרי סיליקון עם הדפוס מוגדרות ב- photoresist SU-8. (ג) תמונה של כייר משני PDMS עם הפוך קוטביות ביחס כייר העיקרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הכלים תבניות מוכנים להקל על הזיוף התקן: () אקריליק תבנית: תבנית בפועל (למעלה) ואת תצוגת חתך סכימטי שלה (למטה). (b) PDMS המשוכפל של תבנית אקרילי: עותק משוכפל בפועל (למעלה), תצוגת חתך סכימטי שלה (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תהליך זרימה עבור הזיוף של המחצית עם דוגמה של המכשיר: () המקום PDMS התבנית על משטח שטוח. כאן השתמשנו סודה לימון זכוכית. (b) CaF2 מושם ממורכז מעל התקע PDMS. (c-d) PDMS עובש הוא כשגבם כלפי מעלה לכיוון ה-CaF2 עם תא fluidic מיושר למרכז של החלון. ודא כי כל היסודות הם בקשר טוב, מיושר. (e-f) הליהוק של נועה דרך בתן ומאפשר לו לאט למלא את חלל הבטן. (g) נועה נרפא על ידי תחת אור UV. מינון החשיפה עשוי להשתנות בהתאם האנרגיה של מקור UV המשמש. (h) מקלפים בזהירות את PDMS עובש ואת תבנית כדי לשחרר את נועה נרפא. (אני) הושלם התקן שכבה עם מבנים microfluidic נועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : בהגדרת לחץ ואקום הקשה על שני החצאים של המכשיר כדי ליצור התקן המלא: דיסק עגול () PDMS (8 מ מ קוטר), PDMS מלבן (4 x 2.5 ס מ) עם פתחים חתוכות מראש. שניהם נחתכים מגליון PDMS בעובי 1 מ מ. (b) סקירה של השכבה-המחסנית לפני דחופים. (ג) סקירה של העיתונות ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : אמצע-IR t ransmittance ספקטרום של קפה חשופות 2 חלון (אדום), בדוגמת חצי של המכשיר (כחול), ואת מכשיר שלם (צהוב). הספקטרום שלושה מפגינים שקיפות מעולה כדי IR באמצע עם להדמיה הגדולים מ- 80% אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: בדוגמת חצי של המכשיר: () דוגמה של מבנה תקין microfluidic נועה. אזור כהה יותר על החלון מציג מבנה מוגדרת היטב, מציג באופן ברור. החדר המרכזי, צ'יימברס הפניה שני הערוצים. (b) דוגמה של מבנה microfluidic מבנה לקוי של נועה עקב undercuring. אין הזרמה של נועה כמצוין על-ידי חצים אדומים. באחד התאים התייחסות גם חסר (חץ ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : יג Microfluidic לחבר את ההתקן מפוברק המעגלים החיצוניים fluidic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: השמה של PDMS עובש במהלך ייצור של המחצית עם דוגמה של המכשיר: () דוגמה טובה השמה עובש PDMS על החלון2 האפריקאית. החלון הוא בקשר עם רק בליטה על העובש PDMS, מציג באופן ברור. החדר המרכזי, צ'יימברס הפניה שני הערוצים (שצוין על-ידי האזור הכהה יותר). סורגי עקיפה מסביב למכשיר, במרכז החדר המרכזי נועדו כמדריך חזותי במהלך מיקום התבנית PDMS. (b) דוגמה של מיקום גרוע עובש PDMS על החלון2 האפריקאית. האזור הכהה יותר מראה כי יש גם שטח בלתי רצויות של העובש, אשר נמצא בקשר עם החלון, כפי שצוינו באמצעות החיצים האדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על מנת להעריך ולמטב את פרוטוקול פבריקציה נוספת, השתמשנו פריסה פשוטה את דפוס microfluidic עם חדר מלבני גדול (5 מ"מ x 2.5 מ"מ גודל) במרכז, שני תאים מלבני קטן (גודל 5.5 מ"מ x 0.75 מ"מ) הופרדו המעגל הראשי על הצדדים עליון ותחתון, ועד 300 מיקרומטר רחב בתן/out-let ערוצים. החדר המרכזי משמש את זריעה, תצפית של התאים, בעוד התאים הקטנים מופרדים שני משמשים כדי למדוד את הרקע אוויר במהלך FTIR ניסויים כמו חדר הפניה, כפי שפורט הפרסום הקודם13. בתן, תן מחוץ לחבר החדר המרכזי למערכת fluidic חיצוניים.
. הנה, כלים תבניות (ראה פרוטוקול שלב 3) הם הציגו כדי להקל על תהליך ייצור. בעבר, זה היה קשה באופן עקבי למקם את החלונות2 CaF בדיוק במרכז המכשיר הסופי, מה שגרם בעיות בעת יישור שני החצאים של המכשיר. השימוש של התבנית מספק מדריך חזותי עבור הצבת החלון ומבטיחה כי המיקום תמיד דומה. הדרישות גיאומטרי עבור תבניות אלה אינם מחמירים מאוד, טכנולוגיות ייצור רגיל וזול יכול לשמש. במקרה זה, אנחנו יצרנו אותם מפלסטיק אקרילי באמצעות עיבוד שבבי בסדנה, אבל חלופה קיימא וזולים באותה מידה היא הדפסת תלת-ממד.
העיצוב של התבניות אקרילי הוא כזה הם כוללים את הפריטים הבאים (איור 3): (א) תבנית אחת נועד עם שני חורים קטנים בכל צד, ואילו השני הוא ללא חורים; החורים הם בקוטר 1.5 מ מ בגודל 1.5 מ מ לעומק, (b) הן תבניות יש חור עגול בקוטר 8 מ מ, עומק מיקרומטר 500 במרכז, (ג) שתי תבניות יש בליטה מלבני כדי להגדיר את גודל, צורה, ואת העובי של המכשיר חצי; המלבן הוא 4 ס"מ x 2.5 ס"מ אורך/רוחב 1.5 מ מ עובי.
התבניות PDMS וכתוצאה מכך משוכפלות משרתי התבניות אקריליק יהיה את הקוטביות הפוכה (איור 3ב'): (א) תבנית אחת יהיו שני עמודים בכל צד עם 1.5 מ מ קוטר וגובה 1.5 מ מ טופס בתן ולתת יותר של בדוגמת חצי של המכשיר אחרי נועה הליהוק; התבנית השניה יהיה ללא עמודים, (b) בשתי תבניות יש עמוד גבוה מיקרומטר 500 במרכז כדי להקל מיקום החלונות2 CaF; תכונה זו יטופלו כמו "תקע PDMS", שתי תבניות (ג) הם עם חור, המגדיר את הצורה הסופית ואת גודל של חצי אחד של המכשיר: מלבן צורה עם 4 ס"מ x 2.5 ס"מ גודל ו 1.5 מ מ עובי, במקרה הזה.
כדי להקל עוד יותר על התהליך פבריקציה נוספת, עקיפה מיכסים שולבו בעיצוב של photomask עבור כייר סיליקון העיקרי. בעותק המשוכפל PDMS זה עובש סיליקון, בליטות רדוד (שהם פחות מ- 10 מיקרומטר בגובה) קשים בשל השקיפות אופטי של PDMS. עם זאת, בליטות רדוד אם מסודרים סריג של קווי רחב 10 מיקרומטר עם 20 מיקרומטר הפער ליצור דפוס של הפרעה גלויים בקלות16. תבנית ההתאבכות זו נוצלה כמדריך חזותי כדי להגדיר את המיקום של microfluidic שכב מתוך כייר PDMS. העיצוב של העובש משלב מסגרת העשוי לבנין כדי להגדיר את הגיאומטריה הכללית של המכשיר. סריג אחר היה הוסיף באמצע החדר המרכזי של פריסת microfluidic כדי להקל על יישור עם החלון2 האפריקאית. ראוי לציין כי לבנין בתא המרכזי ניתן לשחזר את ההתקן האחרון הוא מכיל סדרה של חללים קצר אשר אינם מחוברים לקצה החדר המרכזי. לכן, נועה זורם לא יוכל לגשת חללים אלו.
כדי להפוך את התא הזרקת exchange בינוני, לכל התקן דרוש שלה בתן ותן מחוץ אגרוף באופן ידני לפני איטום. כתוצאה מכך מיצוב שאינו לשחזור חורים. זה לא להגביל את הפעולה של כל התקן מאז החיבור הושגה על ידי הדבקת פין מתכתי קטן באחד הפתחים וצירופם מאגר פלסטיק בקצה השני כאספן פסולת. לכן, בעמדות של החורים שונות היא לא דאגה חוץ במחיר של ערכת ייצור מורכבים יותר. כדי לפשט, לתקנן את השימוש בדיקות והאחרון של כל מכשיר, ג'יג fluidic בהזמנה אישית עם קבוע בתן/out-let מיקומים הציג (ראה איור 8), מסיר את הצורך לצרף את ה-pin ואת מאגר. לפיכך, בתן/out-let חורים עם עמדות לא עקבי יציג בעיה כאן. על ידי שילוב שני חורים בקוטר 1.5 מ מ בתבנית מפוברק אקריליק (פרוטוקול שלב 3), אשר יהפכו העמודים ב כייר PDMS, מוסר את הצורך ליצור באופן ידני. חורים בקצוות של ערוצי microfluidic. יתר על כן, המיקום שלהם הוא קבוע, זהה עבור כל התקן.
היעדר נזילות במכשיר ניתן לבדוק עם אותו הליך כאמור במקום אחר13 קרי, מאכילים את המכשיר עם פתרון של fluorescein במים מיוננים.
שלבים קריטיים בפרוטוקול
במהלך ייצור של המחצית עם דוגמה של המכשיר, מיקום התבנית PDMS על גבי חלון2 CaF צריך בזהירות להתבצע. המבנים היחידים על העובש אשר מותר לפנות את החלון הן בליטות גבוהה 10 מיקרומטר. כאשר ישנו אזור קשר לא רצויים, צריך להיות משופץ השלב השמה עובש. כדי להמחיש, איור 9 מציג המיקום זהיר של העובש על החלון, בעוד איור 9ב' מוצגת דוגמה של מיקום המסכן, איפה שטח בלתי רצויות של העובש בקשר עם החלון. איור 9 b תגרום במבנה נועה חסרים על החלון. הצלחת קוורץ קטן שצוין בפרוטוקול (שלב 4.1.3, איור 2c) מסייעת המיקום עובש כפי היא מונעת האזור לא רצויים של העובש בקלות במגע עם חלון2 האפריקאית. צלחת קוורץ והן PDMS עובש דקים גם כך הם מספיק קל ושקוף ל UV17,18.
למצוא את המינון הנכון של חשיפה UV על הרבדים חצי חיוני גם בתהליך ייצור. כאשר נועה חשוף עם המינון לא מספיק, נועה משומרים הזרמת במהלך הפילינג, גורם לאובדן של הגדרה של המבנה, ואולי על גדותיו על גבי המשטח2 האפריקאית. לעומת זאת, גבוה מדי תוצאות מינון החשיפה בריפוי יתר של נועה, מפנה נועה למצב שאינו דביק. מליטה עוקבות של שני החצאים יסבול בגלל נועה שאינו דביק על השכבה חצי בדוגמת. לא ייצרו קשר לחלון2 CaF ברובד חצי שטוח. באופן אידיאלי, במינון נכון צריך להיות החשיפה הקצרהמינון המאפשר נועה לשכפל את המבנה באופן אמין תוך שמירה על מצבו דביק. מלבד קביעת המינון הנכון חשיפה, מליטה שתי מחציות צריך להיעשות בהקדם האפשרי, בתוך 30 דקות, כמו הדביקות של נועה פוחתת בהדרגה עם הזמן עד זה כבר לא אפשרי עבור מליטה.
נקודות אחרות לציין בעת באמצעות מערכת מכבשי וואקום עבור מליטה. הרבדים תאימות (קרי, גליונות PDMS דק sandwiching המכשיר) צריך להיות עובי אחיד יחסית להפצה לחץ אחיד על המכשיר. למטרה זו, ג'יג אקריליק בהזמנה אישית עם עובי מרווח המוגדר שימש להטיל גליונות PDMS כזה. הסדינים תאימות גם צריך להיות נקי כדי להימנע מהחדרה לחץ מקומי, במיוחד על החלון2 CaF שביר.
יתרונות השיטה לעומת שיטות קיימות
הגישה שלנו ייצור הפגינו את הייצור של התקן פלסטיק תואמת ל- FTIR מדידות. מכיוון הטכניקה מיקרו-ייצור מספקת שליטה טובה על המימד של התכונה, הפקד השגה מעל הגובה של הערוצים microfluidic הוא הרבה יותר מדויק מאשר מה ניתן להשיג עם גישות ייצור אחרות (למשל, מפרידי פלסטיק).
יתרון מכריע של פרוטוקול זה הוא כי התוצאה היא התקן פלסטיק עם תצוגה שקוף UV-Vis-IR-יציאות; כל ההתקנים microfluidic הפגינו בעבר עבור FTIR יוצרו על ראש גדול IR שקוף מצע, הדורשים ליתוגרפיה שלבים עבור כל התקן10,11,12. בגישה הנוכחית, העלות והמורכבות של הזיוף מצטמצם מאז רק בייצור כייר סי דורש ליתוגרפיה.
לבסוף, בעזרת אולטרה לריפוי שרף (NOA73 בהפגנה הזו) כמו פלסטיק הגוף העיקרי מקלה על הקישוריות של המכשיר למערכת משלוח חיצוני נוזלי, על-ידי הדבקה או צירוף החיבורים לגוף פלסטיק או באמצעות ג'יג fluidic עבור מהירה יותר ייצור ההתקן או שימוש.
יישומים עתידיים של השיטה
שיפורים אפשריים, פיתוח ניתן לסייר, שניים הם הכי מיידי, חשוב. ראשית, שקיפות אופטית בפס רחב הנוף-היציאה מרמז על זיווג FTIR עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה זריחה על פלטפורמה זהה. זה יכול להיות בקלות נרדף על ידי הפחתת עובי אחד החלונות2 CaF כדי להיענות לדרישות של מרחק לעבוד עם מפתח נומרי גבוהה ויעדים בהגדלה. שנית, ערכה פבריקציה נוספת זו תוכל לאפשר עבור פריסות מורכבות יותר fluidic. ניתן ליישם מרובים תצפית צ'יימברס ואלמנטים פונקציונליים חיבורם מערבבים ו הממיינים, כל עוד את הגיאומטריה שלהם מגדירה חללים פתוחים מתחת לחלונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית MBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical | |||
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS | |
| Norland Optical Adhesive 73 | Norland Products Inc. | 7304 | |
| SU8 3010 photoresist | MicroChem | Y311060 | |
| SU8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| Material | |||
| Silicon wafer, 4 inch, prime grade | Bonda Technology Pte Ltd | ||
| CaF2 IR-grade windows | Crystran, UK | CAFP10-1 | 10 mm diameter, 1 mm thickness |
| Acrylic templates | Custom made | ||
| Equipment | |||
| UV-KUB 2 (UV LED exposure system) | KLOE | Emission spectrum 365nm ± 5nm | |
| Newport UV lamp | Newport | Model 66902 | 50-500 Watt Hg arc lamp |
| CEE Spin coater | Brewer Science | Model 200x | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | ||
| Precision digital hot plate | Harry Gestigkeit GmbH | 2860SR | |
| Plasma Surface Technology | Diener Electronic GmbH + Co. KG | For O2 plasma treatment | |
| IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump | Agilent Technologies | ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar | |
| Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer | Bruker |
References
- Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
- Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
- Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
- Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
- Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
- Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
- Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
- Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
- Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
- Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
- Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
- Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
- Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
- Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
- Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
- Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).
