Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Zachte lithografische Procedure voor de productie van kunststof Microfluidic apparaten met weergave-poorten transparant voor zichtbaar en infrarood licht

Published: August 17, 2017 doi: 10.3791/55884
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Mechanobiology Institute (MBI), National University of Singapore

Summary

Een protocol voor de fabrikatie van kunststof microfluidic apparaten met transparante weergave-poorten voor zichtbaar en infrarood licht beeldvorming wordt beschreven.

Abstract

Infrarood (IR) spectro-microscopie van levende biologische monsters wordt belemmerd door de absorptie van water in het midden-IR-bereik en door het ontbreken van geschikte microfluidic apparaten. Hier, een protocol voor de fabrikatie van kunststof microfluidic apparaten wordt aangetoond, waar zachte lithografische technieken zijn gebruikt om te sluiten van transparante calciumfluoride (CaF2) weergave-poorten in verband met de observatie kamer (s). De methode is gebaseerd op een replica gieten aanpak, waar een Polydimethylsiloxaan (PDMS) mal is geproduceerd door middel van lithografische standaardprocedures en vervolgens gebruikt als sjabloon voor de productie van een kunststof apparaat. Het kunststof apparaat beschikt over ultraviolet/zichtbaar/infrarood (UV/Vis/IR) - transparante vensters van CaF,2 te voorzien van directe observatie met zichtbaar gemaakt en IR licht. De voordelen van de voorgestelde methode omvatten: een verminderde behoefte aan toegang tot een cleanroom micro-fabricage faciliteit, meerdere weergave-poorten, een gemakkelijke en veelzijdige verbinding met een externe pompsysteem via de plastic lichaam, flexibiliteit van het ontwerp, bv , open/gesloten kanalen configuratie, en de mogelijkheid geavanceerde functies zoals nanoporeuze membranen toe te voegen.

Introduction

Fourier Transform Infrared Spectro-microscopie (FTIR) is uitgebreid gebruikt als een etiket-vrije en niet-invasieve beeldvormende techniek gedetailleerde chemische informatie van een monster te verstrekken. Hierdoor is de winning van biochemische informatie te bestuderen van de chemie van biologische monsters, met een minimum bedrag van voorbereiding omdat het absorptiespectrum van het specimen de intrinsieke vingerafdrukken van haar chemische samenstelling1 draagt , 2. onlangs, FTIR is steeds meer toegepast op de studie van de levende biologische monsters, bijvoorbeeld, cellen3. Water, dat het medium voor de levende cellen in de meeste gevallen is, blijkt echter een sterke absorptie in de regio Midden-IR. Zelfs als een dunne laag, kan haar aanwezigheid volledig overweldigen de belangrijke structurele informatie van de specimens.

Jarenlang, was de gemeenschappelijke benadering vaststelling of drogen van de monsters om volledig uitsluiten het water absorptie signaal in het spectrum. Echter, deze aanpak staat geen voor real-time metingen op levende cellen, die is van essentieel belang om te bestuderen van de verandering van hun chemische samenstelling en cellulaire processen met de tijd. Een manier voor het verkrijgen van betrouwbare absorptiespectra van levende biologische monsters, is het beperken van de totale optische weglengte in het medium van de IR-straal tot minder dan 10 µm4.

Een gevestigde aanpak in levende cel experimenten geweest tot nu toe verzwakte totale reflectie (ATR)-FTIR imaging, waardoor metingen onafhankelijk van de dikte van het monster, waardoor cellen worden volgehouden in een dikkere laag van waterig medium. Metingen van de monsters wordt echter van het oppervlak van de ATR kristal5de kleine diepte van de penetratie van de vluchtig Golf beperkt tot alleen de eerste paar microns.

U kunt ook de water absorptie beperking heeft omzeild met de opkomst van verschillende systemen van de microfluidic, die zijn over het algemeen ingedeeld in twee grote groepen: open kanaal (waar één van de vloeistof oppervlakken wordt blootgesteld aan de atmosfeer) en gesloten kanaal (waar twee IR-transparante vensters worden gescheiden door een spacer met een gedefinieerde dikte).

Loutherback et al. ontwikkelde een open-kanaal membraan-apparaat waarmee lange termijn IR continumetingen van levende cellen voor maximaal 7 dagen-6. De methode vereist hoge luchtvochtigheid in de omgeving om te voorkomen dat de verdamping van het medium van het celoppervlak. Het systeem werkt het best met cellen die natuurlijk bij air-liquide interfaces, zoals epitheliale weefsels van de huid, longen, en ogen of microbiële biofilms7 groeien.

Een gesloten-kanaal configuratie beoogt te creëren van een uniform, dunne laag tussen twee parallelle IR-transparante vensters, waar cellen worden bijgehouden in hun waterige media. De dikte van deze holte is zodanig dat het water absorptie signaal hieronder verzadiging is. Water achtergrond kan vervolgens worden afgetrokken om te verkrijgen van de juiste monster spectra. Allermeest naar de gesloten-kanaal methoden maken gebruik van een plastic spacer scheiden van de twee vensters te vormen van een afneembare vloeibare kamer3,8,9. Een voordeel van deze methode is dat het niet nodig microfabrication; structuren die meer complex dan een meetkamer met in - en uitgaand - let kanalen zijn echter moeilijk te realiseren in de dunne spacer. Er is ook een probleem met de reproduceerbaarheid van de weglengte tussen IR metingen als gevolg van de afhankelijkheid van de mechanische klemmen. Met het oog op een meer nauwkeurige controle van de afstand voor een meer betrouwbare spectrum verwerving, optische lithografie methoden doorgevoerd naar patroon fotoresist bovenop het IR-substraat te definiëren van de spacer9,10 , 11 , 12. Hoewel dit het mogelijk voor meer complexe structuren worden gedefinieerd in de spacer maakt, de methode vereist toegang tot een microfabrication faciliteit voor de productie van het patroon op elke ondergrond.

In deze paper presenteren wij een eenvoudige productie-techniek van een IR-compatibele microfluidic apparaat, met als doel om de productie kosten en de eis van de toegang tot een microfabrication faciliteit. De methode hier gepresenteerd (Zie Figuur 1) gebruikt een gevestigde proces dat bekend staat als zachte lithografie. In dit geval zijn twee mallen vereist. De primaire mal bestaat uit een 4-inch silicium wafer met behulp van een standaard UV lithografie proces. De secundaire schimmel is de replica gemaakt van PDMS, die heeft een omgekeerde polariteit van het patroon in de primaire mal van silicium en fungeert als de meester mal voor latere apparaat fabricage.

Het apparaat heeft twee afzonderlijke lagen: een eerste laag met de lay-out voor een microfluidic (die in de voorgelegde geval bestaat uit het microfluidic-kanaal en in-laat/out-let een kamer observatie met een viewport CaF2 ), en een tweede laag met een vlakke ondergrond () die bestaat uit alleen een CaF2 viewport).

Hier is een UV-uithardende optische lijm, Norland optische lijm 73 (NOA73, afgekort als NOA voortaan), gebruikt om te vormen de belangrijkste kunststof behuizing van het apparaat. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van deze optische lijm: lage productie kosten, gemak van connectiviteit met externe systemen, goede optische transparantie, lage viscositeit en bovenal biocompatibiliteit13. CaF2 is een geschikte keuze als de viewport als gevolg van de biocompatibiliteit en een uitstekende IR-transparantie14.

Met deze nieuwe aanpak is toegang tot een microfabrication faciliteit strikt alleen vereist voor de fabricage van de primaire schimmel. Latere fabricage processen voor het kunststof microfluidic-apparaat kunnen worden uitgevoerd in een laboratorium dat uitgerust met een UV-verlichting-bron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding van silicium primaire schimmel

Opmerking: een photomask is vereist voor de voorbereiding van de primaire schimmel. De photomask kan worden gekocht van onafhankelijke leveranciers of in-house vervaardigd door middel van standaard optische masker fabricage procedures. Een photomask met lichte veld polariteit wordt gebruikt in dit geval ( Figuur 2 een).

  1. Patroon definitie
    1. Spin jas een 4 inch silicium wafer met SU-8 3010 negatieve fotoresist op 2,300 tpm voor 30 s.
    2. Soft-bak de fotoresist op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 2 min en vervolgens bij 95 ° C gedurende 8 minuten
    3. Bloot de fotoresist aan UV-licht (i-lijn, 365 nm) via de photomask onder het masker aligner voor een totale energie dosis van 100-120 mJ/cm 2; de hard contact modus heeft de voorkeur om een betere resolutie.
    4. Verwijderen van de wafer en toepassen van een post blootstelling bak bij 65 ° C gedurende 1 min en vervolgens bij 95 ° C gedurende 2 minuten
    5. Ontwikkelen de fotoresist met behulp van een SU-8 ontwikkelaar bij kamertemperatuur, dan spoel met isopropyl alcohol, en zachtjes blazen droog met stikstof; de dikte gemeten patroon moet 10 µm en hieronder. Zie Figuur 2, b voor het beeld van de werkelijke siliconen mal.
  2. Silanization van silicium schimmel
    1. behandelen de siliconen mal met zuurstof plasma op 60 W voor 30 s met 20 sccm van zuurstof stroom. De kamer druk ingesteld op 1-10 mbar tijdens de.
    2. Plaats van de schimmel in een vacuüm pot met 50 µL van silane en laat de pot in de vacuümtoestand (1-10 mbar) voor ten minste 2 h.
      Opmerking: Het silanization-proces maakt een hydrophobic oppervlakte coating waardoor PDMS vastplakken aan de schimmel 15. Opmerking dat het primaire schimmel ook kan worden vervaardigd met behulp van een alternatieve methode, waarbij droge ETS van het silicium. In dit geval de photomask zullen van tegenovergestelde polariteit (donkere gebied), en de definitie van de patroon in stap 1.1 zal gebruik maken van een positieve fotoresist.

2. Voorbereiding van PDMS secundaire schimmel

  1. PDMS mengen
    1. Meng de PDMS elastomeer en genezen agent, 10:1; het totale bedrag is zodanig dat de resulterende PDMS dikte ongeveer 1 tot 1,5 mm is.
    2. Na homogenisatie van het mengsel, ontgas het mengsel door het verlaten van het in een vacuüm pot in de vacuümtoestand (1-10 mbar) gedurende ongeveer 15 minuten of zolang er niet geen zichtbare bellen zijn; dit is het verwijderen van eventuele ingesloten lucht in het mengsel.
  2. Schimmel replicatie
    1. giet het PDMS mengsel op de siliconen mal vervaardigd in stap 1 en ontgas het mengsel te verwijderen van elk ingesloten lucht met dezelfde instellingen als in stap 2.1.2. Warmte bij 70 ° C gedurende 2 uur op een hete plaat om te genezen van het mengsel.
    2. Verwijder de uitgeharde PDMS uit de hete plaat en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Met een scheermesje, snijden de PDMS langs de randen van de mal silicon.
    3. Met een pincet, knijp een hoek van de snede PDMS en zorgvuldig schil de PDMS replica uit de siliconen mal; het resulterende patroon van de microfluidic op deze secundaire mal is een uitsteeksel, oftewel de tegenovergestelde polariteit van de primaire schimmel ( Figuur 2 c).
  3. Silanization van de PDMS replica (hetzelfde als in stap 1.2)
    1. behandelen de PDMS schimmel met zuurstof plasma op 60 W voor 30 s met 20 sccm van zuurstof stroom. De kamer druk ingesteld op 1-10 mbar tijdens de.
    2. Plaats de schimmel in een vacuüm jar met 50 µL van silane en laat de pot in de vacuümtoestand (1-10 mbar) gedurende ten minste 2 h.

3. Voorbereiding van PDMS sjablonen

Opmerking: op de standaardisering van de vorm en grootte van de uiteindelijke apparaten en te vergemakkelijken van de uitlijning van de hoofdlijnen in de twee helften, twee aparte PDMS sjablonen werden gebruikt, richtsnoeren vaststellen waarin de geometrie van het apparaat, de plaatsing van het transparante venster en de in - en uitgaand - let verbindingen. De eerste PDMS sjabloon helpt de fabricage van de patroon helft van het apparaat, terwijl de tweede helpt te verlichten de fabricage van de platte helft van het apparaat.

  1. De ontwerpsjablonen met behulp van een computer aided design (CAD) software. Figuur 3 een toont de lay-out en de afmetingen van de sjabloon naar het fabriceren van de patroon helft van het apparaat. Om de platte helft van het apparaat, de 1.5 mm diameter gaatjes te verwijderen uit het ontwerp.
  2. Verwerven de sjablonen van een externe provider of via een interne mechanische werkplaats, indien beschikbaar.
    Opmerking: Acryl werd gebruikt als de sjabloon materiaal als gevolg van fabricage gebruiksgemak en lage kosten haalbaar in een standaard workshop. Er zijn alternatieven, zoals 3D printen.
  3. Meng de PDMS elastomeer en genezen agent 10:1; Zorg ervoor dat een voldoende hoeveelheid PDMS te volledig dompelen de sjablonen bereiden.
  4. Na homogenisatie van het mengsel, ontgas het mengsel door het verlaten van het in een vacuüm pot in de vacuümtoestand (1-10 mbar) gedurende ongeveer 15 minuten of zolang er geen zichtbare bellen (indien dit wordt verderop) niet zijn; dit is het verwijderen van eventuele ingesloten lucht in het mengsel.
  5. Giet het PDMS mengsel op de acryl sjablonen tot hun bovenste oppervlak is ongeveer 1 mm onder het vloeistofoppervlak ondergedompeld. Ontgas het PDMS weer te verwijderen van elk ingesloten lucht met dezelfde instellingen als in 3.4. Verwarm dit bij 60 ° C gedurende 2 uur op een geëgaliseerd verwarmingsplaat om te genezen van het mengsel.
  6. Verwijder de uitgeharde PDMS uit de hete plaat en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Met een scheermesje, snijden de PDMS langs de randen van de acryl sjablonen.
  7. Met een pincet, een hoek van de snede PDMS knijpen en zorgvuldig schil de PDMS uit de acryl sjablonen.
    Opmerking: Figuur 3 b toont de lay-out en de afmetingen van de replica van de PDMS gebruikt voor het fabriceren van de patroon helft van het apparaat.
  8. Voor te bereiden de tweede replica van het PDMS fabriceren van de flat de helft van het apparaat door herhaalt u stap 3.3 tot en met 3.7 maar met behulp van de acryl sjabloon zonder de gaten van de diameter van 1.5 mm.

4. Microfluidic apparaat fabricage

  1. fabricage van de patroon helft van het apparaat (dat wil zeggen, met de indeling van het apparaat)
    1. traktatie het CaF 2 venster met zuurstof plasma op 60 W voor 30 s met 20 sccm van zuurstof stroom. Dit wordt gedaan om verbetering van de informatiestroom van NOA tijdens de volgende fabricage.
      Opmerking: Deze stap is niet verplicht.
    2. Plaats zorgvuldig de eerste PDMS sjabloon (één met de 1.5 mm diameter pijlers) op een vlakke ondergrond, bijvoorbeeld, een ademkalk plaat ( Figuur 4 een). Plaats een CaF 2 venster gecentreerd bovenop de PDMS stekker en druk zachtjes op het venster zodanig dat het in goed contact met de stekker ( Figuur 4 b).
    3. Nemen de PDMS mal gemaakt in stap 2 en plaats een dunne UV-transparante plaat (in dit geval, een kwarts plaat, 500 µm dik en 1,5 cm x 1.5 cm groot) op de achterkant van de schimmel, afgestemd op de locatie van de centrale kamer ( Figuur 4 c). Zorg ervoor dat de plaat kwarts in goed contact met de PDMS mal is.
      Opmerking: The kwarts plaat voorkomt dat ongewenste inzake de mal gemakkelijk komen in contact met het CaF 2 venster.
    4. Voorzichtig plaats deze PDMS schimmel gezicht naar beneden richting het CaF 2 venster met de fluidic kamer uitgelijnd op het midden van de CaF 2 venster. Zorg ervoor dat alle elementen (sjabloon-, schimmel- en venster) in goed contact zijn en uitgelijnd ( Figuur 4 c-4 d).
    5. Geleidelijk afzien van NOA druppels op de in-laat van de PDMS sjabloon en laat het langzaam vullen van de spouw. Zodra de hars in contact met de rand van het venster komt, de capillaire stroom zal de leemte dunne (~ 10 µm) tussen de PDMS schimmel en CaF 2 venster ( Figuur 4 e-4f).
    6. Nadat de spouw volledig is gevuld, genezen de NOA door blootstelling aan UV-licht (bijvoorbeeld met een UV-LED blootstelling systeem, Figuur 4 g).
      Opmerking: De belichtingstijd kan variëren dienovereenkomstig met de energie van de UV-bron. Het UV-LED blootstelling systeem, waarmee een vermogensdichtheid van 24 mW/cm 2, vereist ongeveer 90 s op 100% vermogen en voortdurende blootstelling modus.
    7. Verwijder voorzichtig de dunne kwarts plaat vanaf de achterkant van de schimmel PDMS en vervolgens schil voorzichtig de mal PDMS vanaf de bovenkant van de NOA-laag ( Figuur 4 h). Tot slot, het verwijderen van de NOA laag uit de PDMS-sjabloon ( Figuur 4 ik).
      Opmerking: De resulterende indeling van het apparaat op de uitgeharde NOA hadden de zelfde polariteit van het patroon in de primaire siliconen mal.
  2. Fabricage van de platte helft van het apparaat (dat wil zeggen, zonder apparaat lay-out)
    1. behandelen het CaF 2 venster met zuurstof plasma op 60 W voor 30 s met 20 sccm van zuurstof stroom.
      Opmerking: Deze stap is niet verplicht.
    2. Plaats zorgvuldig de tweede sjabloon voor PDMS (een zonder de pijlers van 1,5 mm diameter) op een vlakke ondergrond, bijvoorbeeld, een ademkalk plate. Plaats een CaF 2 venster gecentreerd bovenop de PDMS stekker en druk zachtjes op het venster zodanig dat het in goed contact met de stekker.
    3. Plaats een 1 mm dikke PDMS blad met 5 x 3,5 cm grootte op de top van de CaF 2 in het venster met het PDMS blad uitgelijnd met het middelpunt van de PDMS sjabloon. Zorg ervoor dat het PDMS blad in goed contact met de raam.
    4. Geleidelijk afzien van NOA druppels op de in-laat van de PDMS sjabloon en laat het langzaam vullen van de spouw.
    5. Nadat de spouw volledig is gevuld, genezen de NOA door blootstelling aan UV-licht (bijvoorbeeld met een UV-LED blootstelling systeem).
      Opmerking: De belichtingstijd kan variëren dienovereenkomstig met de UV-energiebron. Met de UV-LED blootstelling systeem, waarmee een vermogensdichtheid van 24 mW/cm 2, vereist dit ongeveer 50 s op 100% vermogen en voortdurende blootstelling modus.
    6. Peel off van het PDMS blad vanaf de bovenkant van de NOA-laag en verwijder voorzichtig de uitgeharde laag NOA uit de sjabloon PDMS.
  3. Verlijmen van de twee helften van het apparaat
    1. Uitlijnen van de twee helften van het apparaat zodanig dat beide CaF 2 Vensters worden uitgelijnd. Zachtjes vinger-druk op beide helften op de hoek van de NOA lagen zodanig dat de positie van de twee helften worden opgelost.
    2. Knippen van twee ronde schijven uit een 1 mm dikke PDMS blad met behulp van een 8 mm diameter perforatie ( Figuur 5 een).
    3. Knip twee rechthoeken met dezelfde grootte van het apparaat (4 cm x 2,5 cm) van een 1 mm dikke PDMS blad. Op beide PDMS rechthoeken, gesneden openingen die overeenkomt met de kanalen en de in-laat/uitgaand-let van het apparaat.
      Opmerking: De voorgesneden openingen in de PDMS rechthoeken zijn bedoeld om te verhinderen dat de kanalen instort tijdens dringende.
    4. Stack in de volgende volgorde vanaf de onderkant: één PDMS rechthoek met voorgesneden openingen, één PDMS disc (in contact met het bodemvenster, gesneden in stap 4.3.2), de twee vinger geperste helften van het apparaat, de tweede PDMS schijf (zittend op het bovenste venster), en tot slot de tweede PDMS rechthoek met voorgesneden openingen ( Figuur 5 b).
    5. Plaats van deze vergadering in de vacuüm druk op setup, zodanig dat het wordt ingeklemd tussen 2 platen en verzegel de plastic zak ( Figuur 5 c). Zet de vacuümpomp en evacueren van de vergadering. Laat de vacuümpomp bereiken de basis druk of het vacuüm voor ten minste 10 min. van toepassing
      Opmerking: De basis druk bereikt hangt af van de vacuümpomp gebruikt en de kwaliteit voor het verzegelen van de kunststofzak.
    6. De geëvacueerd vergadering UV-met een breed-band Hg gas lamp 270 W voor 15 min. Turn off the vacuümpomp en laat de vergadering langzaam aan de atmosferische druk vent voor het verwijderen van het laatste apparaat van de vergadering bloot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 6 presenteert de spectra doorlating van een gloednieuwe CaF2 in het venster de patroon helft van het apparaat, en de complete inrichting. Alle drie spectra vertonen uitstekende transparantie tot mid IR met doorlating groter zijn dan 80%. Het interferentiepatroon zichtbaar in het spectrum van het volledige apparaat (gele kromme in de afbeelding) wordt veroorzaakt door de luchtopening in het bereik van 9-10 µm tussen de twee vensters. Deze spectra aantonen dat de hier gepresenteerde benadering van fabricage niets aan de transparantie van CaF,2 in de mid-range van IR verandert.

Figuur 7 een ziet u een voorbeeld van goede replicatie in NOA van de PDMS secundaire schimmel met de microfluidic lay-out. De structuur op de top van het CaF2 venster is goed gevormd vanwege de schone peeling van de NOA-laag van de mal PDMS nadat het is gedeeltelijk UV-genezen. Geen NOA moet blijven op de mal of op het oppervlak van de venster in contact met de schimmel uitsteeksels. Elke NOA vast aan de mal vertaalt ontbrekende NOA structuur op het venster, dat lekken tijdens stroom experimenten van het laatste apparaat zou veroorzaken. Bovendien, om te bereiken goede afdichting van de twee helften, moet NOA nog plakkerige na UV blootstelling van de halve lagen. NOA is te genezen, als het niet-plakkerige. De dosis van de blootstelling moet worden geoptimaliseerd om het bereiken van dit resultaat.

Figuur 7 b toont daarentegen mislukte replicatie in NOA waar het patroon op het CaF2 venster is niet goed gedefinieerd. Het wordt meestal veroorzaakt door onvoldoende UV blootstelling dosis, dat wil zeggen, onder-genezen van NOA. In dergelijke gevallen is NOA nog steeds enigszins NAT, waardoor sommigen van het vast te houden aan de PDMS schimmel. Als NOA nog steeds aan PDMS schimmel, vasthoudt hoewel de juiste belichting dosis heeft gekregen, dit kan echter een symptoom van silane coating (d.w.z., anti-stick laag) worden aangetast na verloop van tijd. Zoals PDMS een zachte schimmel is, is het niet zo langdurig als de primaire mal van silicium. Het moet worden vervangen na een aantal toepassingen.

Figure 1
Figuur 1: Productie-procédé van de plastic microfluidic-apparaten: (a-e) Schematische voorstelling van het fabricageproces. (f) beeld van een werkelijke apparaat en schematische voorstelling van de dwarsdoorsnede. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Overzicht van de photomask, silicium primaire schimmel en secundaire schimmel PDMS gerepliceerd van de siliconen mal: (een) Photomask met heldere veld polariteit (links boven); Lay-out van het patroon in de photomask (rechts) bestaande uit: in-let en uitgaande laat met 2 mm diameter (1 en 2) en de afstand van 3 cm tussen hen, kanalen met een breedte van 300 µm (3), twee kamers met 5,5 mm x 0,75 mm grootte (4), centrale kamer met 5 x 2,5 mm grootte (verwijst naar 5), diffractie roosters als een visuele ondersteuning met lijnen 10 µm breed en 20 µm gap (6); Zoom-in lay-out van de centrale kamer toont het diffractie raspen (linksonder). (b) foto van de primaire mal van silicium met het patroon dat gedefinieerd is in de SU-8 fotoresist. (c) foto van de mal PDMS secundaire met omgekeerde polariteit ten opzichte van de primaire schimmel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: De hulpmiddelen templating bereid te verlichten van de fabricage van het apparaat: (een) acryl sjabloon: werkelijke sjabloon (boven) en de schematische weergave van transversale (onder). (b) PDMS replica van de acryl sjabloon: werkelijke replica (boven) en de schematische weergave van transversale (onder). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Procesuitvoering voor de fabrikatie van de patroon helft van het apparaat: (een) plaats het PDMS sjabloon op een vlakke ondergrond. Hier, we gebruikten sodakalkglas. (b) gecentreerd CaF2 wordt geplaatst op de top van de PDMS stekker. (c-d) PDMS schimmel is geplaatst gezicht naar beneden richting de CaF-2 met de fluidic kamer uitgelijnd op het midden van het venster. Ervoor zorgen dat alle elementen in goed contact en uitgelijnd. (e-f) Gieten van NOA via de in-laat en het te langzaam vullen van de spouw. (g) NOA is genezen door het onder UV-licht bloot te leggen. Blootstelling dosis kan variëren afhankelijk van de energie van de UV-bron gebruikt. (h) zorgvuldig schil de PDMS schimmel en de sjabloon om de uitgeharde NOA vrij te geven. (ik) voltooid apparaat laag met microfluidic structuren in NOA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Vacuüm druk op setup voor het indrukken van de twee helften van het apparaat om te vormen van een complete inrichting: (een) PDMS cirkelvormige schijf (8 mm doorsnede) en PDMS rechthoek (4 x 2.5 cm) met voorgesneden openingen. Beide worden gesneden uit een 1 mm dikke PDMS blad. (b) overzicht van de laag-stack voor u op. (c) overzicht van de vacuüm pers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Mid-IR t ransmittance spectra van een kale CaF 2 venster (rood), een patroon van de helft van het apparaat (blauw), en een complete inrichting (geel). Alle drie spectra exposeren uitstekende transparantie tot mid IR met doorlating groter dan 80% Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Patroon van de helft van het apparaat: (een) voorbeeld van een goed ontwikkelde microfluidic structuur in NOA. Donkere gebied in het venster ziet u een goed gedefinieerde structuur, tonen duidelijk de centrale kamer, twee referentie kamers en de kanalen. (b) voorbeeld van een slecht gevormde microfluidic structuur in NOA toe te schrijven aan de undercuring. Er is opnieuw plaatsen van NOA zoals aangegeven door de rode pijlen. Een van de kamers van de verwijzing ontbreekt ook (groene pijl). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 : Microfluidic mal de verzonnen apparaat verbinden met externe fluidic circuits. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: Plaatsing van PDMS schimmel tijdens de fabricage van de patroon helft van het apparaat: (een) voorbeeld van goede plaatsing van de PDMS schimmel op het CaF2 venster. Het venster is alleen het uitsteeksel op het PDMS mal, tonen duidelijk de centrale kamer, twee referentie kamers en de kanalen (aangegeven door het donkere gebied). De diffractie roosters rondom het apparaat en in het midden van de centrale kamer zijn bedoeld voor een visuele gids tijdens de plaatsing van de PDMS schimmel. (b) voorbeeld van een slechte plaatsing van de PDMS schimmel op het CaF2 venster. Het donkere gebied laat zien dat er ook een ongewenste gebied van de schimmel, die in contact met het venster, zoals aangegeven door de rode pijlen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om te beoordelen en optimaliseren van het protocol van de fabricage, gebruikten we een eenvoudige lay-out voor het patroon van de microfluidic met een grote rechthoekige kamer (5 x 2,5 mm grootte) in het centrum, twee kleine rechthoekige kamers (5,5 x 0,75 mm grootte) gescheiden van de belangrijkste circuit op het bovenste en onderste zijden, en 300 µm breed in-laat/uitgaand-let kanalen. De centrale kamer wordt gebruikt voor het zaaien en observatie van de cellen, terwijl de twee gescheiden kleinere kamers worden gebruikt voor het meten van de achtergrond van de lucht tijdens FTIR experimenten als een referentie-kamer, zoals besproken in een eerdere publicatie13. De in-let en uitgaande laat de centrale kamer verbinden met het externe fluidic systeem.

Hier, worden templating tools (zie protocol stap 3) ingevoerd om te verlichten van het fabricageproces. Voorheen was het moeilijk om de CaF2 ramen op consistente wijze overal precies in het midden van het laatste apparaat, dat problemen veroorzaakt bij het uitlijnen van de twee helften van het apparaat. Het gebruik van de sjabloon geeft een visuele leidraad voor het plaatsen van het venster en zorgt ervoor dat de locatie altijd vergelijkbaar is. Aangezien de geometrische eisen van deze sjablonen niet zeer strenge, kunnen technologieën voor de productie van standaard en goedkoop worden gebruikt. In dit geval, wij deden hen uit acryl kunststof door machinale bewerking in een workshop, maar even levensvatbaar en goedkoop alternatief is 3D printen.

Het ontwerp van de acryl sjablonen is zodanig dat ze beschikken over de volgende (Figuur 3een): (a) één sjabloon is ontworpen met twee kleine gaatjes aan elke kant, terwijl de tweede zonder gaten is; de gaten zijn 1.5 mm diameter in grootte en 1,5 mm in diepte, (b) zowel sjablonen hebben een ronde gat met diameter 8 mm en 500 µm diepte in het midden, en (c) beide sjablonen hebben een rechthoekige uitsteeksel te definiëren, de grootte, vorm en dikte van het halve apparaat; de rechthoek is 4 x 2.5 cm in lengte/breedte en 1.5 mm dikte.

De resulterende PDMS sjablonen gerepliceerd van de acryl templates zal hebben de tegenovergestelde polariteit (Figuur 3b): (a) één sjabloon moet twee pijlers aan elke kant met diameter van 1.5 mm en 1.5 mm hoogte vormen de in-laat en uitgaande laat van de patroon van de helft van het apparaat na NOA gieten; de tweede sjabloon zal worden zonder pijlers, (b) beide sjablonen hebben een 500 µm lang pijler in het midden om te verlichten de plaatsing van de CaF2 ramen; deze functie zal worden verwezen als "PDMS plug", en (c) beide sjablonen zijn met een holte, waarin de uiteindelijke vorm en grootte van elk halfjaar van het apparaat: een rechthoek vorm in dit geval met 4 x 2.5 cm grootte en 1,5 mm dikte.

Verder vermindert het fabricageproces, werden diffractie roosters verwerkt in het ontwerp van de photomask voor de primaire siliconen mal. In de PDMS replica van dit silicium schimmel zijn de ondiepe uitsteeksels (die minder dan 10 µm in hoogte) moeilijk te zien als gevolg van de optische transparantie van PDMS. Echter ondiep uitsteeksels als geregeld in een rooster van 10 µm breed lijnen met een 20 µm kloof genereren een gemakkelijk zichtbare interferentie patroon16. Deze interferentiepatroon werd misbruikt als een visuele gids voor het bepalen van de positie van de microfluidic lay-out in de PDMS schimmel. In het ontwerp van de schimmel is een frame gemaakt van het raspen te definiëren van de algehele geometrie van het apparaat. Een ander raspen is het verder toegevoegd in het midden van de centrale kamer van de microfluidic lay-out uitlijnen met het CaF2 venster om gemakkelijker te maken. Het is vermeldenswaard dat het raspen in de centrale kamer zal niet worden opgenomen in het laatste apparaat als het bestaat uit een reeks van korte holten die niet aan de rand van de centrale kamer zijn aangesloten. Dus, het vloeiende NOA zou niet kundig voor vlaag van deze holtes.

Voor de cel injectie en middellange uitwisseling moet elk apparaat zijn in-let en uitgaande laat handmatig sloeg voor afdichting. Dit resulteerde in het niet-reproduceerbare positionering van de gaten. Dit deed de werking van elk apparaat niet beperken omdat de verbinding werd bereikt door een kleine metalen pin bij één van de openingen te lijmen en ontkoppelen van een kunststof reservoir aan de andere kant als een ophaler. Uiteenlopende standpunten van de gaten dus niet tot bezorgdheid aanleiding gevende behalve ten koste van een meer complexe regeling van de fabricage. Te vereenvoudigen en te standaardiseren het testen en definitieve gebruik van elk apparaat, een op maat gemaakte fluidic mal met vaste in-laat/uitgaand-let locaties is geïntroduceerd (Zie Figuur 8), het verwijderen van de noodzaak om de pin en reservoir te koppelen. Vandaar, in-laat/uitgaand-let gaten met tegenstrijdige standpunten zou presenteren een probleem hier. Door de integratie van twee 1,5 mm diameter gaten in de verzonnen acryl sjabloon (protocol stap 3), die pijlers in de PDMS mal worden zal, wordt de noodzaak om handmatig punch gaten aan de uiteinden van de microfluidic kanalen verwijderd. Bovendien hun positie wordt vastgesteld en hetzelfde geldt voor elk apparaat.

Het ontbreken van lekken in het apparaat kan worden gecontroleerd met de zelfde procedure zoals besproken elders13 dat wil zeggen, door het voeren van het apparaat met een oplossing van fluoresceïne in-geïoniseerd water.

Kritische stappen in het protocol
Tijdens de fabricage van de patroon helft van het apparaat, moet plaatsing van de PDMS schimmel op de top van het CaF2 venster zorgvuldig geschieden. De enige structuren op de mal die mogen contact opnemen met het venster zijn de 10 µm hoge uitsteeksels. Wanneer er een ongewenste contactoppervlak, moet de schimmel plaatsing stap worden overgedaan. Om te illustreren, toont Figuur 9een zorgvuldige plaatsing van de schimmel op het venster, terwijl Figuur 9b een voorbeeld van slechte plaatsing toont, waar een ongewenste gebied van de mal in contact met het venster staat. Figuur 9 b zou resulteren in een ontbrekende NOA structuur op het venster. De plaat van de kleine kwarts vermeld in het protocol (stap 4.1.3, Figuur 2c) helpt de plaatsing van de schimmel als het verhindert ongewenste inzake de schimmel gemakkelijk contact het CaF2 venster komen. Zowel de kwarts plaat en de PDMS schimmel zijn ook dun, zodat ze voldoende licht-gewicht en transparant zijn voor UV17,18.

Het vinden van de juiste UV-blootstelling dosis voor de helft lagen is ook cruciaal voor de productie-procédé. Wanneer NOA is blootgesteld met een onvoldoende dosis, zal de niet-uitgeharde NOA teruglopen tijdens de peeling af, waardoor een verlies van definitie van de structuur en eventueel op het oppervlak van de2 CaF overlopen. Aan de andere kant, te hoog van een blootstelling dosis resulteert in overdreven genezen van de NOA, NOA te veranderen in een niet-plakkerige staat. Latere hechting van de twee helften zou lijden omdat niet-plakkerige NOA op de patroon halve laag zou niet bond naar het venster2 CaF op de vlakke halve laag. Idealiter moet de juiste dosis de kortste blootstellingdosis waarmee NOA om te repliceren de structuur betrouwbaar terwijl nog het handhaven van de plakkerige staat. Naast het bepalen van de juiste belichting dosis, moet lijmen van de twee helften gebeuren zo spoedig mogelijk, binnen 30 min, aangezien de kleverigheid van NOA geleidelijk met de tijd vermindert totdat het is niet langer mogelijk voor hechting.

Andere punten om op te merken zijn bij gebruik van het vacuüm druk systeem voor hechting. De naleving lagen (d.w.z., dunne PDMS platen sodat het apparaat) moeten relatief uniforme dikte voor uniforme drukverdeling op het apparaat. Voor dit doel, was een op maat gemaakte acryl mal met een gedefinieerde spacer dikte gewend gegoten van dergelijke PDMS bladen. De bladen van de conformiteit moet ook schoon om te voorkomen dat de invoering van plaatselijke druk, vooral op het broze CaF2 venster.

Voordelen van de methode in vergelijking met bestaande methoden
Onze fabricage-aanpak aangetoond dat de productie van een kunststof apparaat compatibel met FTIR metingen. Omdat de micro-fabricage techniek goede controle over de dimensie van de functie biedt, is de haalbare controle over de hoogte van de microfluidic kanalen veel nauwkeuriger dan wat kan worden verkregen met andere benaderingen van fabricage (b.v. kunststof afstandhouders).

Een cruciaal voordeel van dit protocol is dat het resulteert in een kunststof apparaat met transparante uitzicht van UV-Vis-IR-poorten; alle eerder bewezen microfluidic apparaten voor FTIR werden geproduceerd bovenop een grote IR transparante substraat, lithografie stappen vereist voor elk apparaat10,-11,12. In de huidige benadering, wordt de kosten en de complexiteit van de fabricage verminderd aangezien alleen de productie van de Si-mal vereist lithografie.

Ten slotte, met behulp van een UV-uithardende hars (NOA73 in deze demonstratie) als de belangrijkste kunststof behuizing de aansluiting van het apparaat naar een externe vloeibare levering systeem, vergemakkelijkt lijmen of de verbindingen aan de plastic lichaam verbonden of met behulp van een fluidic mal voor meer snelle apparaat productie of gebruik.

Toekomstige toepassingen van de methode
Van de mogelijke verbeteringen en ontwikkeling die kan worden onderzocht, zijn twee de meest directe en belangrijk. De breedband optische transparantie van de weergave-poort stelt eerst de koppeling van FTIR met hoge-resolutie fluorescentie microscopie op hetzelfde platform. Dit kan gemakkelijk door het verminderen van de dikte van een van de CaF2 Vensters om te voldoen aan de eisen van een afstand met hoge numerieke diafragma en hoge vergroting doelstellingen worden nagestreefd. Ten tweede, deze regeling fabricage kan zorgen voor meer complexe fluidic lay-outs. Meerdere observatie chambers en functionele onderdelen verbindend hen zoals mixers en sorteerinrichtingen, kunnen zolang hun geometrie definieert de open Holten onder de Vensters worden geïmplementeerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen dankbaar MBI financiële steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% Sigma Aldrich 448931-10G
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Norland Optical Adhesive 73 Norland Products Inc. 7304
SU8 3010 photoresist MicroChem Y311060
SU8 developer MicroChem Y020100
Material
Silicon wafer, 4 inch, prime grade Bonda Technology Pte Ltd
CaF2 IR-grade windows Crystran, UK CAFP10-1 10 mm diameter, 1 mm thickness
Acrylic templates Custom made
Equipment
UV-KUB 2 (UV LED exposure system) KLOE Emission spectrum 365nm ± 5nm
Newport UV lamp Newport Model 66902 50-500 Watt Hg arc lamp
CEE Spin coater Brewer Science Model 200x
MJB4 mask aligner SUSS MicroTec
Precision digital hot plate Harry Gestigkeit GmbH 2860SR
Plasma Surface Technology Diener Electronic GmbH + Co. KG For O2 plasma treatment
IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump Agilent Technologies ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar
Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
  2. Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
  3. Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
  4. Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
  5. Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
  6. Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
  7. Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
  8. Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
  9. Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
  10. Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
  11. Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
  12. Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
  13. Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
  14. Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
  15. Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
  16. Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
  17. Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
  18. Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).

Tags

Zachte Bioengineering kwestie 126 lithografie Fourier Transform Infrared Spectro-microscopie FTIR leven cel imaging spectro-microscopie microfluidic microfabrication.
Zachte lithografische Procedure voor de productie van kunststof Microfluidic apparaten met weergave-poorten transparant voor zichtbaar en infrarood licht
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suryana, M., Shanmugarajah, J. V.,… More

Suryana, M., Shanmugarajah, J. V., Maniam, S. M., Grenci, G. Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light. J. Vis. Exp. (126), e55884, doi:10.3791/55884 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter