Summary
En protokol til fabrikation af plast mikrofluid enheder med gennemsigtig visning-porte til synligt og infrarødt lys imaging er beskrevet.
Abstract
Infrarød (IR) spectro-mikroskopi af levende biologiske prøver er hæmmet af absorption af vand i midten af IR sortiment og af manglen på egnede mikrofluid enheder. Her, en protokol for fabrikation af plast mikrofluid enheder er demonstreret, hvor bløde Litografisk teknikker bruges til at integrere gennemsigtig calciumfluorid (CaF2) Se-havne i forbindelse med observation chamber(s). Metoden er baseret på en replika støbning tilgang, hvor en Polydimethylsiloxan (PDMS) mug er produceret gennem faste Litografisk procedurer og derefter bruges som skabelon til at producere en plast enhed. Den plast indretning egenskaber ultraviolet/synligt/infrarød (UV/Vis/IR) - gennemsigtige vinduer lavet af CaF2 at give mulighed for direkte observation med synlige og IR lys. Fordele ved den foreslåede metode omfatter: et reduceret behov for adgang til en renrums mikro-fabrikation facilitet, flere Se-porte, en let og alsidig tilslutning til en ekstern pumpesystem gennem plastichylster, fleksibilitet af design, f.eks. , åben/lukket kanaler konfiguration, og muligheden for at tilføje avancerede funktioner såsom nanoporous membraner.
Introduction
Fourier Transform infrarød Spectro-mikroskopi (FTIR) er blevet grundigt udnyttet som en etiket-fri og ikke-invasive billeddannelse teknik til at give detaljerede kemiske oplysninger af en stikprøve. Dette gør det muligt for udvinding af biokemiske oplysninger for at studere kemi biologiske prøver, med et minimum af forberedelse da absorptionsspektrum af modellen bærer de iboende fingeraftryk af dets kemiske sammensætning1 , 2. for nylig, FTIR har i stigende grad anvendes til undersøgelse af levende biologiske prøver, f.eks., celler3. Vand, som er medium til levende celler i de fleste tilfælde, viser imidlertid en stærk absorbans i midten af IR-regionen. Selv som et tyndt lag, kan dens tilstedeværelse helt overvælde den vigtige strukturelle oplysninger af modellerne.
I mange år, den fælles tilgang fastsættelse eller tørring prøver at helt udelukke vand absorption signal i spektret. Dog giver denne tilgang ikke mulighed for realtid målinger på levende celler, som er afgørende for at studere ændringen af deres kemiske sammensætning og cellulære processer med tiden. En måde at opnå pålidelige absorptionsspektre fra live biologiske prøver, er at begrænse den samlede lysvej på mellemlang af IR fjernlys til mindre end 10 µm4.
En veletableret tilgang i levende celle forsøg har hidtil været svækket samlede refleksion (ATR)-FTIR imaging, hvilket muliggør målinger uafhængigt af prøven tykkelse, så cellerne til at fastholdes i et tykkere lag af vandigt medium. Men den lille dybde af penetration af de flygtige bølge begrænser målinger af prøver til kun de første par mikron fra overfladen af ATR krystal5.
Alternativt vand absorption begrænsning har omgået med fremkomsten af forskellige mikrofluid systemer, som er generelt klassificeret i to store grupper: åbne kanal (hvor en af de flydende overflader er udsat for atmosfæren) og lukket kanal (hvor to IR-gennemsigtige vinduer er adskilt af en spacer med en defineret tykkelse).
Loutherback et al. udviklet en åben-kanal membran-enhed, der giver mulighed for lange sigt kontinuerlige IR målinger af levende celler for op til 7 dage6. Metoden kræver høj luftfugtighed i miljøet for at forhindre fordampning af medium fra cellens overflade. Systemet fungerer bedst med celler, der naturligt vokser på air-liquid grænseflader, såsom epitelvæv hud, lunge, og øjne eller mikrobiel biofilm7.
En lukket kanal konfiguration sigter på at skabe en ensartet, tynde lag mellem to parallelle IR-gennemsigtige vinduer, hvor celler bevares i deres vandige medier. Tykkelsen af dette hulrum er således, at vand absorption signal under mætning. Derefter trækkes fra vand baggrund for at få de korrekte prøve spektre. De fleste af de lukkede kanal metoder udnytte en plastik spacer adskiller de to vinduer for at danne en aftagelige væskekammer3,8,9. En fordel ved denne metode er, at det ikke kræver microfabrication; strukturer, der er mere kompleks end en proevelokalet med in - og out - let kanaler er imidlertid meget vanskeligt at realisere i den tynde spacer. Der er også et problem med reproducerbarhed af lysvej mellem IR målinger på grund af sin afhængighed af mekanisk fastspænding. For at opnå en mere præcis styring af afstanden til en mere pålidelig spektrum erhvervelse, er optisk litografi metoder blevet gennemført til mønster photoresist oven på IR substrat til at definere spacer9,10 , 11 , 12. selv om det gør det muligt for mere komplekse strukturer vil blive fastlagt i spacer, metoden kræver adgang til en microfabrication facilitet til at producere mønster på hver substrat.
I dette papir præsenterer vi en simpel fabrikation teknik en IR-kompatible mikrofluid enhed, med formålet at reducere fabrikation koste og kravet om at få adgang til et microfabrication anlæg. Metoden, der præsenteres her (Se figur 1) bruger en etableret proces kendt som bløde litografi. To forme er påkrævet i dette tilfælde. Den primære mug er fremstillet af en 4-tommer silicium wafer ved hjælp af en standard UV litografi proces. Den sekundære mug er dens replika af PDMS, som har en omvendt polaritet af mønstret i silicon primære mug og fungerer som den master mold for efterfølgende enhed fabrikation.
Enheden har to separate lag: et første lag med layoutet mikrofluid, (som i sagen fremlagt består af mikrofluid kanalen, i-Lad/out-lade og en observation kammer med en CaF2 viewport), og et andet lag med en flad overflade ( som består af kun en CaF2 viewport).
Her der en UV-helbredes optiske limen, Norland optiske limen 73 (NOA73, forkortet som NOA fremover), bruges til at danne plast hoveddelen af enheden. Der er flere fordele ved at bruge denne optiske limen: lav fabrikation omkostninger, tilslutningsmuligheder til eksterne systemer, god optisk gennemsigtighed, lav viskositet og vigtigst, biokompatibilitet13. CaF2 er et passende valg som viewport på grund af dens biokompatibilitet og fremragende IR-gennemsigtighed14.
Med denne nye tilgang er adgang til et microfabrication anlæg strengt kræves kun for fabrikation af den primære skimmel. Efterfølgende fabrication processer for plast mikrofluid enheden kan foretages i et laboratorium, der er udstyret med en UV-belysning kilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af silicium primære skimmel
NOTE: en photomask er nødvendig for udarbejdelsen af den primære skimmel. Photomask kan være enten købt fra uafhængige udbydere eller opdigtet in-house gennem standard optiske maske fabrikation procedurer. En photomask med lysfelt polaritet er brugt i denne sag ( figur 2 et).
- Mønster definition
- Spin coat en 4 tommer silicium wafer med SU-8 3010 negative photoresist på 2.300 rpm for 30 s.
- Soft-bage photoresist på en varm tallerken på 65 ° C i 2 min og derefter på 95 ° C i 8 min.
- Afsløre photoresist for UV-lys (i-line, 365 nm) gennem photomask under masken aligner for en total energi dosis af 100-120 mJ/cm 2; den hårde kontakt tilstand er foretrukket at opnå en bedre opløsning.
- Fjern wafer og anvende en post eksponering Bages ved 65 ° C i 1 min og derefter på 95 ° C i 2 min.
- Udvikle photoresist ved hjælp af en SU-8 udvikleren ved stuetemperatur, så Skyl med isopropylalkohol, og forsigtigt blæse tør med kvælstof, målte mønster tykkelse skal være 10 µm og derunder. Se figur 2 b for billedet af den faktiske silicium mold.
- Silanisering af silicium skimmel
- behandle silicium mug med ilt plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm af ilt flow. Indstille kammeret pres til 1-10 mbar under processen.
- Placerer formen i et tomrum krukke med 50 µL af silan og forlade krukken i vakuum tilstand (1-10 mbar) for mindst 2 h.
Bemærk: Silanisering proces opretter en hydrofobe overfladebehandling, som forhindrer PDMS klistrer til skimmel 15. Bemærk den primære mold også opdigtede, ved hjælp af en alternativ metode, som indebærer tør ætsning af silicium. I dette tilfælde, photomask vil være af modsatte polaritet (mørke felt), og mønster definitionen i trin 1.1 vil bruge en positiv photoresist.
2. Forberedelse af PDMS sekundære skimmel
- PDMS blande
- Bland PDMS elastomer og hærder, 10:1, det samlede beløb er således, at den resulterende PDMS tykkelse er ca 1-1,5 mm.
- Efter grundig blanding, degas blandingen ved at efterlade det i et tomrum krukke i vakuum tilstand (1-10 mbar) for ca. 15 min. eller indtil der er ingen synlige bobler; dette er at fjerne enhver fanget luft inden blandingen.
- Skimmel replikering
- Pour PDMS blandingen på formen silicium fremstillet i trin 1 og degas blandingen for at fjerne enhver fanget luft med de samme indstillinger som i trin 2.1.2. Varme ved 70 ° C i 2 timer på en varm tallerken hærde blandingen.
- Fjerne den hærdede PDMS fra varmepladen, og lad det køle ned til stuetemperatur. Med et barberblad skæres PDMS langs kanterne af silicium mug.
- Med et par pincet klemme et hjørne af cut PDMS og omhyggeligt skræl PDMS replika off silicium skimmel; den resulterende mikrofluid mønster på denne sekundære mug er et fremspring, som er den modsatte polaritet af primære mug ( figur 2 c).
- silanisering af PDMS replikasættet, (samme som i trin 1.2)
- behandle PDMS mug med ilt plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm af ilt flow. Indstille kammeret pres til 1-10 mbar under processen.
- Sted formen i et tomrum krukke med 50 µL af silan og forlader krukke i vakuum tilstand (1-10 mbar) for mindst 2 h.
3. Forberedelse af PDMS skabeloner
Bemærk: at standardisere form og størrelse de endelige enheder og for at lette tilpasningen af de hovedtræk i to halvdele, to separate PDMS skabeloner blev brugt, som definerer geometrien af enheden, placeringen af det gennemsigtige vindue og i - og out-routing - let forbindelser. Skabelonen første PDMS aids fabrikation af den mønstrede halvdel af enheden, mens de anden hjælper til at lette fabrikation af den flade halvdel af enheden.
- Designe skabeloner ved hjælp af en computer aided design (CAD) programmel. figur 3 en viser lay-out og dimensioner af den skabelon, der bruges til at fabrikere den mønstrede halvdel af enheden. For at fremstille den flade halvdel af enheden, fjerne 1,5 mm diameter huller fra design.
- Erhverve skabeloner fra en ekstern udbyder eller gennem en intern mekanisk værksted, hvis tilgængelig.
Bemærk: Akryl blev brugt som skabelon materiale på grund af lethed af fabrikation og lave omkostninger opnåelige i enhver standard workshop. Der er alternative muligheder, såsom 3D-printning. - Mix PDMS elastomer og hærder 10:1, Sørg for at forberede en tilstrækkelig mængde af PDMS til helt nedsænkes skabelonerne.
- Efter grundig blanding, degas blandingen ved at efterlade det i et tomrum krukke i vakuum tilstand (1-10 mbar) i ca 15 min, eller indtil der er ingen synlige bobler (hvis dette er senere), det er at fjerne enhver fanget luft inden blandingen.
- Hæld PDMS blandingen på akryl-skabeloner, indtil deres øverste overflade er neddykket omkring 1 mm under den væske overflade. Degas PDMS igen for at fjerne enhver fanget luft med de samme indstillinger som i 3.4. Varme dette ved 60 ° C i 2 timer på en fladede varmeplade hærde blandingen.
- Fjerne den hærdede PDMS fra varmepladen, og lad det køle ned til stuetemperatur. Med et barberblad skæres PDMS langs kanterne af akryl skabelonerne.
- Med et par pincet, knivspids ene hjørne af cut PDMS og omhyggeligt skræl PDMS off akryl skabelonerne.
Bemærk: Figur 3 b viser lay-out og dimensioner af PDMS replika bruges til at fabrikere den mønstrede halvdel af enheden. - Forbereder den anden PDMS replika for at fabrikere flat halvdelen af enheden ved at gentage trin 3.3 til 3.7 men ved hjælp af skabelonen akryl uden 1,5 mm diameter huller.
4. Mikrofluid enhed fabrikation
- fabrikation af den mønstrede halvdel af enheden (dvs. med enheden layout)
- behandle CaF 2 vindue med ilt plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm af ilt flow. Dette er gjort for at forbedre strømmen af NOA under den følgende fremstilling.
Bemærk: Dette trin er ikke obligatorisk. - Sted omhyggeligt første PDMS skabelonen (den ene med 1,5 mm diameter søjler) på en flad overflade, fx, en soda-kalk plade ( figur 4 en). Placer en CaF 2 vindue centreret oven på PDMS plug og tryk forsigtigt vinduet, sådan at det er i god kontakt med stik ( fig. 4 b).
- Tage PDMS mug i trin 2 og placere en tynd UV-gennemsigtig plade (i dette tilfælde, en kvarts plade, 500 µm tykt og 1,5 cm x 1,5 cm i størrelse) på bagsiden af mug, justeret med placeringen af det centrale kammer ( figur 4 c). Sørg for, at kvarts plade er i god kontakt med formen PDMS.
Bemærk: The kvarts plade forhindrer de uønskede område af mug i nemt kommer i kontakt med vinduet CaF 2. - Blidt sted denne PDMS skimmel ansigt ned mod CaF 2 vindue med fluidic kammeret, afstemt til centrum af vinduet CaF 2. Sørg for, at alle elementer (skabelon, mug og vinduet) er i god kontakt og justeret ( figur 4 c-4 d).
- Gradvist dispensere dråber af NOA på Lad af skabelonen PDMS og lad det langsomt fylde hulrummet. Når resinen kommer i kontakt med kanten af vinduet, den kapillar flow vil udfylde tynde hullet (~ 10 µm) mellem PDMS mug og CaF 2 vindue ( figur 4 e-4f).
- Efter hulrummet er helt fyldt, helbrede NOA ved eksponering for UV-lys (f.eks. med en UV-LED eksponering system, figur 4 g).
Bemærk: Eksponeringstiden kan variere i overensstemmelse hermed med energi af UV kilden. UV-LED eksponering system, som giver en effekttæthed 24 mW/cm 2, kræver ca. 90 s på 100% strøm og kontinuerlig eksponering tilstand. - Fjern forsigtigt den tynde kvarts plade fra bagsiden af PDMS mold og derefter skræl forsigtigt PDMS mug fra toppen af NOA lag ( figur 4 h). Endelig, fjerne NOA lag fra skabelonen PDMS ( figur 4 jeg).
Bemærk: Den resulterende enhed layout på den hærdede NOA ville have den samme polaritet af mønstret i den primære silicium mold.
- behandle CaF 2 vindue med ilt plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm af ilt flow. Dette er gjort for at forbedre strømmen af NOA under den følgende fremstilling.
- Fabrikation af den flade halvdel af enheden (dvs. uden enhed layout)
- behandle CaF 2 vindue med ilt plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm af ilt flow.
Bemærk: Dette trin er ikke obligatorisk. - Sted omhyggeligt den anden PDMS skabelon (en uden 1,5 mm diameter søjler) på en flad overflade, fx, en soda lime plade. Placer en CaF 2 vindue centreret oven på PDMS plug og tryk forsigtigt vinduet, sådan at det er i god kontakt med stikket.
- Placere en 1 mm tyk PDMS ark med 5 cm x 3,5 cm størrelse på toppen af vinduet CaF 2 med arket PDMS justeret med midten af skabelonen PDMS. Sørg for, at arket PDMS er i god kontakt med vinduet.
- Gradvist dispensere dråber af NOA på Lad af skabelonen PDMS og lad det langsomt fylde hulrummet.
- Efter hulrummet er helt fyldt, helbrede NOA ved eksponering for UV-lys (f.eks. med en UV-LED eksponering system).
Bemærk: Eksponeringstiden kan variere i overensstemmelse hermed med UV energikilde. Med UV-LED eksponering system, som giver en effekttæthed 24 mW/cm 2, dette kræver omkring 50 s på 100% strøm og kontinuerlig eksponering tilstand. - Skræl off PDMS ark fra toppen af laget NOA og forsigtigt fjerne den hærdede NOA lag fra skabelonen PDMS.
- behandle CaF 2 vindue med ilt plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm af ilt flow.
- Limning af de to halvdele af enheden
- Juster de to halvdele af enheden, således at både CaF 2 windows er justeret. Forsigtigt finger-Tryk på begge halvdele på hjørnet af NOA lag således, at placeringen af de to halvdele er faste.
- Skære to cirkulære skiver ud af en 1 mm tyk PDMS ark ved hjælp af en 8 mm diameter puncher ( figur 5 en).
- Klip to rektangler med samme størrelse af enheden (4 cm x 2,5 cm) fra en 1 mm tyk PDMS ark. På begge PDMS rektangler, skære åbninger svarende til kanalerne og i-Lad/out-routing-let enhedens.
Bemærk: Pre-cut åbningerne i PDMS rektangler er beregnet til at forhindre kanalerne fra kollapse under presserende. - Stak i følgende rækkefølge fra bunden: én PDMS rektangel med præ-cut åbninger, én PDMS disk (i kontakt med den nederste vindue, skåret i trin 4.3.2), de to finger-presset halvdele af enheden, den anden PDMS disk (sidder på den øverste rude), og endelig den anden PDMS rektangel med præ-cut åbninger ( figur 5 b).
- Placere denne forsamling i vakuum Tryk på setup, således at det er klemt inde mellem 2 plader og forsegle plasticpose ( figur 5 c). Tænd vakuumpumpen og evakuere forsamlingen. Lad vakuumpumpe nå sin base pres eller anvende vakuum i mindst 10 min.
Bemærk: Base presset opnåede afhænger af vakuum pumpe bruges og kvaliteten af forsegling af plastikposen. - Udsætter den evakuerede forsamling for UV-med en broad-band Hg gaslampe på 270 W til 15 min. Turn off vakuumpumpe og lad forsamlingen langsomt udluftning til atmosfærisk tryk før du fjerner den sidste enhed fra forsamlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 præsenterer transmittans spektre af en splinterny CaF2 vindue, den mønstrede halvdel af enheden, og komplet enhed. Alle tre spectra udstiller fremragende gennemsigtighed til midten af IR med transmittans større end 80%. Interferensmønstret synlige i spektret af hele enheden (gule kurve på figuren) er forårsaget af luftmellemrummet i rækken af 9-10 µm mellem de to vinduer. Disse spectra demonstrere fabrikation tilgang præsenteres her ikke ændrer gennemsigtighed af CaF2 i IR mellemtone.
Figur 7 en viser et eksempel på god replikering i NOA PDMS sekundære skimmelsvamp med mikrofluid lay-out. Struktur på toppen af vinduet CaF2 er udformet på grund af den rene peeling af NOA lag fra PDMS skimmel efter det er delvist UV-helbredes. Ingen NOA bør forblive på formen eller vinduet overflade i kontakt med mug fremspring. Enhver NOA fast til formen giver sig udslag i manglende NOA struktur på vinduet, som ville forårsage lækager under flow eksperimenter af den endelige enhed. Derudover for at opnå god forsegling af to halvdele, bør NOA stadig være tacky efter UV-eksponering af de halve lag. NOA er over helbredt, hvis det er ikke-klæbrig. Eksponering dosis bør optimeres for at nå dette resultat.
Figur 7 b i stedet viser mislykket replikering i NOA hvor mønstret på vinduet CaF2 ikke er ordentligt defineret. Det er for det meste forårsaget af utilstrækkelig UV eksponering dosis, dvs., under hærdning af NOA. I sådanne tilfælde er NOA stadig noget våd, forårsager nogle af det at holde sig til PDMS skimmel. Dog hvis NOA stadig sticks til PDMS skimmel selv om den korrekte eksponering dosis er givet, dette kan være et symptom på silan belægning (dvs., anti-stick lag) bliver nedbrudt over tid. Som PDMS er en blød mug, er det ikke så langvarig som silicium primære skimmel. Det skal udskiftes efter en række anvendelser.
Figur 1: Fabrikationsproces af plast mikrofluid enheder: (a-e) Skematisk af opdigte oparbejde. (f) billede af en faktiske enhed og skematisk af dens tværsnit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over photomask, silicium primære mug og PDMS sekundære skimmel replikeret fra formen silicium: (en) Photomask med lysfelt polaritet (øverst til venstre); Lay-out af mønster i photomask (til højre) består af: i-lade og ud lad med 2 mm diameter (1 og 2) og afstanden på 3 cm mellem dem, kanaler med 300 µm bredde (3), to reference kamre med 5,5 mm x 0,75 mm størrelse (4), centrale kammer med 5 mm x 2,5 mm størrelse ( 5), diffraktion riste som en visuel guide med linjer 10 µm bred og 20 µm gap (6); Zoom-in lay-out af den centrale afdeling viser diffraktion rist (nederst til venstre). (b) billede af silicium primære mug med mønstret defineret i SU-8 photoresist. (c) billede af formen PDMS sekundære med omvendt polaritet med hensyn til de primære skimmel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Templating redskaber parat til at lette enhed fabrikation: (en) akryl skabelon: faktiske skabelon (øverst) og dens skematisk tværsnits oversigt (nederst). (b) PDMS kopi af skabelonen akryl: faktiske replika (øverst) og dens skematisk tværsnits oversigt (nederst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Procesforløb for fabrikation af den mønstrede halvdel af enheden: (en) plads til PDMS skabelon på en flad overflade. Her brugte vi soda-kalk glas. (b) CaF2 placeres centreret oven på PDMS plug. (c-d) PDMS mug er placeret ansigt ned mod CaF2 med fluidic kammeret, afstemt til midten af vinduet. Sikre, at alle elementer er i god kontakt og justeret. (e-f) Støbning af NOA via i-lade og gør det muligt at langsomt fylde hulrummet. (g) NOA er helbredt ved at udsætte det i UV-lys. Eksponering dosis afhænger af energi af UV kilden anvendes. (h) omhyggeligt skræl PDMS mug og skabelon til at frigive den hærdede NOA. (jeg) afsluttet enhed lag med mikrofluid strukturer i NOA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Vakuum Tryk på setup for at trykke på de to halvdele af enheden for at danne en komplet enhed: (en) PDMS cirkulær Skive (8 mm i diameter) og PDMS rektangel (4 x 2,5 cm) med præ-cut åbninger. Begge afskæres fra en 1 mm tyk PDMS ark. (b) oversigt over lagstakken før presning. (c) oversigt over vakuum pressen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Midten af IR t ransmittance spektre af en nøgne CaF 2 vindue (rød), en mønstrede halvdelen af enheden (blå), og en komplet enhed (gul). Alle tre spectra udstiller fremragende gennemsigtighed til midten af IR med transmittans større end 80% Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Mønstret halvdelen af enheden: (en) eksempel på en velformede mikrofluid struktur i NOA. Mørkere område oven på rude viser en veldefineret struktur, viser klart det centrale kammer, to reference kamre og kanaler. (b) eksempel på en dårligt dannet mikrofluid struktur i NOA på grund af undercuring. Der er omløb af NOA, som angives med røde pile. En af reference kamrene også mangler (grøn pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Mikrofluid jig fabrikerede apparatet tilsluttes til eksterne fluidic kredsløb. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Placering af PDMS skimmel under fabrikation af den mønstrede halvdel af enheden: (en) eksempel på god placering af PDMS mug på vinduet CaF2 . Vinduet er i kontakt med kun fremspring på PDMS skimmel, viser klart det centrale kammer, to reference kamre og kanaler (angivet af den mørkere område). Diffraktion riste omkring enheden og midt i det centrale kammer er beregnet til en visuel vejledning under placering af PDMS skimmel. (b) eksempel på en dårlig placering af PDMS mug på vinduet CaF2 . De mørkere område viser, at der også er en uønsket område af mug, som er i kontakt med vinduet, som angivet ved de røde pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at vurdere og optimere fabrikation protokol, brugte vi et simpelt layout for mikrofluid mønster med et stort rektangulært kammer (5 mm x 2,5 mm størrelse) i centrum, to små rektangulære kamre (5,5 mm x 0,75 mm størrelse) adskilt fra de vigtigste kredsløb på den øvre og nedre sider, og 300 µm bredt i-Lad/out-routing-let kanaler. Det centrale kammeret er brugt til seeding og observation af celler, mens de to adskilte mindre kamre bruges til at måle luft baggrund under FTIR eksperimenter som en reference kammer, som omtalt i en tidligere publikation13. I-lade og ud Lad tilsluttes eksterne fluidic systemet den centrale afdeling.
Her introduceres templating værktøjer (se protokollen trin 3) for at lette fabrikationsproces. Tidligere var det vanskeligt at placere konsekvent CaF2 windows præcis på midten af den sidste enhed, som forårsagede problemer, når justering af de to halvdele af enheden. Brug af skabelonen giver en visuel guide til at placere vinduet og sikrer, at placeringen er altid ens. Som de geometriske krav for disse skabeloner ikke er meget skrappe, kan standard og billige teknologier bruges. I dette tilfælde, vi gjorde dem af acryl plast gennem bearbejdning i en workshop, men lige så levedygtige og billig alternativ er 3D-printning.
Design af akryl skabelonerne er sådan, at de har følgende (figur 3en): (a) en skabelon er designet med to små huller på hver side, mens andet er uden huller; hullerne er 1,5 mm i størrelse og 1,5 mm i dybden, (b) begge skabeloner har et cirkelformet hul med diameter 8 mm og 500 µm dybde i midten, og (c) begge skabeloner har en rektangulær fremspring at definere størrelse, form og tykkelse af de halv enhed; rektanglet er 4 cm x 2,5 cm i længde og bredde og 1,5 mm i tykkelsen.
De resulterende PDMS skabeloner replikeret fra de akryl skabeloner vil have den modsatte polaritet (fig. 3b): (a) en skabelon vil have to søjler på hver side med 1,5 mm i diameter og 1,5 mm højde til at danne i Lad og lad ud af den mønstrede halvdelen af enheden efter NOA støbning; den anden skabelon vil være uden søjler, (b) begge skabeloner har en 500 µm høj søjle i midten til at lette placering af CaF2 Vinduer; Denne funktion vil blive omtalt som "PDMS plug", og (c) begge skabeloner er med et hulrum, som definerer den endelige form og størrelse af hver halvdel af enheden: en rektangel form med 4 cm x 2,5 cm størrelse og 1,5 mm tykkelse i dette tilfælde.
For at yderligere lette fabrikationsproces, blev diffraktion riste indarbejdet i udformningen af photomask til den primære silicium skimmel. I PDMS replika af denne silicium skimmel er de lavvandede fremspring, (som er mindre end 10 µm i højden) svært at se på grund af den optiske gennemsigtighed af PDMS. Dog generere lavvandede fremspring hvis arrangeret i en rist af 10 µm brede linjer med 20 µm gap en let synlige indblanding mønster16. Denne interferensmønster blev udnyttet som en visuel guide til at definere placeringen af mikrofluid lay-out i formen PDMS. Design af mug inkorporerer en ramme lavet af risten til at definere de overordnede geometri af enheden. En anden rist blev yderligere tilføjet midt i det centrale kammer af mikrofluid layout for at lette tilpasningen til vinduet CaF2 . Det er værd at bemærke, at rist i det centrale kammer ikke gengives i den sidste enhed, som det består af en serie af korte hulrum, som ikke er forbundet til kanten af den centrale afdeling. Derfor, den strømmende NOA ville ikke kunne få adgang til disse hulrum.
For celle indsprøjtning og medium exchange behov hver enhed sin i-lade og ud Lad manuelt udstansede før forsegling. Dette resulterede i ikke-reproducerbare placering af hullerne. Dette ikke begrænse driften af hver enhed, da forbindelsen blev opnået ved at lime en lille metallisk pin på en af åbningerne og vedhæfter en plastik reservoir i anden enden som en indsamler. Derfor er varierende holdninger af hullerne ikke af bekymring undtagen på bekostning af en mere kompleks fabrikation ordning. At forenkle og standardisere test og endelig brugen af hver enhed, en skræddersyet fluidic jig med fast i-Lad/out-routing-let steder fjerner indført (Se figur 8), behovet for at knytte pin og reservoir. Derfor, i-Lad/out-routing-let huller med inkonsekvente holdninger ville præsentere et problem her. Ved at indbygge to 1,5 mm huller i den fabrikerede akryl skabelon (protokol trin 3), som vil blive søjler i formen PDMS, fjernes behovet for at manuelt punch huller i enderne af mikrofluid kanalerne. Derudover deres holdning er fast, og det samme for hver enhed.
Fravær af utætheder i enheden kan kontrolleres med samme procedure som beskrevet andetsteds13 dvs., ved at fodre enhed med en opløsning af fluorescein i afioniseret vand.
Kritiske trin i protokollen
Under fabrikation af den mønstrede halvdel af enheden foretages placering af PDMS mug på toppen af vinduet CaF2 forsigtigt, ud. De eneste strukturer på formen, som har tilladelse til at kontakte vinduet er de 10 µm høj fremspring. Når der er en uønsket kontaktområde, bør skimmel placering skridt fornyes. For at illustrere, viser figur 9en omhyggelig placering af mug på vinduet, mens figur 9b viser et eksempel på dårlig placering, hvor en uønsket område af mug er i kontakt med vinduet. Figur 9 b ville resultere i en manglende NOA struktur på vinduet. Den lille kvarts plade nævnt i protokollen (trin 4.1.3, figur 2c) hjælper skimmel placering som det forhindrer de uønskede område af mug i nemt kommer i kontakt med CaF2 -vinduet. Både quartz plade og PDMS mug er også tynd, således at de er tilstrækkeligt nedtonet og transparente UV17,18.
At finde den korrekte UV eksponering dosis til de halve lag er også afgørende for fabrikationsproces. Når NOA er udsat med en utilstrækkelig dosis, ombrydes den uhærdet NOA under peeling off, forårsager tab af definitionen af strukturen og eventuelt overstrømmende CaF2 overfladen. På den anden side, for højt af en eksponering dosis resultater i over hærdning af NOA, dreje NOA i en ikke-tacky tilstand. Efterfølgende limning af de to halvdele ville lide fordi ikke-tacky NOA på det mønstrede halve lag ikke ville obligation til vinduet CaF2 på den flade halv lag. Ideelt, den korrekte dosis bør være den korteste eksponeringdosis, som giver mulighed for NOA at kopiere strukturen pålideligt samtidig bibeholde sin tacky tilstand. Udover fastsættelse af den korrekte eksponering dosis, bør limning af de to halvdele gøres så hurtigt som muligt inden for 30 min, som klistrede af NOA aftager gradvist med tiden, indtil det er ikke længere muligt for limning.
Andre punkter at bemærke er når ved hjælp af vakuum tryk system til limning. Overholdelse af lag (dvs., tynde PDMS plader sandwiching enheden) bør have relativt ensartet tykkelse for ensartet pres distribution på enheden. Til dette formål, blev en skræddersyet akryl jig med definerede spacer tykkelse brugt til at afgive sådanne PDMS ark. Overholdelse ark bør også være ren at undgå at indføre lokale pres, især på vinduet sprødt CaF2 .
Fordelene ved metoden i forhold til eksisterende metoder
Vores fabrikation tilgang viste produktion af en plast enhed kompatibel med FTIR målinger. Fordi den mikro-fabrikation teknik giver god kontrol over dimensionen af funktionen, er den opnåelige kontrol over højden af mikrofluid kanalerne langt mere præcis end hvad kan opnås med andre fabrikation tilgange (f.eks., plastik afstandsstykker).
En afgørende fordel i denne protokol er at det resulterer i en plastik enhed med UV-Vis-IR gennemsigtig visning-havne; alle de tidligere påviste mikrofluid enheder for FTIR blev produceret på toppen af en stor IR gennemsigtig substrat, der kræver litografi trin for hver enhed10,11,12. I den nuværende fremgangsmåde, er omkostningerne og kompleksiteten af fabrikation reduceret da kun produktionen af Si skimmel kræver litografi.
Endelig, ved hjælp af en UV helbredes harpiks (NOA73 i denne demonstration) som den vigtigste plastik krop letter tilslutning af enheden til en ekstern flydende levering system, enten ved limning eller knytte forbindelser til den plastik krop eller en fluidic jig for hurtigere enhedens produktion eller forbrug.
Fremtidige anvendelser af metoden
Af de mulige forbedringer og udvikling, der kan udforskes, er to de mest umiddelbare og vigtigt. Først, se-port bredbånd optisk gennemsigtighed foreslår kobling af FTIR med høj opløsning Fluorescens mikroskopi på samme platform. Dette kan ske let ved at reducere tykkelsen af et af CaF2 vinduer for at overholde kravene i en arbejdende afstand med høj numerisk blænde og høj forstørrelse mål. Andet, denne fabrikation ordning kan give mulighed for mere komplekse fluidic layouts. Flere observation kamre og funktionelle elementer forbinde dem som mixere og sorteringsanlæg, kan gennemføres, så længe deres geometri definerer de åbne hulrum under vinduerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne parlamentsarbejdet MBI finansiel støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical | |||
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS | |
| Norland Optical Adhesive 73 | Norland Products Inc. | 7304 | |
| SU8 3010 photoresist | MicroChem | Y311060 | |
| SU8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| Material | |||
| Silicon wafer, 4 inch, prime grade | Bonda Technology Pte Ltd | ||
| CaF2 IR-grade windows | Crystran, UK | CAFP10-1 | 10 mm diameter, 1 mm thickness |
| Acrylic templates | Custom made | ||
| Equipment | |||
| UV-KUB 2 (UV LED exposure system) | KLOE | Emission spectrum 365nm ± 5nm | |
| Newport UV lamp | Newport | Model 66902 | 50-500 Watt Hg arc lamp |
| CEE Spin coater | Brewer Science | Model 200x | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | ||
| Precision digital hot plate | Harry Gestigkeit GmbH | 2860SR | |
| Plasma Surface Technology | Diener Electronic GmbH + Co. KG | For O2 plasma treatment | |
| IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump | Agilent Technologies | ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar | |
| Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer | Bruker |
References
- Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
- Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
- Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
- Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
- Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
- Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
- Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
- Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
- Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
- Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
- Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
- Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
- Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
- Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
- Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
- Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).
