Summary
Протокол для изготовления пластиковых microfluidic приборы с прозрачный вид портами для видимого и инфракрасного света изображений описан.
Abstract
Инфракрасный (ИК) spectro микроскопия живых биологических образцов препятствует путем поглощения воды в середине ИК-диапазоне и отсутствием подходящих microfluidic приборы. Здесь, свидетельствует протокол для изготовления пластиковых microfluidic приборы, где мягкие литографические техники используются для внедрения прозрачной Фторид кальция (2СПП) вид портов в связи с chamber(s) наблюдения. Метод основан на реплики литья подходе, где плесень полидиметилсилоксан (PDMS) производится через стандартные литографических процедурам и затем используется как шаблон для производства пластиковых устройства. Пластиковый устройство особенности ультрафиолетовой и видимой/инфракрасного (УФ/ИК/Vis) - прозрачные окна, изготовленные из2 СПП для непосредственного наблюдения с видимой и ИК свет. Преимущества предложенного метода включают: сокращение потребности для доступа объекта микро изготовление чистой комнаты, несколько вид портов, простой и универсальный подключение к внешней системе накачки через пластиковый корпус, гибкость дизайна, например , открытые/закрытые каналы конфигурации и возможность добавлять сложные функции, такие как нанопористого мембраны.
Introduction
Преобразование Фурье ИК спектральных микроскопия (FTIR) широко использовались в качестве метки свободно и неинвазивные изображений технике предоставлять подробную информации о химических образца. Это позволяет извлечения биохимических информации для изучения химии биологических образцов, с минимальным количеством препарата, так как спектр поглощения образца осуществляет внутренние отпечатки пальцев его химический состав1 , 2. Недавно, к изучению живых биологических образцов, например, клетки3чаще применялся FTIR. Однако вода, которая является средством для живых клеток в большинстве случаев, показывает сильное поглощение в регионе середине IR. Даже как тонким слоем его присутствие можно полностью подавить важную структурную информацию образцов.
На протяжении многих лет общий подход фиксации или сушки образцы полностью исключить сигнала поглощения воды в спектре. Однако этот подход не позволяет для измерений в режиме реального времени на живые клетки, который необходим для изучения изменения их химического состава и клеточных процессов с течением времени. Одним из способов получения надежных спектров поглощения от живых биологических образцов, является ограничение длины всего оптического пути в средне-и ИК луча до менее 10 мкм4.
Устоявшихся подход в живых клеток экспериментов был так далеко, ослабленных общее отражение (ATR)-FTIR изображений, что позволяет измерения независимо от толщины образца, позволяя клеток в толще слой водной среды. Однако небольшой глубины проникновения затухающих волны ограничивает измерений образцов только первые несколько мкм от поверхности кристалла ATR5.
Кроме того, ограничение поглощения воды было обойти с появлением различных microfluidic систем, которые обычно подразделяются на две большие группы: открыть канал (где один из поверхности жидкости подвергается воздействию атмосферы) и закрытые канал (где два ИК прозрачные окна разделены заполнитель с определенной толщины).
Loutherback et al. разработали открытый канал мембраны устройство, которое позволяет долго срок непрерывного измерения ИК живых клеток до 7 дней6. Этот метод требует высокой влажности окружающей среды для предотвращения испарения среды от поверхности клетки. Система работает лучше всего с клетками, которые естественно растут на воздух жидкости интерфейсы, такие как эпителиальных тканей кожи, легких и глаза или микробные биоплёнки7.
Закрыт канальная конфигурация стремится создать единый, тонкий слой между двух параллельных ИК прозрачные окна, где клетки поддерживаются в их водной. Толщина этой полости такова, что сигнала поглощения воды меньше насыщенности. Воды фон можно затем вычитается для получения спектров правильный пример. Большинство методов закрыт канал использовать пластмассовую дистанционную распорку, разделяющей два окна сформировать съемной жидкости камерные3,8,9. Преимуществом этого метода является, что она не требует микротехнологий; Однако структуры, которые являются более сложными, чем измерительную камеру с in - и вне - let каналы являются крайне трудно реализовать в тонкие прокладки. Существует также проблема с Воспроизводимость длины пути между ИК измерений из-за его зависимость от механического зажима. Для того, чтобы добиться более точного контроля интервалы для получения более надежных спектра, были реализованы методы оптической литографии, чтобы шаблон фоторезиста на вершине ИК субстрат для определения распорку9,10 , 11 , 12. даже несмотря на то, что это делает его возможным для более сложных структур должен быть определен в распорку, метод требует доступ к Фонду микротехнологий производить узор на каждый субстрата.
В этой статье мы представляем простой изготовление техника microfluidic ИК совместимые устройства, с целью снижения стоимости изготовления и требование доступа к микротехнологий объекта. Метод здесь представлены (см. рис. 1) использует установленные процесс, известный как мягкие литографии. В этом случае требуются две формы. Основная форма производится из 4-дюймовый кремниевой пластины с помощью стандартного процесса УФ литографии. Вторичные формы является его реплики из PDMS, который имеет обратной полярности шаблона формы первичного кремния и служит мастер формы для изготовления последующих устройства.
Устройство имеет два отдельных слоя: первый слой с макетом microfluidic (которая в представленном случае состоит из microfluidic канала, в пусть/out пусть и камеры наблюдения с видовой экран2 СПП) и второй слой с плоской поверхности ( который состоит из только на видовом экране2 CaF).
Здесь УФ отверждаемыми оптических клей, Норланд оптических клей 73 (NOA73, сокращенно NOA отныне), используется для формирования основной пластиковый корпус устройства. Существует несколько преимуществ использования оптических клей: стоимость низкая изготовление, простота подключения к внешним системам, хорошая Оптическая прозрачность, низкой вязкости и самое главное, биосовместимость13. CaF2 является подходящим выбором как просмотра благодаря биосовместимость и отличные ИК прозрачность14.
С этот новый подход строго требуется доступ к микротехнологий объекта только для изготовления первичной формы. Процессы последующего изготовления пластиковых microfluidic устройства может осуществляться в любой лаборатории, оснащенной источником УФ освещения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка первичной формы кремния
Примечание: photomask не требуется для подготовки первичной формы. Photomask могут быть приобретены у независимых поставщиков или изготовленных собственными силами через стандартные оптические маска изготовление процедур. Photomask с яркой области полярности используется в данном случае (рис. 2 ).
- Шаблон определения
- спина пальто 4 дюймовый кремниевой пластины с Су-8 3010 негативного фоторезиста при 2300 об/мин за 30 s.
- Soft выпекать фоторезиста на горячей плите на 65 ° C для 2 мин и затем на 95 ° C 8 мин
- Предоставляют фоторезиста УФ света (i линия, 365 Нм) через photomask под маской выравниватель для общей энергии доза составляет 100-120 МДж/см 2; жесткий режим контакта предпочтителен для достижения лучшего резолюции.
- Извлеките пластины и применить пост экспозиции выпекать при температуре 65 ° C за 1 мин и затем при 95 ° C на 2 мин
- Развивать фоторезиста, используя Су-8 разработчик при комнатной температуре, затем ополосните изопропиловый спирт и мягко сушить с азотом; толщиной измеренная шаблон должен быть 10 мкм и ниже. Смотрите Рисунок 2 b для картину фактической кремний плесень.
- Silanization кремний плесень
- лечения кремний плесень с кислородной плазмы 60 W для 30 s с 20 sccm потока кислорода. Установить 1-10 мбар давление в камере во время процесса.
- Место плесень в вакуумный сосуд с 50 мкл силана и оставить банку в состоянии вакуума (1-10 мбар) для по крайней мере 2-х.
Примечание: Процесс silanization создает гидрофобное покрытия, который предотвращает прилипание к плесени 15 PDMS. Обратите внимание, что основной формы также могут быть изготовлены с использованием альтернативного метода, который включает в себя сухого травления кремния. В этом случае photomask будет противоположной полярности (темное поле), и определение шаблона в шаге 1.1 будет использовать позитивный фоторезист.
2. Подготовка PDMS вторичные формы
- PDMS смешивания
- Mix PDMS эластомер и отвердителя, 10:1; Общая сумма такова, что результирующая толщина PDMS составляет примерно 1-1,5 мм.
- После тщательного перемешивания, Дега смесь, оставив ее в вакуумные банки в состоянии вакуума (1-10 мбар) для примерно 15 минут или до тех пор, пока есть без видимых пузыри; это удалить любые воздуха в смеси.
- Плесень репликации
- Вылейте смесь PDMS на кремний плесень, изготовленный в шаге 1 и Дега смесь для удаления любых воздуха с теми же параметрами, что и в шаге 2.1.2. Тепла при 70 ° C для 2 h на горячей плите вылечить смесь.
- Удаление вылечить PDMS из поджарки и дайте ему остыть до комнатной температуры. С лезвием бритвы вырезать PDMS по краям кремний плесень.
- С парой пинцетов, щепотка один угол среза PDMS и тщательно очистите PDMS реплики от кремний плесень; результирующий шаблон microfluidic на этот вторичный плесень является выступ, который является противоположной полярности (основная форма Рисунок 2 c).
- Silanization реплики PDMS (то же, что и в шаге 1.2)
- лечения PDMS плесень с кислородной плазмы 60 W для 30 s с 20 sccm потока кислорода. Установить 1-10 мбар давление в камере во время процесса.
- Место плесень в вакууме банку с 50 мкл силана и оставить банку в состоянии вакуума (1-10 мбар) для по крайней мере 2 h.
3. Подготовка PDMS шаблоны
Примечание: стандартизировать форму и размер окончательного устройства и облегчить согласование основных особенностей на две половинки, были использованы два отдельных PDMS шаблоны, которые определяют геометрию устройства, размещение прозрачные окна и в и вне let соединения. Первый шаблон PDMS СПИД изготовление узорной половины устройства, а второй позволяет упростить изготовление плоских половины устройства.
- Дизайн шаблоны, с помощью программ автоматизированного проектирования (CAD). Рисунок 3 показывает, планировку и размеры шаблона, используемого для изготовления узорной части устройства. Для изготовления плоских части устройства, удалить отверстия диаметром 1,5 мм от проектирования.
- Приобрести шаблоны от внешнего поставщика или через внутреннюю механическую мастерскую, если доступны.
Примечание: Акрил был использован как шаблон материала из-за простоты изготовления и низкой стоимости достижимыми в любой стандартный мастерской. Есть альтернативные варианты, такие как 3D печать. - Смесь PDMS эластомер и отвердителя 10:1; не забудьте подготовить достаточное количество PDMS полностью погружаться шаблоны.
- После тщательного перемешивания, Дега смесь, оставив ее в вакуумные банки в состоянии вакуума (1-10 мбар) для примерно 15 минут или до тех пор, пока есть без видимых пузыри (в зависимости от того, что позднее); это удалить любые воздуха в смеси.
- Вылейте смесь PDMS на акриловые шаблоны, до тех пор, пока их верхней поверхности погружен около 1 мм ниже уровня жидкости. Дега PDMS снова, чтобы удалить любые воздуха с теми же настройками, как и 3.4. Это тепло при 60 ° C для 2 h на выровненной Электроконфорка вылечить смесь.
- Удаление вылечить PDMS из поджарки и дайте ему остыть до комнатной температуры. С лезвием бритвы вырезать PDMS по краям акриловые шаблоны.
- С парой пинцетов, щепотка один угол среза PDMS и тщательно очистите PDMS покинуть акриловые шаблоны.
Примечание: На рисунке 3 b показывает планировку и размеры PDMS реплики используется для изготовления узорной половине устройства. - Подготовить второй PDMS реплики для изготовления плоского, половина из устройства, повторяя шаги с 3,3 до 3,7, но с использованием акриловых шаблон без отверстий диаметром 1,5 мм.
4. Изготовление устройств microfluidic
s- изготовления узорной половины устройства (т.е., с устройством макет)
- лечения окна 2 СПП с кислородной плазмы 60 W для 30 с 20 sccm потока кислорода. Это делается для улучшения потока NOA во время следующих изготовление.
Примечание: Этот шаг не является обязательным. - Место тщательно первый PDMS шаблон (один с столбов диаметром 1,5 мм) на плоской поверхности, например, лайм соды пластины ( рис. 4 ). Поместите CaF 2 окно по центру верхней части вилки PDMS и аккуратно нажмите окна таким образом, что она находится в хорошем контакте с вилкой ( Рисунок 4 b).
- Принять PDMS плесень, сделали в шаге 2 и место тонкой УФ Прозрачные пластины (в данном случае, кварцевые плиты, толщиной 500 мкм и 1,5 x 1,5 см в размер) на обратной стороне формы, в соответствие с расположением Центральной камеры ( рис. 4 c). Убедитесь, что плита кварц находится в хорошем контакте с плесенью PDMS.
Примечание: The кварцевые плиты предотвращает нежелательные области формы легко соприкасающихся окна 2 каф. - Осторожно поместите этот PDMS плесень лицом вниз к окна 2 СПП с аэрогидродинамических камеры выравнивается по центру окна 2 СПП. Убедитесь, что все элементы (шаблон, плесень и окна) в хорошем контакте и согласованы ( рис. 4 c-4 d).
- Постепенно отказаться от капель Ноа на пусть PDMS шаблон и пусть медленно заполните полость. Как только смола соприкасается с края окна, капиллярные потока будет разрыва тонкий (~ 10 мкм) между PDMS плесени и CaF 2 окно ( Рисунок 4 e-4f).
- После полости полностью заполнены, вылечить NOA под воздействием УФ-излучения (например, с системой воздействия UV-LED, Рисунок 4 g).
Примечание: Время экспозиции может меняться соответственно с энергией источника УФ. UV-LED воздействия системы, которая обеспечивает плотность мощности 24 МВт/см 2, требует около 90 s на 100% мощности и режим непрерывной экспозиции. - Тщательно удалить пластину тонкие кварц из задней части PDMS плесени и затем аккуратно чистить PDMS плесень от верхней части NOA слоя ( рис. 4 h). Наконец, удалите NOA слой из шаблона PDMS ( Рисунок 4 я).
Примечание: Полученный макет устройства на вылечить NOA бы же полярность шаблона формы первичного кремния.
- лечения окна 2 СПП с кислородной плазмы 60 W для 30 с 20 sccm потока кислорода. Это делается для улучшения потока NOA во время следующих изготовление.
- Изготовление плоских половины устройства (т.е., без устройства макет)
- лечения окна 2 СПП с кислородной плазмы 60 W для 30 s с 20 sccm потока кислорода.
Примечание: Этот шаг не является обязательным. - Место тщательно второй PDMS шаблон (один без столбов диаметром 1,5 мм) на плоской поверхности, например, плиты извести соды. Поместите CaF 2 окно по центру верхней части вилки PDMS и аккуратно нажмите окна таким образом, что она находится в хорошем контакте с вилки.
- Место PDMS лист толщиной 1 мм с размером 5 х 3,5 см поверх окна 2 СПП с соответствие с центром PDMS шаблона листа PDMS. Убедитесь, что в хорошем контакте с окном PDMS лист.
- Постепенно отказаться от капель Ноа на пусть PDMS шаблон и пусть он медленно заполните полость.
- После полости полностью заполнены, вылечить NOA под воздействием УФ-излучения (например, с системой воздействия UV-LED).
Примечание: Время экспозиции может меняться соответственно с источником энергии UV. С системой воздействия UV-LED, которая обеспечивает плотность мощности 24 МВт/см 2, это требует около 50 s на 100% мощности и режим непрерывной экспозиции. - Пилинг покинуть PDMS лист из верхней части NOA слоя и тщательно удалить вылечить NOA слой из шаблона PDMS.
- лечения окна 2 СПП с кислородной плазмы 60 W для 30 s с 20 sccm потока кислорода.
- Склеивание двух половин устройства
- Выровнять две половинки устройства таким образом, что оба CaF 2 окна выравниваются. Аккуратно пальцем пресс обе половинки на углу NOA слои таким образом, что позиции двух половинок фиксируются.
- Вырезать две круглые диски из PDMS лист толщиной 1 мм с помощью панчер диаметром 8 мм ( рис. 5 ).
- Вырезать два прямоугольника с тем же размером устройство (4 x 2,5 см) от PDMS лист толщиной 1 мм. На обоих PDMS прямоугольников, вырезать отверстия, соответствующие каналы и в пусть/вне-let устройства.
Примечание: Чтобы предотвратить свертывание при прессовании каналы предназначены нарезанные отверстия в прямоугольниках PDMS. - Стек в следующем порядке от дна: один PDMS прямоугольник с предварительно нарезанные отверстия, один диск PDMS (контакт с нижнем окне, разрезать на шаге 4.3.2), две половинки пальца нажата устройства, второй диск PDMS (сидит на верхнем окне) и наконец второй прямоугольник PDMS нарезанные отверстия ( рис. 5 b).
- Место этой Ассамблеи в установки вакуумный пресс, таким образом, что он зажат между 2 пластины и уплотнения пластиковый мешок ( рис. 5 c). Включите вакуумный насос и эвакуировать Ассамблея. Пусть вакуумный насос достичь его базовый давление или вакуум для по крайней мере 10 мин
Примечание: Базовый давление достигнуто зависит от вакуумного насоса используется и качество уплотнения пластиковый пакет. - Предоставляют эвакуированных Ассамблея УФ лампой газа широкополосный Hg на 270 Вт 15 мин поворот от вакуумного насоса и пусть Ассамблея медленно Вент атмосферное давление перед удалением конечного устройства от Ассамблеи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 6 представляет спектры пропускания новый CaF2 окна, узорные половины и полное устройство. Все три спектры демонстрируют отличную прозрачность для середины ИК с коэффициентом пропускания более чем на 80%. Интерференционной картины, видимые в спектре полный устройства (желтый кривая на рисунке) вызвано воздушный зазор в диапазоне 9-10 мкм между двумя окнами. Эти спектры показывают, что представленный здесь подход изготовления не изменяет прозрачность2 СПП в середине ИК-диапазоне.
Рисунок 7 показан пример хорошего репликации в НОА PDMS вторичные формы с microfluidic планировки. Из-за чистой пилинг NOA слоя от плесени PDMS хорошо образуется структура поверх окна2 СПП, после того, как это частично УФ отверждения. Не NOA должен оставаться на форму или на поверхности окна при контакте с выступами плесень. Любое Ноа, застрял на плесень переводится отсутствует структура Ноа на окне, которое приведет к утечки во время экспериментов потока конечного устройства. Кроме того для достижения хорошего уплотнения из двух половин, Ноа должна быть липкой после УФ-облучения половина слоев. Ноа чрезмерно вылечить, если это не липкий. Экспозиционная доза должна быть оптимизирована для достижения такого результата.
Рисунок 7 b вместо, показывает неудачной репликации в НОА, где должным образом не определен шаблон в окне2 СПП. Это главным образом вызвано недостаточной доза УФ облучения, т.е., под отверждение Ноа. В таких случаях Ноа еще несколько мокрых, вызывая некоторое из его придерживаться PDMS плесень. Однако, если NOA еще прилипает к PDMS плесень, даже несмотря на то, что было дано правильные экспозиционной дозы, это может быть симптомом силана покрытие (то есть, антипригарное слой), деградируют с течением времени. Как PDMS мягкие формы, это не так долго, как основной формы кремния. Его необходимо заменить после нескольких применений.
Рисунок 1: Процесс изготовления пластиковых microfluidic устройств: (a-e) Схема процесса изготовления. (f) картину фактического устройства и схема его сечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Обзор фотошаблонов, первичной формы кремния и PDMS вторичных реплицируются из кремний плесень плесень: (a) Photomask с яркой области полярности (вверху слева); Планировка шаблона в фотошаблонов (справа), состоящий из:-пусть и вне пусть с диаметром 2 мм (1 и 2) и расстояние между ними, каналы шириной 300 мкм (3), 3 см две ссылки камер с 5,5 мм x 0,75 мм размер (4), Центральная палата с (размер 5 x 2,5 мм 5), дифракционные решетки в качестве наглядного примера с линии 10 мкм и 20 мкм разрыв (6); Увеличить в планировке Центральной камеры показаны дифракционной решетки (внизу слева). (b) картина кремния первичной формы с шаблоном, определенным в Су-8 фоторезиста. (c) картину PDMS вторичные формы с обратной полярности в отношении первичной формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Шаблонов инструменты готовы облегчить изготовления устройства: () акриловые шаблон: фактический шаблон (вверху) и его схема поперечного сечения (внизу). (b) PDMS реплики акриловые шаблона: фактические реплики (вверху) и его схема поперечного сечения (внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Процесс потока для изготовления узорной половины устройства: () место PDMS шаблон на плоской поверхности. Здесь мы использовали известково стекла. (b) КАФ2 помещается по центру верхней части вилки PDMS. (c-d) PDMS формы помещается лицом вниз к CaF2 с аэрогидродинамических камеры выравнивается по центру окна. Убедитесь, что все элементы в хорошем контакте и согласованы. (e-f) Кастинг NOA через в пусть и позволяя ему медленно заполнить полость. (g) NOA вылечивается, подвергая его под УФ светом. Доза облучения может варьироваться в зависимости от энергии используется источник УФ. (h) тщательно чистить PDMS плесени и шаблон выпустить вылечить Ноа. (я) завершено устройство слоя с microfluidic структурами НОА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Вакуумный пресс установки для прессования две половинки устройства сформировать полный устройства: () PDMS круговой диск (диаметром 8 мм) и PDMS прямоугольник (4 x 2,5 см) с предварительно нарезанные отверстия. Оба, вырезанные из PDMS лист толщиной 1 мм. (b) Обзор слой-стека перед прессованием. (c) Обзор вакуумного пресса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Середина IR t спектры ransmittance голые CaF 2 окно (красный), узорные половина устройства (синий) и полное устройство (желтый). Все три спектры демонстрируют отличную прозрачность для середины ИК с коэффициентом пропускания больше чем 80% Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: Узорные половина устройства: () пример хорошо сформированы microfluidic структуры в НОА. Темные области в окне показывает структуру хорошо определены, четко показывающими Центральная камера, две камеры ссылки и каналы. (b) пример структуры плохо сформированные microfluidic в НОА из-за undercuring. Существует оплавления NOA как указывается красными стрелками. Также одной из палат ссылка отсутствует (зеленая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Microfluidic джиг, подключении к внешним оптимизированных схем сфабрикованные устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: Размещение PDMS плесени во время изготовления узорной половины устройства: () пример хорошего размещения PDMS плесени на окна2 СПП. Окно соприкасается только выступ на PDMS плесень, четко показывающими Центральная камера, две камеры ссылки и каналы (обозначается области темнее). Дифракционные решетки вокруг устройства и в центре Центральной камеры предназначены для визуального руководство во время размещения PDMS плесени. (b) пример плохой размещения PDMS плесень на окна2 СПП. Темные области показывает, что существует также нежелательные области формы, которая находится в контакте с окна, как указывается красными стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для того, чтобы оценивать и оптимизировать протокол изготовления, мы использовали простой макет для microfluidic шаблона с большой прямоугольной камерой (5 x 2,5 мм размер) в центре, два небольших прямоугольных камер (5,5 x 0,75 мм размер) отделена от главной цепи Верхняя и нижняя стороны и 300 мкм широкий в пусть/вне-let каналов. Центральная камера используется для посева и наблюдения клеток, в то время как два разделенных меньше камеры используются для измерения воздуха фон во время FTIR экспериментов в камере ссылку, как описано в предыдущей публикации13. -Пусть и вне позволяют подключить Центральной камеры к системе внешней аэрогидродинамических.
Здесь для облегчения процесса изготовления вводятся шаблонов инструментов (см. шаг 3 протокола). Ранее было трудно поставить windows2 СПП последовательно точно в центре конечного устройства, которое вызвало вопросы при выравнивании две половинки устройства. Использование шаблона обеспечивает наглядное руководство для размещения окна и гарантирует, что расположение всегда похожа. Как не очень строгие геометрические требования для этих шаблонов может использоваться технологии производства стандартных и дешевые. В этом случае мы сделали их из акрилового пластика путем обработки в мастерской, но одинаково жизнеспособных и дешевой альтернативой является 3D печати.
Дизайн шаблонов акриловые такова, что они располагают следующие (Рисунок 3): (a) один шаблон разработан с два маленьких отверстия на каждой стороне, в то время как вторая — без отверстий; отверстия, диаметром 1,5 мм в размер и 1,5 мм в глубину, (b) как шаблоны имеют круглое отверстие с диаметром 8 мм и глубиной 500 мкм в центре, так и (c) как шаблоны имеют прямоугольных выступа для определения размера, формы и толщины половина устройства; прямоугольник является 4 x 2,5 см в длину/ширину и толщину менее 1,5 мм.
Результате PDMS шаблоны, реплицируются из акрилового шаблоны будут иметь противоположной полярности (Рисунок 3b): () один шаблон будет иметь два столпа на каждой стороне с диаметром 1,5 мм и высотой 1,5 мм сформировать в пусть и вне пусть половина из устройства по образцу NOA литья; второй шаблон будет без опор, (b) оба шаблоны имеют высоту столба 500 мкм в центре для облегчения размещения окон2 СПП; Эта функция будет называться как «PDMS пробки», и (c) как шаблоны с полость, которая определяет окончательную форму и размер каждой половины устройства: прямоугольник формы размера и 1,5 мм толщиной 4 см x 2,5 см в этом случае.
Для дальнейшего облегчения процесса изготовления, дифракционных решеток были включены в дизайн фотошаблонов для первичного кремния плесень. В реплике PDMS этой формы кремния мелкие выступы (которые являются менее 10 мкм в высоту) трудно увидеть благодаря оптической прозрачности PDMS. Однако мелкие выступы если расположены в решетка 10 мкм широких линий с 20 мкм разрыв создавать шаблон легко видны помехи16. Этот шаблон вмешательства использовалась как наглядное руководство для определения позиции microfluidic планировки в форме PDMS. Дизайн формы включает в себя каркас из решетки для определения общей геометрии устройства. Другой решетки далее была добавлена в середине Центральной палаты microfluidic макета для того, чтобы упростить выравнивание с окном2 СПП. Стоит отметить, что решетки в центральном зале не быть воспроизведены в конечном устройстве как он состоит из серии коротких полостей, которые не подключены к краю центральной камеры. Таким образом пропуская NOA не сможет получить доступ к этим полостей.
Для инъекции клеток и средних обмена каждого устройства требуется его в пусть и вне пусть вручную кулаками перед печатью. Это привело к невоспроизводимых позиционирование отверстий. Это не ограничивает операции каждого устройства, поскольку подключение было достигнуто путем склеивания небольшой металлический штырь на одном из отверстий и присоединения Пластиковый резервуар на другом конце как коллекционер отходов. Таким образом различные позиции отверстий является не беспокойство за исключением ценой более сложные схемы изготовления. Для упрощения и стандартизации тестирования и окончательного использования каждого устройства, заказные аэрогидродинамических джиг с фиксированным точкам с в пусть/вне-let введено (см. рис. 8), устраняя необходимость прикрепить pin и водохранилище. Следовательно в пусть/вне-let отверстия с несовместимым позиции будет представлять вопрос здесь. Включив два отверстия диаметром 1,5 мм в сфабрикованных акриловые шаблон (шаг 3 протокол), который станет колонны в форме PDMS, снимается необходимость вручную пробить отверстия на концах microfluidic каналов. Кроме того, их положение является фиксированным и то же самое для каждого устройства.
Отсутствие утечек в устройстве могут быть проверены с тем же процедура, как описано в других13 т.е., подавая устройство с раствором флуоресцеин в деионизированной воде.
Важнейшие шаги в протоколе
При изготовлении узорной половины устройства тщательно проводится размещение PDMS плесень поверх окна2 СПП. Только структуры на плесень, которые разрешается связаться окна являются 10 мкм высокими выступами. Всякий раз, когда есть нежелательные площадь контакта, шаг размещения формы должно быть переделано. Для иллюстрации, Рисунок 9 показывает тщательное размещение плесень на окне, а Рисунок 9b показывает пример плохого размещения, где нежелательные области формы находится в контакте с окна. Рисунок 9 b приведет в структуре отсутствует Ноа на окне. Пластину небольшой кварца, упоминаемых в протоколе (шаг 4.1.3, рис. 2c) помогает формы размещения как он предотвращает нежелательные области формы легко соприкасающихся окна2 СПП. Кварцевые плиты и PDMS плесень также тонкий так, что они являются достаточно легкий и прозрачный UV17,18.
Найти правильную дозу облучения УФ для половины слои также имеет решающее значение для процесса изготовления. Когда Ноа подвергается с недостаточные дозы, неотвержденных НОА будет оплавления во время пилинга, привело к потере определение структуры и возможно перелива на поверхность2 СПП. С другой стороны, слишком высокая доза результатов воздействия в чрезмерной полимеризации Ноа, превращая Ноа в не липкий состояния. Последующее склеивание двух половинок будет страдать, потому что не липкий Ноа на слое узорной половина не будет облигаций в окно2 СПП на плоской половину слоя. В идеале правильную дозу должен быть короткий экспозициидоза, которая позволяет NOA надежно реплицировать структуры при сохранении состояния потрёпанный. Помимо определения правильной экспозиции дозы, склеивание двух половинок должно быть сделано как можно скорее в течение 30 мин, как липкость NOA постепенно уменьшается с течением времени до тех пор, пока это больше не возможно для склеивания.
Другие моменты, при использовании системы вакуумного пресса для склеивания. Соответствия слоев (т.е., тонких листов PDMS сэндвич устройства) должны иметь относительно равномерную толщину для равномерное распределение давления на устройстве. Для этой цели по индивидуальному заказу акриловые джиг с определенной прокладку толщиной был использован для приведения таких листов PDMS. Соответствия листы также должно быть чистой, чтобы избежать введения местное давление, особенно на ломкие окна2 СПП.
Преимущества данного метода по сравнению с существующими методами
Наш подход изготовление продемонстрировал производство пластиковых устройство, совместимое с FTIR измерения. Потому что микро изготовление техника обеспечивает хороший контроль над измерение функцию, достижимых контроль над высота microfluidic каналов является гораздо более точным, чем то, что могут быть получены с других изготовление подходов (например, элементы дистанционные пластиковые).
Решающим преимуществом этого протокола является, что это приводит в пластиковых устройство с UV-Vis-ИК прозрачный вид портами; все ранее продемонстрировали microfluidic приборы для FTIR были произведены на вершине большой ИК прозрачной подложке, требующих литографии шаги для каждого устройства10,11,-12. В настоящее время подход стоимость и сложность изготовления уменьшается так, как только производство Si плесень требует литографии.
Наконец, с помощью УФ вылечить смолы (NOA73 в этой демонстрации), как пластиковые корпуса облегчает подключение устройства к внешней системе жидких доставки, либо путем склеивания или прикрепление соединения к пластиковый корпус, или с помощью оптимизированных джиг для более быстрого устройство производства или использования.
Будущего применения метода
Возможные улучшения и развития, которые могут быть изучены два являются наиболее непосредственных и важным. Во-первых широкополосной оптической прозрачности вид порт предлагает сцепного FTIR с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии на той же платформе. Это может быть легко достигнуто путем уменьшения толщины одного из окна2 СПП для того, чтобы соответствовать требованиям рабочей дистанции с высоким числовой апертуры и высокое увеличение целей. Во-вторых эта схема изготовления может позволить для более сложных аэрогидродинамических макетов. Несколько камер наблюдения и функциональных элементов, соединяя их как Смесители и сортировщики, может быть реализован до тех пор, как их геометрия определяет открытые полости под окнами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью признаем MBI финансовой поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical | |||
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS | |
| Norland Optical Adhesive 73 | Norland Products Inc. | 7304 | |
| SU8 3010 photoresist | MicroChem | Y311060 | |
| SU8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| Material | |||
| Silicon wafer, 4 inch, prime grade | Bonda Technology Pte Ltd | ||
| CaF2 IR-grade windows | Crystran, UK | CAFP10-1 | 10 mm diameter, 1 mm thickness |
| Acrylic templates | Custom made | ||
| Equipment | |||
| UV-KUB 2 (UV LED exposure system) | KLOE | Emission spectrum 365nm ± 5nm | |
| Newport UV lamp | Newport | Model 66902 | 50-500 Watt Hg arc lamp |
| CEE Spin coater | Brewer Science | Model 200x | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | ||
| Precision digital hot plate | Harry Gestigkeit GmbH | 2860SR | |
| Plasma Surface Technology | Diener Electronic GmbH + Co. KG | For O2 plasma treatment | |
| IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump | Agilent Technologies | ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar | |
| Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer | Bruker |
References
- Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
- Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
- Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
- Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
- Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
- Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
- Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
- Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
- Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
- Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
- Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
- Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
- Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
- Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
- Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
- Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).
