Summary
Un protocole pour la fabrication des dispositifs microfluidiques plastique transparent vue-ports pour l’imagerie de lumière visible et infrarouge est décrite.
Abstract
Spectro-microscopie infrarouge (IR) d’échantillons biologiques vivants est entravée par l’absorption de l’eau dans la gamme mid-IR et par l’absence de dispositifs microfluidiques approprié. Ici, un protocole pour la fabrication des dispositifs microfluidiques plastique est démontré, où des techniques lithographiques douces sont utilisées pour incorporer des ports-view transparents de fluorure de Calcium (CaF2) dans le cadre de l’observation ou des chambres. La méthode est basée sur une approche de coulée de réplique, où un moule de polydiméthylsiloxane (PDMS) est produit par le biais de procédures lithographiques standard et ensuite utilisé comme modèle pour produire un dispositif en plastique. Le dispositif en plastique comprend ultraviolet/visible/infrarouge (UV/Vis/IR) - fenêtres transparentes en CaF2 pour permettre l’observation directe avec visible et la lumière infrarouge. Les avantages de la méthode proposée sont : un besoin réduit pour l’accès à une installation de micro-fabrication de salle blanche, plusieurs ports-view, une connexion simple et versatile pour un système de pompage externe à travers le corps en plastique, flexibilité de la conception, par exemple , ouvert/fermé de la configuration des canaux et la possibilité d’ajouter des fonctionnalités sophistiquées comme les membranes NANOPOREUSES.
Introduction
Spectro-microscopie infrarouge de transformer de Fourier (FTIR) a été largement utilisée comme une technique d’imagerie non invasive et sans étiquette à fournir des informations détaillées et chimiques d’un échantillon. Cela permet l’extraction de l’information biochimique pour étudier la composition chimique des échantillons biologiques, avec un minimum de préparation, étant donné que le spectre d’absorption de l’échantillon porte les empreintes intrinsèques de sa composition chimique1 , 2. récemment, FTIR a été de plus en plus appliquée à l’étude des échantillons biologiques vivants, par exemple, cellules3. Cependant, l’eau, qui est le moyen pour les cellules vivantes dans la plupart des cas, montre une forte absorption dans la région du mid-IR. Même comme une mince couche, sa présence peut complètement submerger l’information structurelle importante des spécimens.
Pendant de nombreuses années, l’approche commune a été fixer ou séchage des échantillons afin d’exclure complètement le signal d’absorption de l’eau dans le spectre. Cependant, cette approche ne permet pas de mesure en temps réel sur des cellules vivantes, qui est essentiel pour étudier le changement de leur composition chimique et des processus cellulaires avec le temps. Obtenir les spectres d’absorption fiables d’échantillons biologiques vivants, consiste à limiter la longueur du trajet optique totale dans le milieu du faisceau IR à moins de 10 µm4.
Une approche bien établie en vivant des expériences de cellules a été jusqu’ici, réflexion totale atténuée (ATR)-imagerie IRTF, qui permet des mesures indépendantes de l’épaisseur de l’échantillon, permettant aux cellules de se maintenir dans une couche plus épaisse du milieu aqueux. Cependant, la faible profondeur de pénétration de l’onde évanescente restreint mesures d’échantillons à seulement les premiers microns peu de la surface du cristal ATR5.
Par ailleurs, la limitation de l’absorption de l’eau a été contournée avec l’émergence de divers systèmes microfluidiques, qui sont généralement classées en deux grands groupes : ouvrir le canal (où des surfaces fluides est exposé à l’atmosphère) et fermé canal (où les deux fenêtres transparentes IR sont séparés par une entretoise avec une épaisseur définie).
Loutherback al mis au point un dispositif à membrane de canaux ouverts qui permet à long terme IR mesures en continu des cellules vivantes pour jusqu'à 7 jours,6. La méthode nécessite une humidité élevée dans l’environnement pour éviter l’évaporation de la moyenne de la surface cellulaire. Le système fonctionne mieux avec des cellules qui se développent naturellement aux interfaces air-liquide, tels que les tissus épithéliaux de la peau, du poumon et yeux ou des biofilms microbiens7.
Une configuration de canal fermé vise à créer une couche uniforme et mince entre deux fenêtres transparentes IR parallèles, où les cellules sont maintenues dans leur milieu aqueux. L’épaisseur de cette cavité est telle que le signal d’absorption de l’eau est inférieure à saturation. Fond de l’eau peut ensuite être soustraite afin d’obtenir les spectres de l’échantillon correct. La plupart des méthodes fermé-canal utilise une cale en plastique qui sépare les deux fenêtres pour former une chambre liquide démontable3,8,9. Un avantage de cette méthode est qu’elle ne nécessite pas de microfabrication ; Toutefois, les structures sont plus complexes qu’une chambre de mesure avec in et out let canaux sont extrêmement difficiles à réaliser dans l’entretoise mince. Il y a aussi un problème avec la reproductibilité de la longueur de chemin d’accès entre mesures IR en raison de sa dépendance sur le blocage mécanique. Afin d’obtenir un contrôle plus précis de l’espacement pour une acquisition de spectre plus fiable, méthodes de lithographie optique ont été appliquées au modèle photorésine sur le dessus du substrat IR pour définir l’espacement9,10 , 11 , 12. même si cela rend possible pour des structures plus complexes à définir dans la cale d’espacement, la méthode requiert l’accès à une installation de microfabrication pour produire le motif sur chaque substrat.
Dans cet article, nous présentons une technique de fabrication simple d’un dispositif microfluidique compatible infrarouge, avec le but de réduire la fabrication des coûts et l’exigence de l’accès à une installation de microfabrication. La méthode présentée ici (voir Figure 1) utilise un processus établi, appelé Lithographie douce. Deux moules sont nécessaires dans ce cas. Le moule principal est issu d’une plaquette de silicium de 4 pouces à l’aide d’un procédé de lithographie UV standard. Le moule secondaire est sa réplique faite du PDMS, qui a une inversion de la polarité du modèle dans le moule principal de silicium et sert le moule principal pour la fabrication de dispositifs ultérieurs.
L’appareil a deux couches distinctes : une première couche avec la mise en page de microfluidique (qui, dans le cas présenté, comprend le canal microfluidique, en-let/out-let et une chambre d’observation avec une fenêtre de2 CaF) et une seconde couche avec une surface plane ( qui se compose de seulement un CaF2 fenêtre d’affichage).
Ici un UV polymérisable optique adhésif, Norland optique 73 (NOA73, abrégé en NOA désormais), sert à former le corps en plastique de l’appareil. Il y a plusieurs avantages à utiliser cet adhésif optique : fabrication de faible coût, facilité de connectivité avec les systèmes externes, bonne transparence optique, faible viscosité et surtout, biocompatibilité,13. FAC2 est un choix idéal comme la fenêtre d’affichage en raison de sa biocompatibilité et une excellente transparence IR14.
Avec cette nouvelle approche, accès à une installation de microfabrication est strictement requis que pour la fabrication du moule principal. Procédés de fabrication ultérieure du dispositif microfluidique en plastique est réalisable dans n’importe quel laboratoire équipé d’une source de lumière UV.
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Protocol
1. préparation de silicium, de la moisissure primaire
Remarque : un photomasque est nécessaire pour la préparation du moule principal. Le photomasque peut être acheté auprès de fournisseurs indépendants ou fabriqué en interne par le biais de procédures de fabrication de masque optique standard. Un photomasque avec la polarité du champ lumineux est utilisé dans ce cas ( Figure 2 a).
- Définition de pattern
- Spin enduire une plaquette de silicium de 4 pouces avec SU-8 3010 photosensible négative à 2 300 tr/min pendant 30 s.
- Soft-cuire la résine photosensible sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 2 min et puis à 95 ° C pendant 8 min.
- Exposer la résine photosensible à la lumière UV (i-line, 365 nm) par le biais de la photolithographie sous l’aligneur de masque pour une dose totale d’énergie de 100-120 mJ/cm 2 ; le mode de contact dur est préféré à atteindre une meilleure résolution.
- Retirer la plaquette et appliquer une exposition post cuisson au four à 65 ° C pendant 1 min et puis à 95 ° C pendant 2 min.
- Développer la résine photosensible à l’aide d’un développeur de SU-8 à température ambiante, puis rincer avec de l’alcool isopropylique et sécher doucement avec de l’azote, l’épaisseur mesurée modèle devrait être 10 µm et ci-dessous. Voir la Figure 2 b pour l’image du Moule silicone réelles.
- Silanisation du Moule silicone
- traiter le moule silicone avec plasma oxygène à 60 W pour 30 s avec sccm 20 d’alimentation en oxygène. La valeur 1-10 mbar pression dans la chambre pendant le processus de.
- Placer le moule dans un bocal vide avec 50 µL de silane et de laisser le pot dans l’état de vide (1-10 mbar) pendant au moins 2 h.
Remarque : Le processus de silanisation crée un revêtement de surface hydrophobe qui empêche les PDMS de coller au moule 15. Notez que le moule principal peut également être fabriqué en utilisant une autre méthode, qui implique une gravure sèche du silicium. Dans ce cas, le photomasque sera de polarité opposée (fond noir), et la définition de modèle à l’étape 1.1 utilisera une résine photosensible positive.
2. Préparation du moule secondaire PDMS
- PDMS mélange
- mélanger l’élastomère PDMS et salaison, 10:1 ; le montant total est telle que l’épaisseur PDMS est environ de 1 à 1,5 mm.
- Après mélange intime, dégazer le mélange en le laissant dans un pot vide dans l’état de vide (1-10 mbar) pendant environ 15 minutes ou jusqu'à ce qu’il n’y a pas de bulles visibles ; il s’agit d’enlever tout l’air emprisonné dans le mélange.
- Réplication moule
- verser le mélange PDMS sur le moule silicone fabriqué à l’étape 1 et dégazez le mélange pour enlever tout l’air emprisonné avec les mêmes paramètres comme au point 2.1.2. Chauffer à 70 ° C pendant 2 h sur une plaque chauffante pour guérir le mélange.
- Supprimer le PDMS durci de la plaque chauffante et laisser refroidir à température ambiante. Avec une lame de rasoir, coupez le PDMS sur les bords du moule silicon.
- Avec une paire de pincettes, pincer un coin de la coupe PDMS et peler soigneusement la réplique PDMS hors du Moule silicone ; le patron de microfluidique qui en résulte sur ce moule secondaire est une saillie, qui est la polarité opposée de la moule principal ( figure 2 c).
- silanisation du réplica PDMS (même comme à l’étape 1.2)
- traiter le moule PDMS avec plasma oxygène à 60 W pour 30 s avec sccm 20 d’alimentation en oxygène. La valeur 1-10 mbar pression dans la chambre pendant le processus de.
- Place le moule sous vide bocal avec 50 µL de silane et laissez le bocal dans l’état de vide (1-10 mbar) pendant au moins 2 h.
3. Préparation des gabarits de PDMS
Remarque : pour normaliser la forme et la taille des dispositifs finales et pour faciliter l’alignement des principales caractéristiques au cours des deux semestres, deux modèles distincts de PDMS ont été utilisées, qui définissent la géométrie de l’appareil, le placement de la fenêtre transparente et les connexions dans - et out - let. Le premier modèle PDMS facilite la fabrication de la moitié à motifs de l’appareil, tandis que la seconde contribue à faciliter la fabrication de la partie plate du dispositif.
- Concevoir les modèles à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur. figure 3 une montre la mise en page et les dimensions du modèle utilisé pour fabriquer la moitié à motifs de l’appareil. Pour fabriquer la moitié plate de l’appareil, retirez les trous de diamètre 1,5 mm de la conception.
- Acquérir les modèles d’un fournisseur externe ou dans un atelier de mécanique interne si elle est disponible.
NOTE : Acrylique a été utilisé comme modèle du matériel en raison de la facilité de fabrication et de faible coût réalisable dans n’importe quel atelier standard. Il y a des options alternatives, telles que l’impression 3D. - Mélanger l’élastomère PDMS et salaison 10:1 ; n’oubliez pas de préparer une quantité suffisante de PDMS pour immerger entièrement les modèles de.
- Après mélange intime, dégazer le mélange en le laissant dans un pot vide dans l’état vide (1-10 mbar) pendant environ 15 minutes ou jusqu'à ce qu’il n’y a pas de bulles visibles (si elle est postérieure) ; il s’agit d’enlever tout l’air emprisonné dans le mélange.
- Verser le mélange PDMS sur les modèles acryliques jusqu'à ce que leur surface plus haut est submergée d’environ 1 mm sous la surface du liquide. Dégazer le PDMS à nouveau pour enlever tout l’air emprisonné avec les mêmes paramètres 3.4. Ce chauffer à 60 ° C pendant 2 h sur une plaque chauffante nivelée pour guérir le mélange.
- Supprimer le PDMS durci de la plaque chauffante et laisser refroidir à température ambiante. Avec une lame de rasoir, coupez le PDMS le long des bords des modèles acryliques.
- Avec une paire de pincettes, pincer un coin de la coupe PDMS et peler soigneusement le PDMS hors les modèles acryliques.
NOTE : b de la Figure 3 montre la mise en page et les dimensions de la réplique PDMS utilisé pour fabriquer la moitié à motifs de l’appareil. - Préparer la deuxième réplique PDMS pour fabriquer le plat de la moitié de l’appareil en répétant les étapes 3.3 à 3.7, mais en utilisant le modèle acrylique sans les trous de diamètre 1,5 mm.
4. Fabrication de dispositifs microfluidiques
- Fabrication de la moitié à motifs de l’appareil (c'est-à-dire, avec une disposition périphérique)
- traiter la CaF 2 fenêtre avec plasma oxygène à 60 W pour 30 s avec sccm 20 d’alimentation en oxygène. Ceci est fait pour améliorer la circulation de NOA au cours de la fabrication suivante.
Remarque : Cette étape n’est pas obligatoire. - Placer soigneusement le premier PDMS gabarit (celui avec les piliers de diamètre 1,5 mm) sur une surface plane, par exemple, une sodo plaque ( Figure 4 a). Placer une fenêtre de 2 FAC centrée sur le dessus de la fiche PDMS et appuyez doucement sur la fenêtre tel qu’il est en contact avec le bouchon ( Figure 4 b).
- Prendre le moule PDMS fait à l’étape 2 et placez une plaque mince transparent UV (dans ce cas, une plaque de quartz, 500 µm d’épaisseur et 1,5 cm x 1,5 cm de taille) sur l’arrière du moule, alignée sur l’emplacement de la chambre centrale ( Figure 4 c). Assurez-vous que la plaque de quartz est en contact avec le moule PDMS.
Remarque : Thplaque de quartz e empêche la zone non désirée du moule facilement entrer en contact avec la CaF 2 fenêtre. - Placer délicatement ce PDMS moule face vers le bas vers la fenêtre de 2 FAC avec la chambre fluidique alignée au centre de la fenêtre 2 de FAC. Assurez-vous que tous les éléments (modèle, moule et fenêtre) sont en contact et alignement ( Figure 4 c-4D).
- Peu à peu distribuer gouttes d’Ada à l’en-let du modèle PDMS et laissez-le lentement remplir la cavité. Une fois que la résine entre en contact avec le bord de la fenêtre, l’écoulement capillaire comblera le vide mince (environ 10 µm) entre le moule PDMS et la CaF 2 fenêtre ( Figure 4 e-4f).
- Après la cavité est remplie complètement, guérir l’AA par l’exposition aux UV (par exemple, avec un système d’exposition UV-LED, g de la Figure 4).
Remarque : La durée d’exposition peut varier en conséquence avec l’énergie de la source UV. Le système d’exposition UV-LED, qui donne une densité de puissance de 24 mW/cm 2, nécessite environ 90 s à 100 % de puissance et de mode d’exposition continue. - Retirez soigneusement la plaque de quartz mince à l’arrière de la moule PDMS et ensuite délicatement éplucher le moule PDMS du haut de la couche NOA ( Figure 4 h). Enfin, enlever la couche NOA du gabarit de PDMS ( Figure 4 j’ai).
Remarque : La disposition périphérique obtenue sur l’avis d’allégation durci aurait la même polarité du modèle dans le moule silicone primaire.
- traiter la CaF 2 fenêtre avec plasma oxygène à 60 W pour 30 s avec sccm 20 d’alimentation en oxygène. Ceci est fait pour améliorer la circulation de NOA au cours de la fabrication suivante.
- Fabrication de la moitié de plate de l’appareil (c'est-à-dire sans périphérique)
- traiter la CaF 2 fenêtre avec le plasma d’oxygène à 60 W pour 30 s avec sccm 20 d’alimentation en oxygène.
Remarque : Cette étape n’est pas obligatoire. - Placez délicatement le deuxième modèle PDMS (un sans les piliers de diamètre 1,5 mm) sur une surface plane, par exemple, une plaque de chaux sodée. Placer une fenêtre de 2 FAC centrée sur le dessus de la fiche PDMS et appuyez doucement sur la fenêtre tel qu’il est en contact avec le bouchon.
- Placer une feuille PDMS épaisse de 1 mm avec une taille de 5 cm x 3,5 cm sur le dessus de la fenêtre de 2 CaF, avec la feuille PDMS alignée avec le centre du gabarit PDMS. Assurez-vous que la feuille PDMS est en contact avec la fenêtre.
- Peu à peu distribuer gouttes d’Ada à l’en-let du modèle PDMS et laissez-le lentement remplir la cavité.
- Après la cavité est remplie complètement, guérir l’AA par l’exposition aux UV (par exemple, avec un système d’exposition UV-LED).
Remarque : La durée d’exposition peut varier en conséquence avec la source d’énergie UV. Avec le système d’exposition UV-LED, qui donne une densité de puissance de 24 mW/cm 2, cela nécessite environ 50 s à 100 % de puissance et de mode d’exposition continue. - Peel off la feuille PDMS du haut de la couche NOA et retirez délicatement la couche NOA durcie le modèle PDMS.
- traiter la CaF 2 fenêtre avec le plasma d’oxygène à 60 W pour 30 s avec sccm 20 d’alimentation en oxygène.
- De liaison des deux moitiés de l’appareil
- Alignez les deux moitiés de l’appareil tel que les deux fenêtres de 2 FAC sont alignés. Doucement doigt-Appuyez sur les deux moitiés à l’angle des couches NOA telle que la position des deux moitiés ont été fixés.
- Couper deux disques circulaires d’une feuille PDMS épaisse de 1 mm à l’aide d’un perforateur de diamètre 8 mm ( Figure 5 a).
- Couper deux rectangles de même taille de l’appareil (4 x 2,5 cm) d’une feuille PDMS épaisseur 1 mm. Sur les deux rectangles PDMS, couper les ouvertures correspondant aux canaux et l’en-let/out-let du dispositif.
Remarque : Les ouvertures prédécoupées dans les rectangles PDMS visent à empêcher que les canaux s’effondrer pendant le pressage.
Ordre de - pile dans ce qui suit du bas : un rectangle PDMS avec ouvertures précoupées, un seul disque PDMS (au contact de la fenêtre du bas, couper à l’étape 4.3.2), les deux moitiés de doigt-pressé de l’appareil, le deuxième disque PDMS (assis sur le haut de la fenêtre) et enfin le deuxième rectangle PDMS avec ouvertures prédécoupées ( Figure 5 b).
- Placer cette Assemblée dans le paramétrage de la presse sous vide, telle qu’elle est prise en sandwich entre 2 plaques et sceller le sac en plastique ( Figure 5 c). Mettre en marche la pompe à vide et évacuer l’Assemblée. Laisser la pompe à vide, atteindre la pression de sa base ou appliquer le vide pour au moins 10 min.
Remarque : La pression de base atteinte dépend de la pompe à vide utilisés et la qualité de l’étanchéité du sac en plastique. - Exposer l’Assemblée évacuée aux UV avec une lampe à gaz Hg large bande à 270 W pendant 15 min. tourner la pompe à vide et laissez l’Assemblée évacuer lentement à la pression atmosphérique avant de retirer le dispositif final de l’Assemblée.
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Representative Results
La figure 6 présente les spectres de transmittance d’une toute nouvelle CaF2 fenêtre, la moitié à motifs de l’appareil et le dispositif complet. Tous les trois spectres pièce excellente transparence au milieu IR avec transmission supérieure à 80 %. La figure d’interférence visible dans le spectre de l’appareil complet (courbe jaune sur la figure) est causée par l’entrefer de l’ordre de 9 à 10 mm entre les deux fenêtres. Ces spectres démontrent que l’approche de fabrication présentée ici n’altère pas la transparence des CaF2 dans le milieu de gamme IR.
Figure 7 une montre un exemple de Bonne réplication dans NOA du moule PDMS secondaire avec le lay-out de la microfluidique. La structure sur le dessus de la fenêtre de2 FAC est bien formée à cause de l’épluchage propre de la couche NOA du moule PDMS après qu’il est partiellement séchée au UV. Aucun avis d’approbation ne doit rester sur le moule ou sur la surface de la fenêtre en contact avec les saillies de moule. N’importe quel NOA collé au moule traduit par manque de structure de NOA sur la fenêtre, ce qui pourrait causer des fuites au cours d’expériences de débit de l’appareil final. En outre, pour atteindre la bonne étanchéité des deux moitiés, NOA soit encore collante après exposition aux UV des couches la moitié. NOA est trop durci, si elle est non collante. La dose d’exposition doit être optimisée pour atteindre ce résultat.
Figure 7 b montre au lieu de cela, la réplication échoue dans AA où le motif sur la fenêtre de2 FAC n’est pas correctement défini. Il est principalement causé par insuffisante UV dose d’exposition, c'est-à-diresous polymérisation de NOA. Dans ce cas, NOA est encore un peu humide, provoquant certaines d'entre elles s’en tenir à la moule PDMS. Toutefois, si NOA adhère toujours au PDMS moule même si la dose d’exposition correcte a été donnée, cela peut être un symptôme de silane revêtement (c.-à-d., revêtement anti-adhésif) étant dégradée au fil du temps. PDMS est un moule souple, il n’est pas aussi longue durée comme le moule principal de silicium. Il doit être remplacé après quelques utilisations.
Figure 1 : Processus de fabrication des dispositifs microfluidiques plastique : (a à e) Schéma du processus de fabrication. (f) photo d’un périphérique réel et le schéma de sa section transversale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Aperçu des photomasque, moule primaire de silicium et moule secondaire PDMS répliquées à partir du Moule silicone : (un) photomasque avec polarité champ lumineux (en haut à gauche) ; Lay-out du motif dans le photomasque (à droite) composé de : en TLE et out-laissez avec 2 mm de diamètre (1 et 2) et une distance de 3 cm entre eux, canaux avec 300 µm largeur (3), deux référence chambers avec 5,5 mm x 0.75 mm taille (4), la chambre centrale avec (taille 5 x 2,5 mm (5), des réseaux de diffraction comme un guide visuel avec des lignes 10 µm de largeur et 20 µm gap (6) ; Zoom-in lay-out de la chambre centrale montrant le réseau de diffraction (en bas à gauche). (b) photo du Moule silicone primaire avec le modèle défini dans la résine photosensible SU-8. (c) photo du moule secondaire PDMS avec inversion de polarité en ce qui concerne le moule principal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les outils de création de modèles préparés faciliter la fabrication de dispositifs : (un) acrylique modèle : modèle réel (en haut) et sa vue transversale schématique (en bas). (b), PDMS réplique du modèle acrylique : réplique réelle (en haut) et sa vue transversale schématique (en bas). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Processus de flux pour la fabrication de la moitié à motifs de l’appareil : (a) Place le PDMS modèle sur une surface plane. Ici, nous avons utilisé le verre à chaux sodée. (b) CaF2 est placé centré sur le dessus de la fiche PDMS. (c-d) Moule PDMS est placée face vers le bas vers la CaF2 avec la chambre fluidique alignée au centre de la fenêtre. S’assurer que tous les éléments sont en contact et alignement. (e-f) Casting d’AA par l’intermédiaire de la TLE dans et lui permettant de remplir lentement la cavité. (g), NOA est guéri par exposer sous la lumière UV. Dose d’exposition peut varier selon l’énergie de la source UV utilisée. (h) peler soigneusement le modèle pour libérer le NOA durci et le moule PDMS. (j’ai) terminé appareil couche avec structures microfluidiques dans AA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Vide Appuyez sur setup pour presser les deux moitiés de l’appareil pour former un dispositif complet : (un) PDMS disque circulaire (diamètre 8 mm) et PDMS rectangle (4 x 2, 5 cm) avec ouvertures prédécoupées. Les deux sont découpées dans une feuille PDMS épaisseur 1 mm. (b) vue d’ensemble de la pile des calques avant le pressurage. (c) vue d’ensemble de la presse sous vide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Mid-IR t spectres de Ransmittance d’une fac nue 2 fenêtre de (rouge), un la moitié de l’appareil à motifs (bleu) et un dispositif complet (jaune). Tous les trois spectres pièce excellente transparence au milieu IR avec transmission supérieure à 80% S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Motifs la moitié de l’appareil : (a) exemple d’une structure de microfluidique bien formés dans AA. Une zone plus sombre sur la fenêtre montre une structure bien définie, montrant clairement la chambre centrale, deux chambres de référence et les canaux. (b) exemple d’une structure de microfluidique mal formé dans AA en raison de l’undercuring. Il n’y a refusion de NOA comme indiqué par les flèches rouges. Une des chambres référence est également absent (flèche verte). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Jig microfluidique raccorder l’appareil fabriqué sur les circuits fluidiques externes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Moule de placement de PDMS pendant la fabrication de la moitié à motifs de l’appareil : (a) exemple de bonne mise en place du moule à la fac2 fenêtre PDMS. La fenêtre est en contact avec seulement la partie saillante sur le moule PDMS, montrant clairement la chambre centrale, deux chambres de référence et les canaux (indiquées par la zone plus sombre). Les réseaux de diffraction autour de l’appareil et au centre de la chambre centrale sont destinés à un guide visuel au cours de la mise en place de la moule PDMS. (b) exemple d’un mauvais placement du moule à la fac2 fenêtre PDMS. La zone plus sombre indique qu’il y a également une zone non désirée du moule, qui est au contact de la fenêtre, comme indiqué par les flèches rouges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Afin d’évaluer et d’optimiser le protocole de fabrication, nous avons utilisé une disposition simple pour le modèle de microfluidique avec une grande salle rectangulaire (dimensions 5 x 2,5 mm) au centre, deux petites chambres rectangulaires (taille 5,5 x 0,75 mm) séparée du circuit principal sur le les faces supérieures et inférieures et 300 µm large en-let/out-let canaux. La chambre centrale est utilisée pour l’ensemencement et observation des cellules, tandis que les deux chambres séparées de plus petits sont utilisés pour mesurer le fond de l’air pendant FTIR expériences comme une chambre de référence, tel que mentionné dans une précédente publication13. L’en-let et out-laissez connecter la chambre centrale au système fluidique externe.
Ici, les outils de création de modèles (voir protocole étape 3) sont introduits pour faciliter le processus de fabrication. Auparavant, il était difficile de placer systématiquement les FAC2 fenêtres exactement au centre de l’appareil final, qui a causé des problèmes lors de l’alignement des deux moitiés de l’appareil. L’utilisation du modèle fournit un guide visuel pour placer la fenêtre et fait en sorte que l’emplacement est toujours semblable. Comme les exigences géométriques pour ces modèles ne sont pas très rigoureux, les technologies de production standard et bon marché peuvent être utilisés. Dans ce cas, nous leur avons fait acrylique en plastique par usinage dans un atelier, mais une alternative tout aussi viable et bon marchée est l’impression 3D.
La conception des modèles acryliques est telle qu’elles disposent de ce qui suit (Figure 3a) : (a) un seul modèle est conçu avec deux petits trous de chaque côté, tandis que le second est sans trous ; les trous sont de diamètre 1,5 mm en taille et 1,5 mm d’épaisseur, (b) les deux modèles ont un trou circulaire de 8 mm de diamètre et 500 µm de profondeur dans le centre, et (c) les deux modèles ont une saillie rectangulaire pour définir la taille, la forme et l’épaisseur de l’appareil la moitié ; le rectangle est de 4 x 2,5 cm longueur/largeur et 1,5 mm d’épaisseur.
Les modèles qui en résultent de PDMS répliquées à partir des modèles acryliques aura la polarité opposée (Figure 3b) : (a) un seul modèle devra deux piliers sur chaque côté, espacés de 1,5 mm de diamètre et 1,5 mm hauteur forment la TLE dans et laisser hors de la la moitié du dispositif modelé après la coulée de NOA ; le deuxième modèle sera sans piliers, (b) les deux modèles ont un pilier haut 500 µm au Centre pour faciliter le placement des fenêtres2 fac ; Cette fonctionnalité sera considérée comme une « Fiche PDMS », et (c) les deux modèles sont avec une cavité, qui définit la forme finale et la taille de chaque moitié de l’appareil : un rectangle forme avec 4 x 2,5 cm taille et 1,5 mm d’épaisseur en l’espèce.
Pour plus de faciliter le processus de fabrication, des réseaux de diffraction ont été incorporées dans la conception de la photolithographie pour Moule silicone primaire. Dans la réplique PDMS de ce moule silicone, les protubérances peu profondes (qui sont moins de 10 µm de hauteur) sont difficiles à voir grâce à la transparence optique du PDMS. Toutefois, des protubérances peu profondes si disposés dans une grille de 10 µm larges lignes avec 20 µm écart génèrent une interférence visible modèle16. Cette figure d’interférence était exploité comme un guide visuel pour définir la position de la microfluidique lay-out dans le moule PDMS. La conception du moule intègre un cadre composé de la grille pour définir la géométrie globale de l’appareil. Une autre grille a été aussi ajouté au milieu de la chambre centrale de la cadre microfluidiques afin de faciliter l’alignement avec la CaF2 fenêtre. Il est à noter que la grille dans la chambre centrale ne sera pas reproduite dans le dispositif final tel qu’il se compose d’une série de courtes cavités qui ne sont pas raccordés au bord de la chambre centrale. Par conséquent, l’avis d’allégation qui coule ne serait pas en mesure d’accéder à ces cavités.
Pour l’injection de cellules et de l’échange moyen, chaque appareil doit sa en TLE et out-laissez poinçonnés manuellement avant le scellage. Il en est résulté un positionnement non reproductibles des trous. Cela ne limite pas le fonctionnement de chaque appareil étant donné que la connexion a été réalisée en collant une petite broche métallique à une des ouvertures et y attacher un réservoir en plastique à l’autre extrémité comme un collecteur de déchets. Varier les positions des trous n’est donc pas de souci sauf au prix d’un système de fabrication plus complexe. Afin de simplifier et de standardiser l’utilisation de test et finale de chaque appareil, une gigue fluidique sur mesure avec des emplacements fixes dans-let/out-let est introduite (voir Figure 8), éliminant le besoin de fixer la goupille et le réservoir. Par conséquent, en-let/out-let les trous avec des positions incompatibles présenterait un problème ici. En intégrant deux trous de 1,5 mm de diamètre dans le modèle acrylique fabriqué (étape 3 de protocole), qui deviendront des piliers dans le moule PDMS, qu’il fallait faire manuellement les trous aux extrémités des canaux microfluidiques est supprimée. De plus, leur position est fixe et identique pour tous les appareils.
L’absence de fuites dans l’appareil peut être vérifié avec la même procédure comme indiqué ailleurs c'est-à-dire13 , en alimentant l’appareil avec une solution de fluorescéine dans de l’eau déminéralisée.
Étapes cruciales dans le protocole
Au cours de la fabrication de la moitié à motifs de l’appareil, placement du moule sur le dessus de la fenêtre de2 FAC PDMS soigneusement procéder. Les seules structures sur le moule qui sont autorisés à communiquer avec la fenêtre sont les protubérances haute de 10 µm. Chaque fois qu’il y a une zone de contact non désirée, l’étape de mise en place du moule doit être refaite. Pour illustrer, Figure 9un illustre soigneusement le moule sur la fenêtre, tandis queb de la Figure 9montre un exemple de mauvais positionnement, où une zone non désirée du moule est au contact de la fenêtre. Figure 9 b se traduirait par une structure NOA manquante sur la fenêtre. La plaque de quartz petite mentionnée dans le protocole (étape 4.1.3, Figure 2c) permet le placement de moule car elle empêche la zone non désirée du moule d’entrer facilement en contact avec la CaF2 fenêtre. La plaque de quartz et le moule PDMS sont aussi minces afin qu’ils soient suffisamment léger et transparent aux UV17,18.
Trouver le bon dosage d’exposition UV pour les couches de la moitié est également cruciale pour le processus de fabrication. Quand NOA est exposé à une dose insuffisante, l’AA non durci sera redistribué pendant l’épluchage, causant une perte de définition de la structure et éventuellement déborder sur la surface de2 fac. En revanche, trop élevé d’un résultats exposition de dose dans la guérison de trop de l’AA, transformant NOA en un État non collante. Collage ultérieur des deux moitiés en souffriraient parce que NOA non collante sur la couche de demi motif n'aurait pas coller à la fac2 fenêtre sur la couche plane de la moitié. Idéalement, la dose correcte devrait être la plus courte expositiondose qui permet de NOA répliquer la structure fiable tout en conservant son état visqueux. En plus de déterminer la dose d’exposition correcte, collage des deux moitiés devrait être fait dès que possible, dans les 30 minutes, la rigidité de NOA diminue graduellement avec le temps jusqu'à ce qu’il n’est plus possible pour le collage.
Autres points à noter sont lorsque vous utilisez le système de presse sous vide pour le collage. Les couches de la conformité (c.-à-d., des feuilles minces de PDMS intercaler l’appareil) devraient avoir une épaisseur relativement uniforme pour la distribution uniforme de la pression sur l’appareil. À cet effet, un gabarit acrylique sur mesure avec une épaisseur de cale d’espacement défini a été utilisé pour monter ces feuilles PDMS. Les fiches de conformité devraient également être propres pour éviter d’introduire des pressions locales, en particulier sur la fenêtre de2 FAC fragile.
Avantages de la méthode par rapport aux méthodes existantes
Notre approche de fabrication a démontré la production d’un dispositif en plastique compatible avec les mesures FTIR. La technique de microfabrication fournit bon contrôle sur la dimension de la fonctionnalité, le contrôle réalisable sur toute la hauteur des canaux microfluidiques est beaucoup plus précis que ce qui peut être obtenu avec d’autres approches de fabrication (par exemple, cales en plastique).
Un avantage crucial de ce protocole est qu’elle se traduit par un dispositif en plastique avec vue transparent UV-Vis-IR-ports ; tous les dispositifs microfluidiques précédemment démontrée pour FTIR ont été produites sur un substrat transparent grand IR, nécessitant des mesures de lithographie pour chaque périphérique10,11,12. Dans l’approche actuelle, le coût et la complexité de la fabrication est réduite depuis que la production de la moule Si exige la lithographie.
Enfin, à l’aide d’un UV curable de résine (NOA73 dans cette démonstration) que le corps en plastique facilite la connectivité de l’appareil à un système de livraison liquid externe, soit par collage ou dévier les raccordements pour le corps en plastique, ou en utilisant un gabarit fluidique pour plus rapide production d’appareils ou de l’usage.
Futures applications de la méthode
Les améliorations possibles et le développement qui peut être exploré, deux sont les plus immédiats et les plus importantes. Tout d’abord, la transparence optique à large bande de la vue-port suggère l’accouplement de FTIR avec la microscopie de fluorescence à haute résolution sur la même plate-forme. Cela peut être facilement poursuivi en réduisant l’épaisseur de l’un des guichets2 FAC afin de satisfaire aux exigences d’un travail à distance avec grande ouverture numérique et objectifs fort grossissement. Deuxièmement, ce système de fabrication permet des présentations fluidiques plus complexes. Plusieurs chambres de l’observation et des éléments fonctionnels afin qu’ils connaissent comme mélangeurs et trieuses, peut être implémentée tant que leur géométrie définit les cavités ouvertes sous les fenêtres.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le soutien financier de MBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical | |||
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS | |
| Norland Optical Adhesive 73 | Norland Products Inc. | 7304 | |
| SU8 3010 photoresist | MicroChem | Y311060 | |
| SU8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| Material | |||
| Silicon wafer, 4 inch, prime grade | Bonda Technology Pte Ltd | ||
| CaF2 IR-grade windows | Crystran, UK | CAFP10-1 | 10 mm diameter, 1 mm thickness |
| Acrylic templates | Custom made | ||
| Equipment | |||
| UV-KUB 2 (UV LED exposure system) | KLOE | Emission spectrum 365nm ± 5nm | |
| Newport UV lamp | Newport | Model 66902 | 50-500 Watt Hg arc lamp |
| CEE Spin coater | Brewer Science | Model 200x | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | ||
| Precision digital hot plate | Harry Gestigkeit GmbH | 2860SR | |
| Plasma Surface Technology | Diener Electronic GmbH + Co. KG | For O2 plasma treatment | |
| IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump | Agilent Technologies | ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar | |
| Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer | Bruker |
References
- Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
- Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
- Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
- Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
- Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
- Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
- Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
- Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
- Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
- Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
- Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
- Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
- Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
- Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
- Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
- Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).
