Summary
この研究は、異なる哺乳動物種の精巣組織から精製された生殖細胞集団を得るための方法の標準化を記載している。 Hoechst-33342とヨウ化プロピジウムで染色し、FACSソーティングを組み合わせた単純なプロトコールで、男性の生殖生物学の比較研究に幅広く使用されています。
Abstract
蛍光活性化細胞選別（FACS）は、哺乳類の精巣生殖細胞の豊富な集団を単離するための選択方法の1つである。現在、9個までのネズミ生殖細胞集団を高収率および高純度で識別することができます。精子形成を通してのクロマチン構造および量のユニークな変化のために、識別および精製におけるこの高分解能が可能である。これらのパターンは、Hoechst-33342（Hoechst）のような蛍光DNA結合色素で染色した雄生殖細胞のフローサイトメトリーによって捕捉することができる。ここには、哺乳類精巣生殖細胞を単離するために最近開発されたプロトコルの詳細な説明がある。簡単に述べると、単一細胞懸濁液は、機械的解離によって精巣組織から生成され、Hoechstおよびヨウ化プロピジウム（PI）で二重染色され、フローサイトメトリーによって処理される。異なるDNA含有量（Hoechst強度）を有する生存細胞（PI陰性）の選択を含む連続ゲーティング戦略、iFACSソーティング中に5つの生殖細胞型を区別するために使用される。精子細胞（66％）、原発性（71％）および二次性（85％）の精母細胞および精子細胞（90％）を含み、さらに円形（93％）および伸長性（87％）の亜集団に分類された。ワークフロー全体の実行は簡単で、4つの細胞タイプを適切なFACSマシンで同時に分離することができ、2時間未満で実行できます。 エキソビボ細胞の生理学を保存するためには処理時間の短縮が重要であるため、この方法は雄性生殖細胞生物学の下流ハイスループット研究には理想的です。さらに、哺乳類の生殖細胞の多種の精製のための標準化されたプロトコルは、方法論的な変数の源を排除し、単一のセットの試薬を異なる動物モデルに使用することを可能にする。
Introduction
精子形成の進行を示すin vitro系の欠如および精巣における大きな細胞異種性の存在を考慮すると、雄性生殖細胞生物学の研究は、特定の細胞型の豊富な集団を単離するための堅牢な技術を必要とする。蛍光活性化細胞選別（FACS）が広く、高い収率および純度を提供するように、この目的の1、2、3、4、5のために使用され、それは識別することができ生殖細胞型の数の他の単離方法を上回るされています6、7、8を選択します。フローサイトメトリー分析の原理は、単一細胞のレーザービーム励起後の異なる光パターンの検出に基づく。細胞がレーザーを通過すると、光を反射/散乱させる細胞の大きさ（前方散乱; FSC）および細胞内の複雑さ（側方散乱; SSC）に比例するあらゆる角度で、フローサイトメトリーの詳細については、Ormerod 9を参照してください。
雄性生殖細胞は、精子形成の異なる段階を通じてDNA含量、染色質構造、サイズおよび形状に特異的な修飾を受ける。従って、異なる細胞集団を同定し、蛍光色素10、11と光散乱とDNA染色を組み合わせることにより分離することができます。いくつかの色素は、ヘキスト33342（ヘキスト）しばしば、過去十年間1ため精巣細胞のフローサイトメトリー分析に使用される2、4、10れているように、（Geisingerとロドリゲス-Casuriaga 3に概説）は、この目的のために使用することができます、 12 。ウポUV光を有するN個の励起遠赤色蛍光は、クロマチン構造及びコンパクション1、13、14の変動を反映しているのに対し、ヘキストは、細胞のDNA含有量に比例した青色の蛍光を発します。その結果、分化の異なる段階における雄性生殖細胞は、ヘキスト染色単一細胞懸濁液のFACS中に特定のパターンを示す（HO-FACS; 1、12）。興味深いことに、精子による段階の間のみ有効である染料流出の機構に、ヘキスト青色蛍光の強度は、これらの細胞におけるクロマチン含有量に比例しないが、それらはホ- FACS 15時側集団としてクラスタ。また、非浸透性色素ヨウ化プロピジウム（PI）でヘキスト染色を組み合わせ、ユーザーがFACS 1中に死んだ（PI陽性）細胞から（PI陰性）ライブ区別することを可能にします<SUP>、2、10、12。以前にフローサイトメトリーに使用されています。この戦略は、精巣生殖細胞の分析および減数分裂I 1、2、4、16の4つの異なる段階における細胞を含む9生殖細胞型まで区別するために、マウスで広く最適化。この研究の目的のために、Hoechst染色は3つの主な利点を有する。まず、ホー-FACSは、正常マウスモデル1、2、12に雄性生殖細胞、及びそのようなラットおよびモルモット17、18、19のような他のげっ歯類の単離に適用されています。第二に、Hoechstは細胞浸透性色素であり、膜の透過性を必要としないため、vesセルの完全性。ヘキストは、（D [AT]）RNAは保存され、DNAおよびタンパク質に加えて、胚のさらに下流分子の研究に使用することができることを意味するDNA配列1、20、ポリ優先的に結合するので、最終的に、何のRNase処理を必要としません細胞分化。
哺乳動物種（GeisingerおよびRodriguez-Casuriaga 3で概説）のフローサイトメトリー分析で観察されたDNA倍数性および/または染色性の類似性にもかかわらず、フローサイトメトリーによる雄性生殖細胞単離について記載されたプロトコールにはかなりの可変性があった。異なる研究では、組織解離のための特定のプロトコールが用いられ、異なるモデル生物（主にマウス、ラットおよびモルモット）における異なるDNA結合色素（単独または組み合わせ）およびFACSゲーティング戦略が用いられている。したがって、異なる種について収集されたデータの直接の比較は、方法論間のバラツキから生ずる未成熟の技術的成果物。重要なことに、哺乳類の精子形成（2N-4N-2N-1N）におけるクロマチン動態の顕著な保存は、標準化されたプロトコールが様々な哺乳動物種に横方向に適用できることを示唆している。
本研究の目的は、以前に発表された技術2、20を組み合わせて適応させることによって、異なる哺乳動物種に適用可能であり、単一のワークフローを開発することでした。組織処理のための方法の標準化は、酵素消化に必要な種特異的調節の必要性を克服するために機械的解離を行うことによって達成された5 。齧歯類精巣組織の機械的解離は、酵素消化組織20との両方の方法のexhibによって生成された単一細胞懸濁液のホー-FACSよりも良好に機能することが示されたことは注目に値しますそれに匹敵する結果5 。原則の証明として、このプロトコールは、5つの生殖細胞集団を分離するために用いられる設定を記載する：精原細胞（SPG）; （SPC I）および二次精母細胞（SPC II）、および精子（SPD） - ラウンド（rSPD）および伸長（eSPD）を含む。重要なことは、組織解離システムとUVレーザーを備えたセルソーターへのアクセスが主な要件であり、ラボでの実装が容易であることです。このワークフロー（ 図1 ）は迅速かつ簡単で、2時間以内に新鮮な精巣組織から4つの生殖細胞集団を同時に分離することができます。減少した処理時間は、さらなる下流手順のために細胞の完全性を維持するために重要である。さらに、5種の異なる種におけるその成功した性能は、それが哺乳類のクレード内に広く適用され得ることを示唆し、哺乳動物の雄性生殖生物の比較研究のための生殖細胞を単離するための理想的な方法であるおやすみ。
このプロトコルは、（1）精巣組織の機械的解離、および（2）HoechstおよびPIによる精巣細胞の染色、（3）関連する精子形成細胞のFACS選別からなる3つの主要セクションから構成される。一旦集められると、様々な哺乳動物精巣生殖細胞のこれらの豊富な集団は、広範囲の用途に使用することができる。このプロトコルは、多くの異なる哺乳動物種からの雄性生殖細胞を精製するための「ワンサイズ適合」解離方法を記載している。単離された生殖細胞で行うことを希望する研究のタイプに応じて、他の培地または緩衝液を使用することができる。以下のプロトコールステップは、1つの全マウス精巣から単細胞懸濁液を生成するためのものである。
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Protocol
下記の全ての手順は、セントルイスのワシントン大学の動物研究委員会の規則に準拠しています。
1.機械的解離プロトコルの準備
- マウス精巣全体の解離のために、50μmの使い捨て組織脱凝集カートリッジを予め湿らせておく。
注：この使い捨ての組織解離カートリッジには、組織を切断するために設計されたマイクロブレードと、約100個の六角形の穴を備えた不動のスチールメッシュが含まれています。組織解離カートリッジ用の異なるサイズのメッシュは、種および所望の細胞型に基づいてこのプロトコルを適合させるために利用可能である。このペーパーで言及されているすべての哺乳動物種について、50μmのカートリッジを使用した。- 氷冷フェノールレッドフリー1×ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）1mLを50μm使い捨て組織脱凝集カートリッジに充填する。
注：赤色の蛍光の検出を妨げることがあります。FACS中に - シリンジポートから使い捨ての3 mLニードルレスシリンジで組織脱凝集カートリッジから1 x DMEMを吸引します。
- 氷冷フェノールレッドフリー1×ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）1mLを50μm使い捨て組織脱凝集カートリッジに充填する。
- "ON"ボタンを押して組織解離システムをオンにします。このシステムは「ウォームアップ」時間を必要としません。
- 氷冷した1×DMEMを使用した3つの40μm使い捨てフィルターを予め湿らせます。各40μm使い捨てフィルターを50mLコニカルチューブに置きます。 1×DMEMの1mLをピペットし、液体を通過させる。
- 精巣組織の収集のために100mm×15mmのペトリ皿を準備する。 1×DMEM500μLをペトリ皿にピペットで入れる。
2.機械解離プロトコルのための精巣組織の調製
- 外科用はさみと鉗子で新鮮な全精巣または精巣断片（他の哺乳動物の種を扱う場合）を注意深く取り除くために、雄マウスを解剖する。
注：組織に脂肪や壊死がないことを確認してください。 Fr睾丸組織は凍結組織より優れた単一細胞懸濁液品質を生じる。- 収集した精巣/断片を、500μLの1×DMEMを含む調製した100mm×15mmペトリ皿に移す。
- 赤血球（存在する場合）を除去するために、組織を1×DMEMでゆっくりすすいでください。
- 慎重にtunica albugineaを除去する。 Tunica albugineaの厚さは種によって異なる。
- 鉗子で精巣の片端を掴む。
- 前のステップの鉗子で精巣の一端を保持しながら、精巣のもう一方の端をメスで穿刺する。
- 精巣の一方の端をステップ2.2.1の鉗子で保持したまま、メスを使用して精巣管を擦る。
- メスを使用して、精細管を約2〜3mm 3に切断する。
精巣組織の機械的解離による単細胞浮遊液の取得
ontent ">注：下記の解離ステップは、成体マウス精巣の1つです。若年マウスまたは非マウス種の精巣組織の体積は、それに応じて調整する必要があります。精巣組織の組成は、繁殖期に非交配期と比較して変化する。- 小さな睾丸細管片を鉗子を用いて予め濡らした50μm組織脱凝集カートリッジに移し、1mLの1×DMEMを加える。
- 組織解離カートリッジを組織解離システムにロードし、ノブを「スタンバイ」モードから「実行」モードにして5分間処理します。
- 組織解離システムから組織脱凝集カートリッジを取り出し、シリンジポートから使い捨ての3mLニードルレスシリンジで細胞懸濁液を吸引する。
- 数回吸引して組織脱凝集カートリッジからすべての液体を除去する。ない全ての1mLを組織脱凝集カートリッジから回収することができる。
- 吸引された細胞懸濁液を、2つの使い捨ての予め湿潤された40μmのフィルターに通す。フィルターを2回フィルターをかけて細胞集合体を除去する。
- 予め湿らせた40μmフィルターを50mLコニカルチューブに入れます。吸引した細胞をシリンジに直接40μmフィルターに加える。使い捨てピペットでピペットパススルー単一細胞懸濁液。
- 使用済みのプリウェット40μmフィルターを取り外し、別のプリウェット40μmフィルターを50 mLコニカルチューブに入れます。収集した単一細胞懸濁液をクリーン40μmフィルターにピペットで移します。
- きれいな使い捨てピペットでろ過した単一細胞懸濁液を回収する。
- ピペットでろ過した細胞懸濁液を50μm組織解離カートリッジに戻し、組織解離系でさらに5分間処理する。
- 組織の分離からすべての液体を回収するオンカートリッジ。
4.ヘキストおよびヨウ化プロピジウム（PI）による染色
- 回収された細胞懸濁液を50μmの組織分離カートリッジから清潔な1.5mLチューブに移す。約1-1.5mLの単一細胞懸濁液が回収される。
- 回収した単一細胞懸濁液を4本の1.5 mLまたは5 mLチューブに分注する。
- 最初の3本のチューブについては、150μLの単一細胞懸濁液およびピペットの残りの単細胞懸濁液を4本のチューブの最後（単一細胞懸濁液の約550μL）にピペットで移す。
注：最後のチューブの単一細胞懸濁液の量は、ステップ3.6での細胞懸濁液回収の効率に基づいて変化し得る。
- 最初の3本のチューブについては、150μLの単一細胞懸濁液およびピペットの残りの単細胞懸濁液を4本のチューブの最後（単一細胞懸濁液の約550μL）にピペットで移す。
- FACSセッションのための染色されていないコントロールとして4つのチューブの最初のチューブを設定します。
- コントロールとして単一色素染色（PIまたはHoechst）細胞懸濁液を調製する。 2.5μLのHoechstまたは1μLのPIを各チューブに添加する（第2および第5rd）。
- 二重染色チューブを準備する。これは、生殖細胞亜集団を収集するために使用されます。最後のチューブに2.5μLのHoechstと1μLのPIを加えます。
注：Hoechstの保存期間は2〜3ヶ月です。色素の古いストックを使用すると、FACSセッション中に重大な変化が起こります。 - 室温で30分間、暗所でインキュベートする。チューブローテーターにサンプルを入れるか、5〜10分ごとに1.5 mLチューブを逆さにする。
- 予め湿らせた40μmのストレーナーで細胞懸濁液をろ過し、ろ過した溶液を氷上および暗所でFACSセッションまで保持する。
注：濾過工程は、FACSの細胞塊を防ぐために必要です。さらに、DNase（ 図1参照）または2-ナフトール-6,8-ジスルホン酸二カリウム塩（NDA 20 ）での処理を用いて、細胞凝集を制限することができる。長期間の待機期間は、FACSの間に検出された蛍光シグナルに影響し、細胞死の増加をもたらす可能性がある。5.蛍光活性化細胞選別（FACS）精巣細胞のセットアップと精製
- FACS収集チューブを準備する。
- 細胞収集のために400mLのFBSを含む5mLのポリプロピレン丸底管または1.5mLの管をコートする。コーティング後に過剰のFBSを傾瀉する。
- チューブにFACS回収培地（1x DMEM + 10％ウシ胎仔血清、FBS）を加える：5mLチューブ用に1mLまたは1.5mLチューブ用に100μL。
- セルソーターとソフトウェアで適切なソート条件を設定します。
注：他の細胞選別機および分析ソフトウェアは、以下に説明する同様のセットアップおよびゲーティング戦略と共に使用することができる。ここに記載された条件は、Gaysinskaya and Bortvin 2 、Geisinger and Rodriguez-Casuriaga 3 、およびGetun、 et al。 4- 紫外レーザーを463/2でロードするHoechst blueを検出するための5 nmバンドパスフィルターと、Hoechst redを検出し、PIを検出するための680 nm LPバンドパスフィルター。
- 555DLPダイクロイックミラーを使用して、青と赤の蛍光を区別します。
- 70μmのノズルを使用し、1000-2000細胞/秒の割合で細胞を分類する。
注：効率のソートは流量に直接影響されます。高い流速（> 3500事象/秒）は、選別の速度を増加させるが、集団の汚染をもたらす。詳細については、参考文献12を参照してください。
- コントロールサンプルを使用してゲートを設定します。
- 染色されていないサンプルをロードして実行します。
- FSC対SSCプロットパターンに基づいて細胞破片を除外する。プロットの左下象限に細胞破片が現れます。ユーザーまたはセルソーター技術者がセル破片の閾値を任意に設定します。
- FSCとパルス幅のしきい値を調整することにより、単一セルのゲート。異なる細胞選別器は異なる方法を持っています独身の騎士。パルス幅は細胞がレーザーを横切る時間を反映するので、単一細胞は多細胞凝集体と比較して低い値を有する。 FSC対パルス幅のプロットの閾値を調整することで、シングレットを選択することができます。
- 最適光電子増倍管（PMT）電圧を設定します。
- PIまたはHoechst蛍光シグナルの閾値を確立するために、非染色および単一色素染色細胞の両方を使用する。
注：各色素の適切な蛍光範囲を確立するために、目的の細胞のベースラインPTM電圧を最適化することが重要です。これは、最適な信号検出と感度にとって重要です。染色されていない単染色対照細胞を使用して、PIおよび/またはHoechst色素で陰性および陽性に染色された細胞の範囲を確立し、シグナルのノイズを最小限に抑えます。コントロールセルを使用したPMT電圧の最適化の詳細については、Gaysinskaya and Bortvin 2 - 生細胞の門PI染色（PI陰性）およびFSCプロットに基づく。死細胞はPI蛍光に対して陽性である。
- Hoechst blueの蛍光に基づいて細胞数のヒストグラムをプロットしてDNA含有量ゲートを設定する。一倍体（1C）、二倍体（2C）、および四倍体（4C）細胞を表すHoechst青色蛍光の濃度が増加する3つのピークが現れるはずである。 3つのゲートを1つずつ設定します。
- 生殖細胞集団のゲーティングに進む前に、少なくとも50万件のFSC対SSCプロットを観察する。
- ゲートの異なる生殖細胞集団。
- Hoechst / PI染色サンプルをロードする。
- すべての人口に共通の最初の3つの親ゲートを設定します。
- FSC対SSCプロットに基づいて細胞破片を除外する。 FSC対パルス幅プロットに基づいてシングレットを選択します。 PI陰性細胞をゲーティングして生細胞を選択する。
- spermatogoniaゲートを定義します。
- Hoechst青色および赤色蛍光に基づくPI陰性細胞のプロット強度。 Spermatogoniaは側方集団として現れる（ 図1参照）。
- 残りの生殖細胞集団のゲートを定義する。注：視覚的な詳細については、図1および補足図2を参照してください。
- DNA含量ゲートにPI陰性細胞をプロットする。
- 精子については、最も低いHoechst蛍光（1C）でピークをゲートする。
- 精母細胞IIについては、中間のHoechst蛍光（2C）でピークをゲートする。
- 精母細胞Iでは、最高のHoechst蛍光（4℃）でピークをゲートする。
- Hoechstの青色と赤色の蛍光強度をプロットして、DNA含有量ゲートからの精細胞および精細胞集団を精製する。
- 選択された亜集団ゲートを、予め用意された収集チューブに集める。各精巣は、各亜集団について約0.5-6.0×10 6個の細胞を収集するために平均45分から1.5時間かかる。
注：Hoechst maへの長期間の細胞暴露yは時間とともに人口の位置をわずかにシフトさせる。 FACSの20〜30分後に設定を更新してください。各亜集団の最大収量は、解離ステップの効率に左右される。
6.精製された細胞の顕微鏡評価
- 4℃で10分間500-600 xgで細胞を回収した。
- 1mLの氷冷1Xリン酸緩衝液（PBS）または1×DMEMで細胞ペレットを再懸濁する。
注：再懸濁液量は、選別された細胞の数および所望の最終濃度に従って調節することができる。 - 洗浄した細胞40μLをきれいなスライドガラスにピペットで移し、カバースリップを入れる。
- 残りの細胞を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、固定した細胞を暗所で4℃で保存しておく。
- コレクションチューブに100μL4％PFAをピペットで直接注入する。
- チューブまたはピペットを短時間ボルテックスして、細胞懸濁液がよく混合されるようにします。
- 63Xの対物レンズの下でHoechst蛍光を検出するために、UVランプを備えた顕微鏡で準備したスライドを視覚化する。特定の生殖細胞タイプを特定する方法の詳細については、 結果セクション - 選別された生殖細胞集団の形態学的評価を参照してください。
- FACS収集チューブを準備する。
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Representative Results
精巣組織の機械的解離による単細胞懸濁液
図2は 、異なる条件下でのマウス精巣組織の機械的解離によって得られた単細胞懸濁液を比較する。 （ 図2A ）またはHoechst（ 図2B ）で染色された新鮮な組織を処理することによって得られた試料は、分化の様々な段階で単一細胞の存在を示し、重要なことには、精子の鞭毛を含む細胞構造が保存されているように見える。これらの結果は、Hoechst染色が単細胞懸濁液の品質を有意に変えないことを示している（ 図2D ）。これらの結果は、解離後にDNaseを添加することによって減少した染色サンプルにおいて観察された。興味深いことに、単細胞懸濁液マウスの凍結組織（ 図2C ）およびラット、イヌ、モルモットおよびミニブタ（ 補足図1 ）の他の哺乳動物種から機械的解離によって得ることもできる。それらのサンプルでは、様々な細胞タイプが可視であり、識別可能である。しかし、凍結組織の処理は、細胞死および凝集を増加させ、全体的に細胞収量を低下させるようである。したがって、下流のさらなる適用のために、新鮮な組織から単一細胞懸濁液を調製することが強く推奨される。
マウス、ラット、イヌ、モルモットおよびミニブタの新鮮な精巣組織から調製した単一細胞懸濁液の品質を、Ho-FACSの間に評価した（ 表1 ）。細胞破片を排除した後、PI陰性細胞の定量によって示されるように、細胞の95.7〜98.4％が一重項であり、86.5〜93.8％が生存している（ プロトコル参照）。これらの機械的解離は、異なる哺乳動物種の精巣組織からのフローサイトメトリー用の単細胞懸濁液を調製する信頼できる方法であることを示している。
異なる哺乳動物種の精巣組織から生殖細胞を単離するためのHo-FACS
機械的解離後、単一細胞懸濁液をHoechstおよびPIで染色し、FACSで処理する。上記のように、Hoechst染色は、クロマチンの量および構造に基づいて分化の異なる段階における細胞の識別を可能にするが、非透過性細胞のPI染色は死細胞から生存を分離する。したがって、細胞破片および多細胞凝集体を濾過した後、PIゲートはインタクトな膜を有する細胞を選択する（PI陰性; 図1 ）。次に、生細胞をHoechst蛍光に基づいて分析する：青色はDNA含量に比例し、赤色蛍光は凝縮したクロマチンおよび構造変化をほとんど反映しない。したがって、異なる段階の雄性生殖細胞は、青色/赤色のHoechst蛍光（ 図3A ）の機能をプロットするサイトグラムの特定の領域に集まると予想される。
実際、異なる種のために生成ホー-FACSプロットは、ヘキスト蛍光（ 図3B -3℃）に基づいて、異なる細胞集団の存在を示します。これらのプロットは生殖細胞集団を識別するのに十分であるが、クロスコンタミネーションを制限するためにDNA含量（C）ゲートを定義することができる2 。このゲートは、Hoechst青色蛍光強度の関数で細胞数のヒストグラムによって生成される。すべての種について、3つのピークが検出され、1C、2Cおよび4Cの細胞を表す（ 図1および補足図2-5 ）。特に、previとして誤って言及しているが、精原細胞は側方集団であり、DNA含有量のヒストグラムに基づいて確実にゲーティングすることはできない。したがって、この集団は、Hoechst青色/赤色蛍光プロット（ 図1 ）に基づいて、死細胞を排除した後にゲートされる。この戦略は、残りの種についてラットおよび補足図2-5については図1に示されている。 Hoechst蛍光だけでは異なる生殖細胞タイプを区別することができるため、PIとDNAの両方のコンテンツゲートはオプションであることに注意することが重要です。それらは、生存細胞を選択し、交差汚染を減少させるために、この戦略に含まれていた。 表1にまとめたように、DNA含有量ゲート中の細胞の定量化は、精子形成の異なる段階における細胞の相対的割合を反映する。予想どおり、1C細胞は最も豊富であり、精子集団を表し、続いて2C細胞（SPC II）および4C細胞（SPC I）が続く。 Importaこのパターンは種間で保存され、小さな差異は生殖細胞における種間の変動性および精細上皮21のサイクルを反映し得る。
Ho-FACS後、細胞の完全性は、トリパンブルー染色を用いて評価することができる。 FACSの1時間後の生存細胞の割合は、マウスの場合、27％（SCP I）〜67％（SPD）の範囲であり、Hoechstへの曝露および播種の期間が細胞死を増加させることを示している。選別された細胞を培養することを望むユーザにとって、Hoechst濃度およびHo-FACSの持続時間は、細胞生存を改善するために調整されるべきである。それにもかかわらず、RNAシーケンシングデータは、この方法を用いて単離された単一細胞について生成されており（Jung ら 、未発表）、これらの細胞は生殖細胞生物学の分子研究に適していることを示している。このデータセットは、体細胞による生殖細胞集団の潜在的な汚染を検出するために使用された（ 補足図6
選別された生殖細胞集団の形態学的評価
生殖細胞は精子形成を通じて劇的な形態学的変化を受けるので、顕微鏡で単離された集団の純度を推定することが可能である。参考として、 図4は、4つの哺乳動物種（Lima、 et al。、 5から ）からの異なる雄性生殖細胞タイプの一般的な形態を示す。クロマチン分布と凝縮、ならびに細胞の大きさおよび形状は、異なる細胞型において独特でよく特徴付けられたパターンを示す。 SPGは、Hoechstに対して明るく染色され、形状が小さくて丸い（ 図4Bの Spg）別個のペリセントリックヘテロクロマチンを有する。精母細胞はより大きな顆粒細胞である。 SPCの核は、容易に同定され、染色体変異（ 図4Bの Spc I）、SPC IIは二核化されているかまたはダイアキネシス（ 図4Bの Spc II）に特徴的である。最後に、SPDは、丸いまたは細長い形状を有する小さな一倍体細胞である（ 図4BのSpd ）。注目すべきは、rSPDはSPGのサイズと形状に似ていますが、ローカライズされた色彩中心の存在によって明確に区別されます。これらの特性に基づいて、選別された細胞集団を特定の細胞型の濃縮について評価した（ 表1 ）。 SPC IおよびSPGは、特にモルモットおよびミニブタのサンプルについて、他の細胞タイプとのある程度の汚染を示したのに対して、SPDおよびSPC II集団は、細胞タイプの関心対象に対して高度に濃縮された。興味深いことに、犬のサンプルでは、ゲーティング戦略はラウンドを伸長する精子から区別するのに十分であった（ 図3C ; 補足図3 ; 表1
図1：哺乳動物の雄性生殖細胞のHo-FACS単離のワークフロー。この画像は、哺乳動物の生殖細胞の生殖細胞単離のための一般的プロトコールを示し、ラット精巣へのこのプロトコルの適用からの代表的なデータを有する。 Ho：ヘキスト。リマ（Lima） ら 、許可を得て5 。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：機械的解離によって生成された単細胞懸濁液マウス精巣組織。新鮮な組織（ AB ）から得られた試料は、様々な無傷の生殖細胞型およびごくわずかな破片を示す。非染色細胞（ A ）と比較すると、Hoechst染色細胞懸濁液（ B ）では細胞凝集が観察されたが、解離直後（ D ）にDNase（最終濃度10μg/ mL）を添加することにより減少させることができる。凍結精巣組織を用いて、機械的解離（ C ）による単一細胞懸濁液を得ることもできる。しかしながら、組織の解離に先立つフラッシュの凍結および解凍のプロセスは、より多くの破片、細胞死および全体的な細胞収量の減少をもたらすようである。解離後（プロトコールを参照）、試料を4℃で10分間回転させ、スライドを取り付ける前に1×DMEMに再懸濁した。黒い棒=50μm。画像は、UVランプを備えた直立白色光顕微鏡を用いて得た。ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：哺乳動物の生殖細胞のHo-FACS。特定の集団は、FACS（ A ）の間にHoechst蛍光のユニークなパターンを示す。 Hoechst青色蛍光は、一倍体（ C ）のクロマチン含有クラスターの変動を反映するので;倍数体（2C）および四倍体（4C）細胞は、Hoechst青色蛍光の増加とともにFACSプロットの領域に位置する。 Hoechst青色/赤色蛍光の関数として生成されたプロットは、試験した異なる哺乳動物種（ BC ）の異なる細胞集団のクラスターを示す。 SPG：精原細胞; SPC I：初代精母細胞; Pre-Lep：Pre-Leptotene精母細胞;レプト（Lept）：レプトテン（Leptotene）精母細胞;ディップ：Diplotene spermatocytes; SPCII：二次精母細胞; SPD：Spermatids; eSPD：伸長性精子; rSPD：円形精子。リマから適応、 ら。許可を得て5 。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：4つの哺乳動物種からの異なる発生段階における生殖細胞の形態。この図は、Hoechst（A）で染色された精巣組織のセクションと、ラット、モルモット、イヌおよびミニブタからHo-FACS（B）によって選別された異なる雄性生殖細胞タイプの一般的な側面を示す。細胞の大きさ、形状、およびクロマチンの立体配座が精子形成を通じて劇的に変化するので、これらを用いて分化の異なる段階に細胞を割り当てることができる。 Spermatogonia（Spg）は小さくて丸いc別個のペリセントリックヘテロクロマチンを有し、高強度のHoechst蛍光を示す。精母細胞は最大の生殖細胞であり、可変性のクロマチンコンフォメーションを示す。一次精母細胞（Spc I）の核は、減数分裂細胞の特徴であるクロマチン変化を示すが、二次精母細胞（Spc II）は二核またはジキネシスである。精子（Spd）は、精子形成の段階に応じて、丸いまたは細長い形状を有し、小さな一倍体細胞である。丸い精子および精原は類似した大きさおよび形状であるが、前者は、局在化した色素中心の存在によって区別することができる。 Ho-FACS後の各選別細胞タイプについてスライドを調製し、共焦点顕微鏡：63X倍率レンズ（下側パネル）またはなし（上側パネル）の白色光透過で視覚化した。リマ（Lima） ら許可を得て5 。 お願いしますこの図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
| DNA含有量ゲート中の％細胞 | 選別された生殖細胞集団の純度（％） | |||||||||||
| 種 | シングレット | ライブセル％ | 1C | 2C | 4C | Spg | Spc I | Spc II | Spd | rSpd | eSpd | |
| マウス | 98.4 | 92.5 | 34.7 | 3.9 | 3.72 | 74 | 82 | 87.5 | 95.2 | 95 * | 92 * | |
| ラット | 95.7 | 93.8 | 37.7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | 。 | 。 | |
| モルモット | 96.2 | 92.1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68.7 | 85 | 87 | 。 | 。 | |
| 犬 | 97.9 | 86.5 | 16.4 | 3 | 0.5 | 78 | 。 | 87 | 。 | 91 | 81 | |
| ミニブタ | 95.9 | 93.2 | 26.9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | 。 | 。 | |
| *酵素的解離およびゲーテッドによって得られたFSCとSSCのパラメータに基づいて（Lima et al。2016、許可を得て） | ||||||||||||
表1：機械的解離によって得られた雄性生殖細胞懸濁液のHo-FACSの統計。
補足図1：凍結精巣組織の機械的解離によって得られる単細胞懸濁液。機械的解離は、種特異的プロトコールを必要とせずに、異なる哺乳動物種の精巣組織からの単細胞懸濁液の生成を可能にする。異なるパネルは、4つの哺乳動物種について得られた細胞懸濁液を示す。凍結精巣組織の機械的解離によって試料を得、Hoechstで染色した。 SPG：精原細胞; SPC I：一次精母細胞; SPC II：二次精母細胞; SPD：Spermatid; SPZ：精子。スライドをconfocaで可視化した （下側パネル）またはなし（上側パネル）の白色光透過率の顕微鏡写真を示す。スケールバー=20μm。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図2：マウス精巣単細胞懸濁液のHo-FACSによる生存雄性生殖細胞の分離のゲーティング戦略。生細胞（PI陰性）をHoechst蛍光に従ってソートする。 Spermatogonia（SPG）は、Hoechst-blueおよびred蛍光強度を直接プロットすることによって同定される。 DNAコンテントゲートは、ヘキストブルー蛍光に基づいて細胞を分類するために使用される：一倍体（C）;二倍体（2C）および四倍体（4C）である。次いで、Hoechstの青色および赤色蛍光の関数をプロットすることによって、ヒストグラムの各ピークの細胞を分類する。 SPG：精原細胞; SPD：Spermatids; SPC II：二次精母細胞; SPC I：初代精母細胞。d / 55913 / Supp_fig.2.tif ">このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図3：イヌ精巣単細胞懸濁液のHo-FACSによる生存雄性生殖細胞の分離のゲーティング戦略。生細胞（PI陰性）をHoechst蛍光に従ってソートする。 Spermatogonia（SPG）は、Hoechst-blueおよびred蛍光強度を直接プロットすることによって同定される。 DNAコンテントゲートは、ヘキストブルー蛍光に基づいて細胞を分類するために使用される：一倍体（C）;二倍体（2C）および四倍体（4C）である。次いで、Hoechstの青色および赤色蛍光の関数をプロットすることによって、ヒストグラムの各ピークの細胞を分類する。一倍体細胞を含むピークは、ヘキストブルー強度の範囲に従って細分することができ、精子の2つの亜集団を表す：伸長性精子（ゲートC '）および円形精子（ゲートC "）。 SPG：精原細胞; eSPD：伸長性精子; rSPD：円形精子; SPC II：二次精母細胞; SPC I：初代精母細胞。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図4：モルモット精巣単細胞懸濁液のHo-FACSによる生存雄性生殖細胞の分離のゲーティング戦略。生細胞（PI陰性）をHoechst蛍光に従ってソートする。 Spermatogonia（SPG）は、Hoechst-blueおよびred蛍光強度を直接プロットすることによって同定される。 DNAコンテントゲートは、ヘキストブルー蛍光に基づいて細胞を分類するために使用される：一倍体（C）;二倍体（2C）および四倍体（4C）である。次いで、Hoechstの青色および赤色蛍光の関数をプロットすることによって、ヒストグラムの各ピークの細胞を分類する。 SPG：精原細胞; SPD：Spermatids; SPC II：二次精母細胞; SPC I：初代精母細胞。 ここをクリックしてくださいこのファイルをwnloadしてください。
補足図5：ミニブタ精巣単細胞懸濁液のHo-FACSによる生存雄性生殖細胞の分離のゲーティング戦略。生細胞（PI陰性）をHoechst蛍光に従ってソートする。 Spermatogonia（SPG）は、Hoechst-blueおよびred蛍光強度を直接プロットすることによって同定される。 DNAコンテントゲートは、ヘキストブルー蛍光に基づいて細胞を分類するために使用される：一倍体（C）;二倍体（2C）および四倍体（4C）である。次いで、Hoechstの青色および赤色蛍光の関数をプロットすることによって、ヒストグラムの各ピークの細胞を分類する。 SPG：精原細胞; SPD：Spermatids; SPC II：二次精母細胞; SPC I：初代精母細胞。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図6：体細胞汚染の検査Ho-FACSソート集団のイオン。 3つのFACS亜集団ゲート（AB）からの約600個の単一細胞トランスクリプトームのt分布確率的隣接埋込み（t-SNE）プロットを示す。 t-SNEプロット上で、各点は、トランスクリプトーム空間内の単一の細胞の固有の位置を表し、各細胞は、そのFACS亜集団ゲート起点（A）で標識される。 FACS単一細胞t-SNEプロット（B）上の細胞型特異的マーカーの視覚的定量化。体細胞からの汚染は、5％未満であると推定され、1つのHo-FACS集団ゲートに特異的ではない。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
哺乳動物の精子形成過程における高度に保存されたクロマチン動態を考慮して、この研究の目的は、異なる哺乳動物精巣組織からの分化の異なる段階で雄性生殖細胞を単離するためのプロトコールを開発することであった（ 図1 ）。異なる動物モデルへの単一のワークフローの適用における主な障害の1つは、特に組織解離プロトコルに関して、種特異的調整の必要性である。現在の方法は、ほとんどが酵素組織消化に依存しており、プロトコールは種内でさえ変わることが多い12 。この問題を克服するために、ここに記載されたプロトコルは、異なる哺乳動物種の精巣試料から単細胞懸濁液を得るための機械的組織解離の適用を示す。結果は、この系と新鮮な精巣組織の機械的解離が良好に機能することを示している（ 図 2A〜2B 20における先の出願と同様である。重要なことに、Hoechst染色は、単細胞懸濁液の品質に有意な影響を与えないようである。染色されたサンプル（ 図2B ）ではより多くの細胞凝集が見られるが、DNase（ 図2D ）またはNDA 20による処理はこの問題の予防に役立つ。これまでの報告では、精巣組織の機械的解離がより良いまたは酵素組織消化5、20ほど効率的であることを示唆しています。従って、ここに示したデータは、機械的解離が、Ho-FACS処理のための精巣組織から単細胞懸濁液を得る信頼できる方法であることを示している。
Hoechstとのインキュベーションは、フローサイトメトリー中に検出されるシグナルに影響を与えるため、重要なステップです。長期間の染色は、生殖細胞タイプのより優れた識別を提供するが、毒性があり、細胞死や細胞内プログラミングの変化をもたらす可能性があります22 。この方法で生殖細胞培養を確立しようとするユーザーはヘキスト3、22に長時間露光の遺伝毒性効果を評価し、適切な濃度および染色の時間を決定する必要があります。ここで、染色の30分間は、生殖細胞集団（ 図3B -3℃）の確実な分離を提供するのに十分でした。 Rodriguez-Casuriaga、 et al。に示されているように、染色の持続時間は潜在的に10分に短縮することができる。 20、さらに対象の種のためのユーザーによって評価されるべきです。
仮説としては、4つの生殖細胞集団は、一貫して検出することができる- SPG、SPC I、II SPCとSPD-を試験した異なる種からの生殖細胞のクロマチン変化に基づいて（ 図3B -3℃ 表1 ）について得られた高い純度を有する標的化細胞型の全体的濃縮を示し、異なる哺乳動物種についてこのワークフロー（ 図1 ）において採用されたゲーティング戦略を支持する（ 補足図2- 5 ）。それにもかかわらず、いくつかの集団について検出された交差汚染を減少させるために、ユーザが関心のある種および集団に従ってゲーティングを最適化することが推奨される（表1）。これは、染色中のより長いインキュベーション期間によって達成することができる18 、減少した流量2 、および減少したゲートサイズ。それらはまた、時間1、15上に排出色素による精巣において最も稀な細胞型であるとするのでSPGを単離することがより困難です。ここに示すように、Ho-FACSによって異なるSPG集団を検出することは可能であるが、幹細胞生物学のみに焦点を当てた研究は、磁気活性化細胞選別（MACS; 23 ）などのより厳しい技術の恩恵を受けるであろう。特に、SPDの亜集団（eSPDおよびrSPD）は、Dogについては明らかに区別されるが、他の種については明確に区別され得ない（ 図3Cおよび補足図3）。潜在的に、これらの部分集団は、マウス5についての著者によって記載されているように、ゲーティング設定を調整することによって解決することができる。 Hoechst青色/赤色蛍光の機能をプロットする前に、細胞サイズおよび粒度（FSC VS SSC）について生成されたCytogramsnceは、ラウンド（高FSC + SSC）精子サブ集団から伸長する（低FSC + SSC）を識別する。丸い細長い精子分画の分離は、精子分化の間に起こる特定の分子事象への新しい洞察をもたらす精子形成のより深い調査を可能にするであろう。また、12、2、マウス1について記載したように、FACSゲートを調整することにより、減数分裂期のさらなる分解能を得ることが可能です。このようなアプローチは、減数分裂現象の比較研究に大きな利益をもたらすだろう。 Ho-FACSの間に細胞の完全性は妨げられるが、この方法（Jung ら 、 未公開 、 補足図6 ）で選別した細胞について得られた単一細胞RNA配列決定データは、これが生殖細胞の分子研究のための細胞を得る信頼できるアプローチであることを示す生物学。にもかかわらず、round精子細胞の注入（ROSI）は、ホー、FACSによって単離された細胞を使用して選別された細胞の生存率を評価しなければならず、別の方法24、25を探索することができます。
要約すれば、この作業は、異なる哺乳動物から精巣生殖細胞を単離するための標準化された方法、建物を説明し、以前に確立された技術2、12、20に改良を加えます。このような標準化により、異なる哺乳動物種に対して1組の試薬および単一のワークフローを使用することが可能になり、生殖細胞生物学の比較研究のためのデータ生成が容易になる。また、機械的組織解離は、種特異的調整の障害を克服し、方法論的変動をもたらす可能性があり、これは説明することがほとんど不可能である。さらに、実行時間および操作の減少は、 ex vivo細胞の摂動を制限する少年の生理を最小限に抑えます。このようなSTA-PUT及び水簸6,7として生殖細胞単離の他の方法と比較した場合、この点で、ホー-FACSは、大幅に高速です。さらに、同じ実験における4つの細菌集団の同時分離は、FACSによってのみ可能である。 Hoechst色素の性質を考慮すると、細胞構造およびRNA種は保存されているため、細胞はさらに下流の分子研究に使用することができます。重要なことに、Ho-FACSは、生殖細胞タイプを識別するためにクロマチン属性に依存するため、5つの異なる種におけるこのワークフローの成功した実施は、他の哺乳動物へのその適用を強く支持する。ここに提示された結果は、精子形成が、単一プロトコールを用いて多くの哺乳動物種に取り組むことができる細胞分化の独特なプロセスであることを示唆している。このように、「オミックス」とシステム生物学の時代に、この技術は進化的なアプリケーションのための手段を提供します精子形成を通じてのエピジェネティクス、調節、およびタンパク質多様性の研究を含む、雄性生殖細胞生物学の問題に関するローチ。
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Disclosures
すべての著者は競合する利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者らは、犬の精巣のためのヒルサイド動物病院（ミズーリ州セントルイス）に感謝する。 Jason ArandとDr. Ted Ciceroのワシントン大学（セントルイス）で、ラット精巣とBrianne Tabersを提供してくれました。モルモット精巣のためのWashUのJared HartsockとDr. Salt's Lab;小型ブタ精巣のためのWashUの比較医学部門のマイケル・タルコット博士。著者らはまた、職員による細胞選別サービスを提供するSiteman Flow Cytometry Coreの使用について、米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部およびバーンズ - ユダヤ人病院のAlvin J. Siteman Cancer Centerに感謝しています。サイトマン癌センターは、NCI Cancer Center Support Grant＃P30 CA91842の一部でサポートされています。
この研究は、米国国立衛生研究所からの助成金[R01HD078641およびR01MH101810からDへ]のFCT博士論文[SFRH / BD / 51695/2011]FC]およびFCT研究契約[IF / 01262/2014 to AML]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
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