Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En standardisert tilnærming til multispecies Rensing av mammaliske mannlige kimceller ved hjelp av mekanisk vævsdissosiasjon og flytcytometri

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55913
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbeidet beskriver standardisering av en metode for å oppnå rensede bakteriepopulasjoner fra testikkelvev av forskjellige pattedyrsarter. Det er en enkel protokoll som kombinerer mekanisk testis dissosiasjon, flekker med Hoechst-33342 og propidiumjodid, og FACS sortering, med brede anvendelser i sammenlignende studier av mannlig reproduktiv biologi.

Abstract

Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) har vært en av metodene som er valgfrie for å isolere berikte populasjoner av pattedyrs testikulære bakterieceller. For tiden tillater det diskriminering av opptil 9 murine kimcellepopulasjoner med høyt utbytte og renhet. Denne høyoppløsningen i diskriminering og rensing er mulig på grunn av unike endringer i kromatinstruktur og kvantitet gjennom spermatogenese. Disse mønstrene kan fanges ved hjelp av flytcytometri hos mannlige bakterieceller farget med fluorescerende DNA-bindende fargestoffer som Hoechst-33342 (Hoechst). Her er en detaljert beskrivelse av en nylig utviklet protokoll for å isolere pattedyrs testikulære bakterieceller. Kort fortalt genereres enkeltcellesuspensjoner fra testikkelvev ved mekanisk dissosiasjon, dobbeltfarget med Hoechst og propidiumjodid (PI) og behandlet ved hjelp av flytcytometri. En seriell gating strategi, inkludert valg av levende celler (PI negative) med forskjellig DNA innhold (Hoechst intensitet), jegS som brukes under FACS sortering for å diskriminere opptil 5 kimcelletyper. Disse inkluderer, med tilsvarende gjennomsnittlige renheter (bestemt ved mikroskopi-evaluering): spermatogoni (66%), primær (71%) og sekundær (85%) spermatocytter og spermatider (90%), videre separert til runde (93%) og forlengende (87%) delpopulasjoner. Gjennomføring av hele arbeidsflyten er enkel, muliggjør isolering av 4 celletyper samtidig med riktig FACS-maskin, og kan utføres på mindre enn 2 timer. Siden redusert behandlingstid er avgjørende for å bevare fysiologien til ex vivo- celler, er denne metoden ideell for nedstrøms høye gjennomstrømningsundersøkelser av mannlig bakteriebiologi. Videre eliminerer en standardisert protokoll for rensing av pattedyrkimceller med metodiske metoder metodiske kilder til variabler og tillater at et enkelt sett med reagenser brukes til forskjellige dyremodeller.

Introduction

På grunn av mangelen på et in vitro- system som er representative for spermatogeneseprogresjonen, og tilstedeværelsen av stor cellulær heterogenitet i testis, krever studier av mannlig kimcellebiologi robuste teknikker for å isolere berikede populasjoner av spesifikke celletyper. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) har blitt mye brukt til dette formål 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , da det gir høyt utbytte og renhet, og overgår andre isolasjonsmetoder i antall bakterieformer som den kan identifisere og Velg 6 , 7 , 8 . Prinsippet for strømningscytometrianalyse er basert på deteksjon av differensielle lysmønstre etter laserstråle-eksitering av enkeltceller. Når en celle passerer gjennom laseren, reflekterer den / sprer lysetI alle vinkler, proporsjonal med cellestørrelse (forward scatter; FSC) og til intracellulær kompleksitet (side scatter; SSC). Se Ormerod 9 for detaljert informasjon om flytcytometri.

Mannlige kimceller undergår spesifikke modifikasjoner i DNA-innhold, kromatinstruktur, størrelse og form gjennom forskjellige stadier av spermatogenese. Dermed kan forskjellige cellepopulasjoner identifiseres og skilles ved å kombinere lys-spredning og DNA-farging med fluorescerende fargestoffer 10 , 11 . Flere farvestoffer kan brukes til dette formålet (gjennomgått i Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 ), som Hoechst-33342 (Hoechst), som ofte har vært brukt i flytcytometrianalyse av testikkelceller i det siste tiåret 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN eksitering med UV-lys, utmerker Hoechst blå fluorescens proporsjonal med det cellulære DNA-innholdet mens langt rødt fluorescens reflekterer variabilitet i kromatinstruktur og komprimering 1 , 13 , 14 . Som et resultat oppviser mannlige bakterieceller i forskjellige stadier av differensiering spesifikke mønstre under FACS av Hoechst-farget enkeltcellesuspensjoner (Ho-FACS; 1 , 12 ). Interessant, på grunn av en mekanisme for fargestoffutstrømning som bare er aktiv i spermatogonale scenen, er intensiteten av Hoechst blå fluorescens ikke proporsjonal med kromatininnholdet i disse cellene, og de klynger som en sidepopulasjon under Ho-FACS 15 . I tillegg kan kombinasjon av Hoechst-farging med det ikke-permeant fargestoffidiodjodid (PI) tillate brukere å diskriminere levende (PI-negative) fra døde (PI positive) celler under FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Denne strategien har tidligere blitt brukt i strømningscytometriske analyser av testikulære bakterieceller og optimalisert omfattende i musen for å diskriminere opptil 9 kimcelletyper, inkludert celler i 4 forskjellige stadier av meiosis I 1 , 2 , 4 , 16 . For dette arbeidet har Hoechst-farging tre hovedfordeler. Først har Ho-FACS blitt anvendt med suksess på isolering av mannlige bakterieceller i musemodell 1 , 2 , 12 og andre gnagere som rotte og marsvin 17 , 18 , 19 . For det andre, Hoechst er et celle-permeant fargestoff og krever ikke membranpermeabilisering, så det preserVes celle integritet. Endelig er ingen RNase-behandling nødvendig siden Hoechst binder fortrinnsvis til poly (d [AT]) DNA-sekvenser 1 , 20 , hvilket betyr at RNA er bevart og i tillegg til DNA og proteiner kan brukes til videre nedstrøms molekylære studier av bakterier Celledifferensiering.

Til tross for likheten i DNA-ploidi og / eller flekkbarhet observert i strømningscytometrianalyser av pattedyrsarter (vurdert i Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 ), har det vært en stor variasjon i protokollene beskrevet for mannlig bakterie-isolasjon ved hjelp av flytcytometri. Ulike studier har benyttet spesifikke protokoller for vevsdissociasjon, og brukte forskjellige DNA-bindende fargestoffer (alene eller i kombinasjon) og FACS-gatingstrategier i forskjellige modellorganismer, hovedsakelig musen, rotte og marsvin. Derfor kan direkte sammenligning av data samlet for forskjellige arter påvirkes av unaccoUnted tekniske artefakter som skyldes variabilitet mellom metodene. Det er viktig at den slående bevaringen av kromatin-dynamikken gjennom pattedyrspermatogenese (2N-4N-2N-1N) antyder at en standardisert protokoll kan bli på tverrgående måte påført en rekke pattedyrsarter.

Målet med denne studien var å utvikle en enkelt arbeidsflyt som gjelder for forskjellige pattedyrarter, ved å kombinere og tilpasse tidligere publiserte teknikker 2 , 20 . Standardisering av en metode for vevbehandling ble oppnådd ved å utføre mekanisk dissosiasjon for å overvinne behovet for artsspesifikke tilpasninger som kreves for enzymatisk fordøyelse 5 . Det er bemerkelsesverdig at mekanisk dissosiasjon av gnagertestikulært vev har blitt vist å utføre bedre enn enzymatisk vevsfordøyning 20 og Ho-FACS av enkeltcellesuspensjoner frembrakt ved begge metoderDet sammenlignbare resultatene 5 . Som prinsippprotokoll beskriver denne protokollen innstillingene som brukes til å isolere opptil 5 bakteriepopulasjoner: spermatogonia (SPG); Primær (SPC I) og sekundære spermatocytter (SPC II) og spermatider (SPD) - runde (rSPD) og forlengelse (eSPD). Viktig er at det er lett å implementere i laboratoriet, med hovedkravene som systemet for vevsdissociering og tilgang til en celle sorterer utstyrt med en UV laser. Denne arbeidsflyten ( Figur 1 ) er rask og enkel og muliggjør samtidig isolering av 4 bakteriepopulasjoner fra fersk testikkelvev på mindre enn 2 timer. Den reduserte behandlingstiden er avgjørende for å opprettholde cellulær integritet for videre nedstrøms prosedyrer. Dessuten viser den vellykkede ytelsen i 5 forskjellige arter at den kan brukes bredt i pattedyrkledden, noe som gjør den til den ideelle metoden for å isolere bakterieceller for sammenlignende studier av pattedyrs mannlig reproduktiv biolforstå informasjonsteknologi.

Denne protokollen består av tre hoveddeler, bortsett fra forberedende trinn: (1) mekanisk dissosiasjon av testikkelvev og (2) farging av testikkelceller med Hoechst og PI, etterfulgt av (3) FACS-sortering av relevante spermatogene celler. Når de er oppsamlet, kan disse berikede populasjonene av forskjellige bakterier i pattedyrs testiklene brukes til et bredt spekter av anvendelser. Denne protokollen beskriver en "one-size fits all" dissociation metode for å rense mannlige bakterieceller fra mange forskjellige pattedyrsarter. Avhengig av typen studie som brukere ønsker å gjennomføre med de isolerte bakteriene, kan andre medier eller buffere brukes. De følgende protokollstrinn er for å generere enkelcelle-suspensjoner fra en hel murint testis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet nedenfor overholdt forskrifter fra Animal Studies Committee ved Washington University i St. Louis.

1. Forberedelser for mekanisk dissesjonsprotokoll

  1. For-våt en 50 μm disponibel væskedispersjonskassett for dissosiasjon av en hel murint testis.
    MERK: Denne disponible væskedisponeringspatronen inneholder mikroblader laget for kutting av vev og et immobilt stålnett med omtrent 100 sekskantede hull. Forskjellige størrelser av nett for væskedispersjonskassett er tilgjengelige for å tilpasse denne protokollen basert på arter og ønskede celletyper. 50 μm patroner ble brukt for alle pattedyrsarter nevnt i dette papiret.
    1. Legg 1 ml iskall fenolrød gratis 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) på 50 μm disponibel væskedispensjonskassett.
      MERK: Fenolrød kan forstyrre deteksjon av røde fluorerCence under FACS.
    2. Aspirer 1x DMEM fra væskedispersjonskassetten med en 3 ml nålesløs sprøyte fra sprøyteporten.
  2. Slå på vevsaggregeringssystemet ved å trykke på "ON" -knappen. Dette systemet krever ikke "oppvarming" tid.
  3. For-våt tre 40 μm engangsfiltre med iskall 1x DMEM. Plasser hvert 40 μm engangsfilter på et 50 ml konisk rør. Pipetter 1 ml 1 x DMEM og la det passere gjennom væsken.
  4. Forbered en 100 mm x 15 mm petriskål for oppsamling av testikkelvev. Pipetter 500 μl 1 x DMEM på petriskålen.

2. Fremstilling av testikkelvev for mekanisk dissociasjonsprotokoll

  1. Disseksér en mannlig mus for å nøye fjerne ferske hele testikler eller testikulære fragmenter (hvis de håndterer andre pattedyrarter) med kirurgiske saks og pincet.
    MERK: Sørg for at vev er fri for fett og nekrose. Fr Esh testikulært vev genererer overlegen enkeltcelles suspensjonskvalitet enn frosne vev.
    1. Overfør oppsamlede testikler / fragmenter til den forberedte 100 mm x 15 mm petriskålen som inneholder 500 μl 1 x DMEM.
    2. Skyll forsiktig vevet i 1x DMEM for å fjerne røde blodlegemer (hvis tilstede).
  2. Fjern forsiktig tunica albuginea. Tykkelsen av tunica albuginea vil variere i forskjellige arter.
    1. Ta den ene enden av testis med tang.
    2. Punkter den andre enden av testis med en skalpell, mens du fortsatt holder den ene enden av testis med tang fra foregående trinn.
    3. Skrape testikulære rør med en skalpell mens du fortsatt holder den ene enden av testis med tang fra trinn 2.2.1.
  3. Klipp testikulære rør i biter av ~ 2-3 mm 3 ved hjelp av en skalpell.

3. Oppnå singelcellesuspensjoner ved mekanisk dissosiasjon av testikkelvev

Ontent "> MERK: Dissociasjonstrinnene som er beskrevet nedenfor, gjelder for en voksen mus testis. Volum av testikkelvev fra unge mus eller ikke-murine arter bør justeres tilsvarende. Juvenile dyr kan ikke inneholde alle stadier av bakterieceller. Noen pattedyrarter har Testikkelvevssammensetningen endres i avlesesongene i forhold til ikke-paringssesongen.

  1. Overfør de små testikulære rørstykkene til den pre-fuktede 50 μm vev-disaggregasjonskassetten ved hjelp av tang og tilsett 1 ml 1x DMEM.
  2. Legg væskedisponeringskassetten til vevdisoleringssystemet og prosess i 5 minutter ved å skru knappen fra "standby" til "run" -modus.
  3. Fjern væskedisaggeringspatronen fra vevsaggregeringssystemet og aspirer cellepensjon med en 3 ml nålesløs sprøyte fra sprøyteporten.
    1. Aspirer noen ganger for å fjerne all væske fra væskedisponeringskassetten. IkkeAlle 1 ml kan utvinnes fra væskedisponeringskassetten.
  4. Pass den aspirerte cellesuspensjonen gjennom to engangsfor-fuktede 40 μm filtre. Filter to ganger for å fjerne noen celleaggregater.
    1. Plasser ett for-fuktet 40 μm filter i et 50 ml konisk rør. Direkte tilsett aspirerte celler i sprøyten på 40 μm filteret. Pipett-gjennomsiktig en-cellesuspensjon med engangspipette.
    2. Fjern det brukte for-fuktede 40 μm filteret og plasser et annet for-fuktet 40 μm filter i det 50 ml koniske rør. Pipetter den oppsamlede en-cellesuspensjonen på det rene 40 μm filteret.
    3. Samle filtrert en-cellesuspensjon med en ren engangs pipette.
  5. Pipettfiltrert cellesuspensjon tilbake til 50 μm vev-disaggregasjonskassetten og prosessere i ytterligere 5 minutter i et vevsaggregeringssystem.
  6. Gjenvinn væsken fra vevsaggregratienPå patronen.

4. Staining med Hoechst og Propidium Iodide (PI)

  1. Overfør gjenvunnet cellesuspensjon fra 50 μm væskedisponeringskassetten til et rent 1,5 ml rør. Omtrent 1-1,5 ml enkeltcellesuspensjon vil bli gjenvunnet.
  2. Del den gjenvunnede enkelt-cellesuspensjonen i fire 1,5 ml eller 5 ml rør.
    1. For de første tre rørene, pipette 150 μL enkeltcellesuspensjon og pipettresten av enkeltcellesuspensjon i den siste av de fire rørene (ca. 550 μl enkeltcellesuspensjon).
      MERK: Mengden av encellesuspensjon i det siste slangen kan variere basert på effektiviteten av cellesuspensjonsgjenvinning ved trinn 3.6.
  3. Sett første rør av de fire rørene som en ubestemt kontroll for FACS-økten.
  4. Forbered enkeltfarget fargede (PI eller Hoechst) celle suspensjoner som kontroller. Tilsett 2,5 μL Hoechst eller 1 μl PI til hvert rør (andre og tird).
  5. Forbered et dobbeltfarget rør. Dette vil bli brukt til å samle bakteriefeltpopulasjoner. Tilsett 2,5 μL Hoechst og 1 μL PI til siste rør.
    MERK: Hoechst har en holdbarhet på 2-3 måneder. Å bruke eldre lagre av fargestoffer vil forårsake betydelige endringer under FACS-økten.
  6. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter i mørket. Plasser prøver i en rørrotator eller reverser 1,5 ml rør hvert 5-10 minutter.
  7. Filtercellesuspensjon med en forvettet 40 μm sil og hold den filtrerte løsningen på is og i mørket til FACS-økten.
    MERK: Filtreringstrinnet er nødvendig for å forhindre celleklumper for FACS. I tillegg kan behandling med DNase (se figur 1 ) eller 2-naftol-6,8-disulfonsyre dikaliumsalt (NDA 20 ) brukes til å begrense celleklumping. Langvarige ventetider vil påvirke det fluorescerende signalet som detekteres under FACS, og kan resultere i økt celledød.

    5. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) oppsett og rensing av testikulære celler

    1. Forbered FACS samle rør.
      1. Coat 5 ml polypropylen rundbunnsrør eller 1,5 ml rør med 400 μl FBS for celleinnsamling. Dekanter overflødig FBS etter belegning.
      2. Legg FACS-oppsamlingsmedium (1 x DMEM + 10% føtalt bovint serum, FBS) til rørene: 1 ml for 5 ml rør eller 100 μl for 1,5 ml rør.
    2. Sett opp passende sorteringsbetingelser i celle sorter og programvare.
      MERK: Andre cellesorteringsmaskiner og analysesoftware kan brukes med de tilsvarende oppsett- og gatingstrategiene som er beskrevet nedenfor. Betingelsene beskrevet her var tilpasset fra Gaysinskaya og Bortvin 2 , Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 og Getun et al. 4
      1. Legg en ultrafiolett laser med 463/25 nm bandpassfilter for å detektere Hoechst blue og 680 nm LP bandpassfilter for å oppdage Hoechst rød og å oppdage PI.
      2. Bruk et 555DLP dikroisk speil for å skille blå fra rød fluorescens.
      3. Bruk en 70 μm dyse og sorter celler med en hastighet på 1000-2000 celler / sekund.
        MERK: Sorteringseffektiviteten påvirkes direkte av strømningshastigheten. Høye strømningshastigheter (> 3500 hendelser / s) øker graden av sortering, men resulterer i forurensning av populasjoner. Se referanse 12 for ytterligere informasjon.
    3. Sett portene ved hjelp av kontrollprøver.
      1. Last og kjør ufarget prøve.
      2. Ekskluder celleavfall basert på FSC vs SSC plot mønster. Celleavfall vil dukke opp i nedre venstre kvadrant av plottet. Sett med tanke på terskelen for celleavfall av brukeren eller celle sorterings tekniker.
      3. Gate på enkeltceller ved å justere terskelen for FSC og pulsbredde. Ulike cellesortere har forskjellige måter å skille påGuish singlets. Som pulsbredde reflekterer tidceller ta for å krysse laseren, har enkeltceller lavere verdier sammenlignet med multicellulære aggregater. Justering av terskel på et plott for FSC vs pulsbredde kan brukes til å velge for singler.
      4. Still inn optimal fotomultiplikatorrør (PMT) spenninger.
      5. Bruk både ufarget og enkeltfarget farget celler for å etablere terskelen for PI eller Hoechst fluorescenssignal.
        MERK: Det er viktig å optimalisere baseline PTM spenningene for cellene av interesse for å etablere riktig fluorescensområde for hver fargestoff. Dette er kritisk for optimal signal gjenkjenning og følsomhet. De ufarvede og enkeltfarvede kontrollcellene brukes til å etablere en rekke negative og positivt fargede celler med PI- og / eller Hoechst-fargestoffer og minimere støy i signaler. For ytterligere forklaringer om optimalisering av PMT-spenning ved hjelp av kontrollceller, se Gaysinskaya og Bortvin 2
      6. Gate på levende celleS basert på PI-farging (PI-negativ) og FSC-plot. Døde celler vil være positive for PI-fluorescens.
      7. Sett DNA-innholdsporten ved å tegne et histogram av celleverdier basert på Hoechst blå fluorescens. 3 topper med økende konsentrasjoner av Hoechst blå fluorescens skal vises, som representerer haploid (1C), diploid (2C) og tetraploid (4C) celler. Sett 3 porter, en for hver topp.
      8. Vær oppmerksom på minst 500 000 hendelser på FSC vs SSC-plott før du fortsetter å gating på bakteriepopulasjoner.
    4. Gate forskjellige bakteriepopulasjoner.
      1. Last opp Hoechst / PI-farget prøve.
      2. Sett de første 3 foreldreportene som er felles for alle populasjoner.
        1. Ekskluder celleavfall basert på FSC vs SSC-plottet. Velg singlets basert på FSC vs pulsbredde-plottet. Velg levende celler ved å gi PI negative celler.
      3. Definer spermatogonia gate.
      4. Plot PI negative celler basert på Hoechst blå og rød fluorescensintensiteter. Spermatogonia vises som en sidepopulasjon (se figur 1 ).
      5. Definer portene for de gjenværende bakteriefeltpopulasjonene. MERK: Se figur 1 og tilleggs figur 2 for visuelle detaljer.
      6. Plot PI-negative celler i DNA-innholdsporten.
        1. For spermatider går toppen med laveste Hoechst fluorescens (1C).
        2. For spermatocytter II, krysse toppen med mellomliggende Hoechst fluorescens (2C).
        3. For spermatocytter jeg, gate toppen med høyeste Hoechst fluorescens (4C).
      7. Plot Hoechst blå og rød fluorescensintensitet for å finpine spermatocytter og spermatidspopulasjoner fra DNA-innholdsportene.
    5. Samle de utvalgte subpopulasjonsportene inn i oppsamlingsrørene som ble forberedt tidligere. Hver testis vil ta et gjennomsnitt på 45 minutter til 1,5 timer for å samle ca. 0,5-6,0 x 10 6 celler for hver subpopulasjon.
      MERK: Forlenget celleeksponering til Hoechst maDu skifter posisjonen av populasjoner med tiden litt. Oppdater innstillingene etter 20-30 minutter med FACS. Maksimalt utbytte for hver subpopulasjon vil være betinget av effektiviteten av dissosiasjonstrinnet.

    6. Mikroskopisk vurdering av rensede celler

    1. Spin oppsamlet celler ved 500-600 xg ved 4 ° C i 10 minutter.
    2. Re-suspender cellepellet med 1 ml iskall 1x fosfatbufferløsning (PBS) eller 1x DMEM.
      MERK: Tilbakestillingsvolumet kan justeres i henhold til antall celler sortert og ønsket sluttkonsentrasjon.
    3. Pipett 40 μl vasket celler på en ren glassglass og plasser en deksel.
    4. Fest de gjenværende cellene med 4% paraformaldehyd (PFA) og lagre faste celler ved 4 ° C i mørke for fremtidig referanse.
      1. Pipetter 100 μL 4% PFA direkte i oppsamlingsrørene.
      2. Vortex rørene eller pipetten kort noen ganger for å sikre en god blanding av cellesuspensjonen.
    5. Visualiser de forberedte lysbildene i et mikroskop utstyrt med en UV-lampe for å oppdage Hoechst fluorescens under et 63X objektiv. Se avsnittet Resultater - Morfologisk vurdering av sorterte bakteriepopulasjoner - for ytterligere detaljer om hvordan man identifiserer spesifikke kimcelletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enkeltcellesuspensjoner fra mekanisk dissosiasjon av testikkelvev

Figur 2 sammenligner enkeltcellesuspensjoner oppnådd ved mekanisk dissosiasjon av mus-testikkelvev under forskjellige betingelser. Prøver oppnådd ved behandling av ferskt vev, ufarget ( Figur 2A ) eller farget med Hoechst ( Figur 2B ), viser tilstedeværelsen av enkeltceller i forskjellige stadier av differensiering, og viktigere, ser den cellulære strukturen opp, inkludert flagg av spermatozoer. Selv om det ble observert noen klumping og rusk i de fargede prøvene, som ble redusert ved å tilsette DNase etter dissosiasjon ( Figur 2D ), indikerer disse resultatene at Hoechst-farging ikke signifikant endrer kvaliteten på enkeltcellesuspensjonene. Interessant, enkeltcellesuspensjonEnsioner kan også oppnås fra frosset vev til musen ( figur 2C ) og andre pattedyrsarter - rotte, hund, marsvin og mini-gris ( tilleggs figur 1 ) ved mekanisk dissosiasjon. Ulike celletyper er synlige og identifiserbare i disse prøvene; Bearbeiding av frosset vev synes imidlertid å føre til økt celledød og klumping, og et generelt lavere cellulært utbytte. Som sådan anbefales det sterkt å fremstille enkeltcellesuspensjoner fra ferskt vev for videre nedstrømsapplikasjoner.

Kvaliteten av enkeltcellesuspensjoner fremstilt fra fersk testikkelvev av mus, rotte, hund, marsvin og minisvin ble vurdert under Ho-FACS ( Tabell 1 ). Etter utelukkelse av cellulær rusk, er 95,7-98,4% av cellene singler, og fra de 86,5-93,8% er i live, som vist ved kvantifisering av PI-negative celler (se protokoll ). Disse resultateneTs indikerer at mekanisk dissosiasjon er en pålitelig metode for å fremstille singlecellesuspensjoner for flytcytometri fra testikkelvev av forskjellige pattedyrsarter.

Ho-FACS for å isolere bakterieceller fra testikkelvev av forskjellige pattedyrarter

Etter mekanisk dissosiasjon ble enkeltcellesuspensjoner farget med Hoechst og PI og behandlet av FACS. Som nevnt ovenfor tillater Hoechst-farging diskriminering av celler i forskjellige stadier av differensiering basert på kromatinmengde og struktur, mens PI-farging av ikke-permeabiliserte celler separerer levende fra døde celler. Derfor, etter filtrering ut celleavfall og multicellulære aggregater, velger PI-porten celler med intakte membraner (PI-negative, Figur 1 ). Levende celler analyseres deretter basert på Hoechst fluorescens: Blått er proporsjonalt med DNA-innhold og øker rødtFluorescens reflekterer mindre kondensert kromatin og strukturelle variasjoner. Som sådan forventes mannlige bakterieceller i forskjellige stadier å klynge i bestemte områder av cytogrammer som plotter funksjonen av blå / rød Hoechst-fluorescens ( figur 3A ).

Faktisk viser Ho-FACS-plottene for de forskjellige artene forekomsten av forskjellige cellepopulasjoner basert på Hoechst fluorescens ( Figur 3B -3C ). Selv om disse tomtene er tilstrekkelige for å diskriminere bakteriepopulasjoner, kan en DNA-innholdsport (C) -grind defineres 2 for å begrense kryssforurensning. Denne porten genereres av et histogram av celleteller i funksjon av Hoechst blå fluorescensintensitet. For alle arter kan tre toppene detekteres og representere celler med 1C, 2C og 4C ( figur 1 og tilleggs figur 2-5 ). Spesielt som previNevnt ovenfor, spermatogonia er en sidepopulasjon og kan ikke betryggelig gates basert på histogrammer av DNA-innhold. Derfor er denne befolkningen gated etter utelukkelse av døde celler, basert på Hoechst blå / rød fluorescens plott ( Figur 1 ). Denne strategien er representert i figur 1 for rotte og supplerende figurer 2-5 for de gjenværende arter. Det er viktig å merke seg at siden Hoechst fluorescens alene kan diskriminere de forskjellige kimcelletyper, er både PI og DNA-innholdsportene valgfrie. De ble inkludert i denne strategien for å velge levende celler og redusere krysskontaminering, henholdsvis. Som oppsummert i tabell 1 reflekterer kvantifisering av celler i DNA-innholdsporten den relative andel av celler i forskjellige stadier av spermatogenese. Som forventet er 1C-celler mest forekommende og representerer spermatidpopulasjoner, etterfulgt av 2C-celler (SPC II) og 4C-celler (SPC I). importaNtly, dette mønsteret er bevart på tvers av arter, og små forskjeller kan gjenspeile interspesifikk variabilitet i kimceller og syklusene i det semifinale epitel 21 .

Etter Ho-FACS kan celleintegritet vurderes ved hjelp av Trypan-blå farging. Andelen levende celler etter 1 time FACS varierte fra 27% (SCP I) til 67% (SPD) for musen, hvilket indikerer at varighet av sortering og eksponering for Hoechst øker celledød. For brukere som ønsker å dyrke de sorterte cellene, bør Hoechst-konsentrasjonen og varigheten av Ho-FACS justeres for å forbedre celleoverlevelse. Ikke desto mindre har RNA-sekvenseringsdata blitt generert for enkle celler isolert ved anvendelse av denne metoden (Jung et al ., Ikke-publisert), hvilket indikerer at disse cellene er egnet for molekylære studier av bakteriebiologi. Dette datasettet ble brukt til å oppdage potensiell forurensning av bakteriepopulasjoner med somatiske celler ( tilleggs figur 6

Morfologisk vurdering av sorterte bakteriepopulasjoner

Ettersom kimceller undergår drastiske morfologiske forandringer gjennom spermatogenese, er det mulig å estimere renheten av isolerte populasjoner ved mikroskopi. Som referanse illustrerer figur 4 den generelle morfologien til forskjellige mannlige kimcellertyper fra 4 pattedyrsarter (fra Lima et al. 5 ). Kromatinfordeling og kondensering, samt celle størrelse og form, viser unike og godt karakteriserte mønstre i forskjellige celletyper. SPG har tydelig pericentrisk heterochromatin, som flekker skarpt til Hoechst, og er små og runde i form (Spg på figur 4B ). Spermatocytter er større granulerte celler. Nuclei av SPC I er lett identifiserbare, med chromatin variatioNs karakteristisk for meiotiske celler (Spc I i Figur 4B ), mens SPC II er bukleert eller i diakinesis (Spc II på figur 4B ). Endelig er SPD små haploide celler med rund eller langstrakt form (Spd i figur 4B ). Spesielt er rSPD lik SPG i størrelse og form, men tydelig preget av tilstedeværelsen av lokaliserte kromocenter. Basert på disse egenskapene ble sorterte cellepopulasjoner evaluert for anrikning av spesifikke celletyper ( Tabell 1 ). SPD og SPC II populasjoner var sterkt beriket for celletypen av interesse, mens SPC I og SPG viste en viss grad av forurensning med andre celletyper, spesielt for marsvin og Mini Pig-prøver. Interessant, for hundeprøven var gatingstrategien tilstrekkelig til å diskriminere runde fra langstrakte spermatider ( figur 3C ; supplerende figur 3 ; tabell 1

Figur 1
Figur 1: Arbeidsflyt av Ho-FACS-isolasjon av mannlige kimceller fra pattedyr. Dette bildet illustrerer den generelle protokollen for kimcelleisolasjon av pattedyrkimceller, med representative data fra anvendelsen av denne protokollen til rotte testis. Ho: Hoechst. Fra Lima, et al. 5 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Enkeltcellesuspensjoner generert ved mekanisk dissosiasjon av Mus testikulært vev. Prøver oppnådd fra ferskt vev ( AB ) viser en rekke intakte kimcelletyper og svært lite rusk. Sammenlignet med ufarvede celler ( A ) ble det observert en celleklemming for Hoechst-fargede cellesuspensjoner ( B ), som kan reduseres ved å tilsette DNase (sluttkonsentrasjon på 10 μg / ml) til prøven umiddelbart etter dissosiasjon ( D ). Frosset testikkelvev kan også brukes til å oppnå enkeltcellesuspensjoner ved mekanisk dissosiasjon ( C ). Det ser imidlertid ut til at prosessen med flash-frysing og tining før vevsdissociasjon resulterer i mer rusk, celledød og generelt mindre cellulært utbytte. Etter dissosiasjon (se protokoll) ble prøver spunnet i 10 minutter ved 4 ° C og resuspendert i 1x DMEM før montering av lysbildene. Svarte barer = 50 μm. Bilder oppnådd ved hjelp av et oppreist hvitt lysmikroskop utstyrt med UV-lampe.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Ho-FACS av pattedyrkimceller. Spesifikke populasjoner presenterer unike mønstre av Hoechst fluorescens under FACS ( A ). Som Hoechst blå fluorescens reflekterer variasjoner i kromatininnholdsklynger av haploid ( C ); Diploid (2C) og tetraploid (4C) celler ligger i områder av FACS-plottet med økende Hoechst-blå fluorescens. Plotter generert som en funksjon av Hoechst blå / rød fluorescens viser klynger av forskjellige cellepopulasjoner for de forskjellige pattedyrartene som er testet ( BC ). SPG: Spermatogonia; SPC I: Primære spermatocytter; Pre-Lep: Pre-Leptotene spermatocytter; Lep: Leptotene spermatocytter; Dip: Diplotene spermatocytter; SPCII: Sekundære spermatocytter; SPD: Spermatider; ESPD: forlengende spermatider; RSPD: runde spermatider. Tilpasset fra Lima, et al. 5 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Morfologi av kimceller i forskjellige utviklingsstadier fra fire pattedyrsarter. Denne figuren viser deler av testikkelvev farget med Hoechst (A) og det generelle aspektet av forskjellige mannlige kimcelletyper sortert etter Ho-FACS (B) fra rotte, marsvin, hund og mini gris. Som cellestørrelse varierer form og kromatin konformasjon dramatisk gjennom spermatogenese, disse kan brukes til å tilordne celler til forskjellige stadier av differensiering. Spermatogonia (Spg) er liten og rund cElls med tydelig pericentrisk heterochromatin og utviser en høy intensitet av Hoechst fluorescens. Spermatocytter er de største bakteriene og viser variabelkromatinkonfigurasjoner. Nuklear av primære spermatocytter (Spc I) utviser kromatinvarianter som er karakteristiske for meotiske celler, mens sekundære spermatocytter (Spc II) er bukulert eller i diakinesis. Spermatider (Spd) har rund eller langstrakt form, avhengig av spermiogenese og små haploide celler. Selv om runde spermatider og spermatogonia er like i størrelse og form, kan den tidligere skille seg ut av tilstedeværelsen av lokaliserte kromosenter. Lysbilder ble forberedt for hver sortert celletype etter Ho-FACS og ble visualisert i et konfokalt mikroskop: 63X forstørrelseslinser, med (nedre panel) eller uten (øverste panel) hvitt lysoverføring. Fra Lima et al. 5 med tillatelse. Vær så snillKlikk her for å se en større versjon av denne figuren.

% Celler i DNA innhold gate Renhet av sorterte bakteriepopulasjoner (%)
Arter % Singlets % Levende celler 1C 2C 4C Spg Spc I Spc II spd rSpd eSpd
Mus 98,4 92,5 34.7 3.9 3,72 74 82 87,5 95.2 95 * 92 *
Rotte 95,7 93,8 37.7 5.3 5.4 83 81 82 87 . .
Marsvin 96.2 92.1 39.3 7.6 5.8 48 68,7 85 87 . .
Hund 97.9 86.5 16.4 3 0.5 78 . 87 . 91 81
Mini Pig 95,9 93,2 26.9 6.4 3,5 49 52 82 92 . .
* Oppnås ved enzymatisk dissosiasjon og gatedBasert på FSC og SSC parametere (fra Lima et al. 2016, med tillatelse)

Tabell 1: Statistikk av Ho-FACS av mannlige kimcellesuspensjoner oppnådd ved mekanisk dissosiasjon.

Supplerende Figur 1: Enkeltcellesuspensjoner oppnådd ved mekanisk dissosiasjon av frosset testikkelvev. Mekanisk dissosiasjon tillater generering av enkeltcellesuspensjoner fra testikkelvev av forskjellige pattedyrsarter uten behov for artespesifikke protokoller. Ulike paneler viser cellesuspensjonene oppnådd for 4 pattedyrsarter. Prøver ble oppnådd ved mekanisk dissosiasjon av frosset testikkelvev og farget med Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPC I: Primær spermatocyt; SPC II: Sekundær spermatocyt; SPD: Spermatid; SPZ: Spermatozoa. Lysbilder ble visualisert i en confoca L mikroskop med (nedre panel) eller uten (øverste panel) hvit lysoverføring. Skalestenger = 20 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende Figur 2: Gatingstrategi for separasjon av levende hannkimceller ved Ho-FACS av muse-testikulære enkeltcellesuspensjoner. Levende celler (PI negative) er sortert i henhold til Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) er identifisert ved å plotte direkte Hoechst-blå og rød fluorescensintensitet. En DNA-innholdsport brukes til å sortere celler basert på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) og tetraploid (4C). Celler i hver topp av histogrammet blir deretter sortert ved å plotte funksjonen av Hoechst blå og rød fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundære spermatocytter; SPC I: Primære spermatocytter.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende Figur 3: Gatingstrategi for separasjon av levende, mannlige kjønnsceller av Ho-FACS av suspensjoner av enkelt-celledrev-testikler. Levende celler (PI negative) er sortert i henhold til Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) er identifisert ved å plotte direkte Hoechst-blå og rød fluorescensintensitet. En DNA-innholdsport brukes til å sortere celler basert på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) og tetraploid (4C). Celler i hver topp av histogrammet blir deretter sortert ved å plotte funksjonen av Hoechst blå og rød fluorescens. Toppholdige haploide celler kan deles i henhold til rekkevidden av Hoechst blå intensitet og representerer to subpopulasjoner av spermatider: forlengende spermatider (gate C ') og runde spermatider (gate C' '). SPG: Spermatogonia; ESPD: forlengende spermatider; RSPD: runde spermatider; SPC II:Sekundære spermatocytter; SPC I: Primære spermatocytter. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende Figur 4: Gatingstrategi for separasjon av levende hannkimceller av Ho-FACS av suspensjoner fra marsvin-testikulær enkeltcell. Levende celler (PI negative) er sortert i henhold til Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) er identifisert ved å plotte direkte Hoechst-blå og rød fluorescensintensitet. En DNA-innholdsport brukes til å sortere celler basert på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) og tetraploid (4C). Celler i hver topp av histogrammet blir deretter sortert ved å plotte funksjonen av Hoechst blå og rød fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundære spermatocytter; SPC I: Primære spermatocytter. Vennligst klikk her for å gjøre detWnload denne filen.

Supplerende Figur 5: Gatingstrategi for separasjon av levende, mannlige kjønnsceller av Ho-FACS av smågris testikulære enkeltcellesuspensjoner. Levende celler (PI negative) er sortert i henhold til Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) er identifisert ved å plotte direkte Hoechst-blå og rød fluorescensintensitet. En DNA-innholdsport brukes til å sortere celler basert på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) og tetraploid (4C). Celler i hver topp av histogrammet blir deretter sortert ved å plotte funksjonen av Hoechst blå og rød fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundære spermatocytter; SPC I: Primære spermatocytter. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende Figur 6: Undersøkelse av somatisk celleforurensningIon i Ho-FACS sorterte populasjoner. T-distribuert stokastisk naboinnlegg (t-SNE) plot på ca. 600 enkelt-celle transkriptom fra tre FACS subpopulasjonsporter (AB). På t-SNE-plottet representerer hvert punkt den unike posisjonen til en enkelt celle i et transkriptom-rom og hver celle er merket med sin FACS-subpopulasjons gate-opprinnelse (A). Visuell kvantifisering av spesifikke markører for celletypen på FACS single-cell t-SNE-plottet (B). Forurensning fra somatiske celler anslås å være mindre enn 5% og er ikke spesifikk for en Ho-FACS populasjonsport. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med tanke på den høyt konserverte kromatindynamikken under spermatogenese hos pattedyr, var målet med dette arbeidet å utvikle en protokoll for å isolere mannlige kimceller i forskjellige stadier av differensiering fra forskjellige pattedyrs testikulære vev ( figur 1 ). En av de største hindringene ved bruk av en enkelt arbeidsflyt til forskjellige dyremodeller er behovet for arterespesifikke tilpasninger, spesielt når det gjelder vevdissociasjonsprotokoller. Nåværende metoder er hovedsakelig avhengig av enzymatisk vevsfordøyelse og protokoller varierer ofte, også innen art 12 . For å overvinne dette problemet viser protokollen beskrevet her anvendelsen av mekanisk vevsdissociasjon for å oppnå enkeltcellesuspensjoner fra testikulære prøver av forskjellige pattedyrsarter. Resultatene indikerer at mekanisk dissosiasjon av fersk testikkelvev med dette systemet virker bra ( Figur 2A -2B 20 . Det er viktig at Hoechst-farging ikke ser ut til å påvirke kvaliteten på enkeltcellesuspensjonene betydelig. Selv om mer celleklumping er synlig i flekkede prøver ( figur 2B ), kan behandling med DNase ( Figur 2D ) eller NDA 20 bidra til å forhindre dette problemet. Tidligere rapporter tyder på at mekanisk dissosiasjon av testikkelvev er bedre enn eller like effektivt som enzymatisk vevsfordøyelse 5 , 20 . I samsvar med dette indikerer dataene at mekanisk dissosiasjon er en pålitelig metode for å oppnå enkeltcellesuspensjoner fra testikkelvev for Ho-FACS-behandling.

Inkubasjon med Hoechst er et avgjørende trinn da det påvirker signalet detektert under flytcytometri. Lang perioder med farging gir bedre diskriminering av kimcelletyper, menKan være toksisk, noe som resulterer i celledød og endringer i intracellulær programmering 22 . Brukere som har tenkt å etablere kimcellekulturer med denne metoden, bør evaluere den genotoksiske effekten av langtidsexponering for Hoechst 3 , 22 og bestemme tilstrekkelig konsentrasjon og tid for farging. Her var 30 minutter med farging tilstrekkelig til å gi pålitelig separasjon av bakteriepopulasjoner ( Figur 3B -3C ). Varigheten av farging kan potensielt reduseres til 10 minutter, som vist av Rodriguez-Casuriaga, et al. 20 , og bør evalueres ytterligere av brukere av arten av interesse.

Som hypoteser kan fire bakteriepopulasjoner konstant oppdages - SPG, SPC I, SPC II og SPD - basert på kromatinvariasjoner av bakterieceller fra de forskjellige arter som er testet ( Figur 3B -3C tabell 1 ), og støtter gatingstrategien som ble vedtatt i denne arbeidsflyten ( figur 1 ) for forskjellige pattedyrsarter ( supplerende figurer 2- 5 ). Det er imidlertid tilrådelig at brukerne optimaliserer gaten i henhold til arten og populasjonene av interesse for å redusere krysskontaminasjonen som oppdages for noen av populasjonene (Tabell 1). Dette kan oppnås ved lengre inkubasjonsperioder under farging18 , redusert strømningshastighet 2 og reduserte portstørrelser. SPG er mer utfordrende å isolere siden de er den sjeldneste celletypen i testene og også på grunn av fargestrømning over tid 1 , 15 . Selv om det er mulig å oppdage forskjellige SPG-populasjoner av Ho-FACS, som vist her, ville studier som fokuserer utelukkende på stamcellebiologi, dra nytte av en strengere teknikk som magnetisk aktivert cellesortering (MACS; 23 ). Spesielt kan subpopulasjoner av SPD (eSPD og rSPD) tydelig skille seg fra hunden, men ikke for andre arter ( figur 3C og tilleggs figur 3). Potensielt kan disse underpopulasjonene løses ved å justere gatinginnstillingene, som beskrevet av forfatterne for musen 5 . Cytogrammer generert for cellestørrelse og granularitet (FSC VS SSC), før plotting funksjonen av Hoechst blå / rød fluoresceNCE, diskriminerer forlengelse (lav FSC + SSC), fra runde (høy FSC + SSC) spermatid subpopulations. Separasjon av runde og langvarige spermatidpopulasjoner vil tillate en mer grundig undersøkelse av spermiogenese, noe som gir ny innsikt i spesifikke molekylære hendelser som oppstår under spermedifferensiering. Også, som beskrevet for musen 1 , 2 , 12 , er det også mulig å oppnå ytterligere oppløsning av meotiske stadier ved å justere FACS-portene. Slik tilnærming vil i stor grad være til fordel for komparative studier av meiotiske hendelser. Selv om celleintegriteten forstyrres under Ho-FACS, oppnås enkeltcellet RNA-sekvenseringsdata oppnådd for celler sortert med denne metoden (Jung et al. , Ikke offentliggjort , Supplemental Figur 6 ) at dette er en pålitelig tilnærming til å skaffe celler til molekylære studier av bakterieceller biologi. Ikke desto mindre, brukere som har til hensikt å utføre reproduktive analyser, for eksempel rOst spermatid injeksjon (ROSI), ved hjelp av celler isolert av Ho-FACS må vurdere levedyktighet av sorterte celler og vil kanskje utforske alternative metoder 24 , 25 .

Sammendrag beskriver dette arbeidet en standardisert metode for å isolere testikulære bakterieceller fra forskjellige pattedyr, bygge og legge til forbedringer på tidligere etablerte teknikker 2 , 12 , 20 . Slike standardisering tillater bruk av ett sett med reagenser og en enkelt arbeidsflyt på forskjellige pattedyrarter, som letter datagenerering for komparative studier av kimcellebiologi. Også, mekanisk vevsdissociasjon overvinter forhindringen av artsspesifikke tilpasninger som kan introdusere metodisk variabilitet som nesten ikke er mulig å redegjøre for. I tillegg begrenser den reduserte kjøretiden og manipuleringen forstyrrelser av ex vivo- cellenLular fysiologi til et minimum. I denne forbindelse er Ho-FACS betydelig vesentlig sammenlignet med andre metoder for bakteriell isolasjon, som STA-PUT og elutriation 6 , 7 . Videre er samtidig separasjon av 4 bakteriepopulasjoner i samme eksperiment kun mulig av FACS. Gitt egenskapene til Hoechst-fargestoffet, blir cellestruktur og RNA-arter bevart, og derfor kan celler brukes til videre nedstrøms molekylære studier. Viktig, siden Ho-FACS er avhengig av kromatinattributter for å diskriminere kimcelletyper, støtter den vellykkede ytelsen av denne arbeidsflyten i 5 forskjellige arter sterkt sin anvendelse på andre pattedyr. Resultatene som presenteres her antyder at spermatogenese kan være en unik prosess med celledifferensiering som kan håndteres i mange pattedyrarter ved bruk av en enkelt protokoll. Som sådan, i "omics" og systembiologi-æraen, gir denne teknologien midler til en evolusjonær appRoach på spørsmål om mannlig bakteriebiologi, inkludert studier av epigenetikk, regulering og proteindiversitet gjennom spermatogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) for hundetestene; Jason Arand og Dr. Ted Cicero's lab ved Washington University i St. Louis (WashU) for å levere rotte testikler og Brianne Tabers for å bistå med samlingen; Jared Hartsock og Dr. Salt's Lab at WashU for marsvin testes; Og Dr. Michael Talcott ved divisjonen for Comparative Medicine at WashU for miniatyr gris testis. Forfatterne anerkjenner også Alvin J. Siteman Cancer Center ved Washington University School of Medicine og Barnes-Jewish Hospital i St. Louis, MO, for bruk av Siteman Flow Cytometry Core, som ga personale-operert cellesorteringstjeneste. Siteman Cancer Center støttes delvis av NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.

Denne forskningen ble finansiert av et FCT-doktorgradsstudium [SFRH / BD / 51695/2011 til ACL], tilskudd fra USAs institusjoner for helse [R01HD078641 og R01MH101810 til DFC] og en FCT forskningskontrakt [IF / 01262/2014 til AML].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde VWR #15710 4% PFA, For fixing sorted cells
Medimachine BD Biosciences #340588; System for testis dissociation
1X Dulbecco modified Eagle medium Life Technologies #31053 DMEM, for testis dissociation
Medicon BD Biosciences #340591 Disaggregation cartridge for testis dissociation
Fetal bovine serum Thermo Scientific #10082139 FBS, for FACS collection
Hoechst 33342 Invitrogen #H3570 Hoecsht, For FACS staining
40 µm cell strainer GREINER BIO-ONE #89508-342 For testis dissociation
100x 15 mm petri dish Falcon #351029 For testis dissection
5 mL polypropylene round-bottom tubes Falcon #352063 For FACS collection
1.5 mL Eppendorf tubes VWR #20170-650 For FACS collection
3 mL needless syringe BD Biosciences #309657 For testis dissociation
50 mL conical tube MIDSCI #C50R For testis dissociation 
Propidium Iodide Invitrogen #L7011 PI, For FACS staining
MoFlo Legacy cell sorter Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Summit Cell Sorting software Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Phosphate buffered saline Thermo Scientific #AM9625 PBS, For microscopy
Microscopic glass slide Fisher Scientific #12-544-4 For microscopy
Glass coverslip Fisher Scientific #12-548-87 For microscopy
Disposable transfer pipette (3 mL) Samco Scientific #225 For testis dissociation
DNase I Roche #10104159001 For testis dissociation
Carbon steel surgical blade Miltex #4-111 For testis dissection
Countess automated cell counter Invitrogen #C10227 For automatic cell counting
Trypan blue solution (0.4%) Sigma #T8154 For viability staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 125 komparativ reproduksjon fluorescensaktivert cellesortering (FACS) Hoechst-33342 mannlige kimceller mekanisk dissosiasjon spermatogenese testis,
En standardisert tilnærming til multispecies Rensing av mammaliske mannlige kimceller ved hjelp av mekanisk vævsdissosiasjon og flytcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J.,… More

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J., Usmani, A., Lopes, A. M., Conrad, D. F. A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55913, doi:10.3791/55913 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter