Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55913
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا العمل توحيد طريقة للحصول على السكان الخلايا الجرثومية المنقى من الأنسجة الخصية من أنواع الثدييات المختلفة. وهو بروتوكول مباشر يجمع بين التفكك الخصية الميكانيكية، تلطيخ مع هويشت-33342 و يوديد بروبيديوم، و فاكس فرز، مع تطبيقات واسعة في الدراسات المقارنة للبيولوجيا التناسلية للذكور.

Abstract

كان الفلورسنت تنشيط الخلايا الفرز (فاكس) واحدة من الطرق المفضلة لعزل السكان المخصب من الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات. حاليا، فإنه يسمح للتمييز ما يصل إلى 9 الفئران السكان الخلايا الجرثومية مع ارتفاع الغلة والنقاء. هذا عالية الدقة في التمييز والتنقية ممكنة بسبب التغيرات الفريدة في هيكل الكروماتين وكمية طوال الحيوانات المنوية. ويمكن التقاط هذه الأنماط عن طريق التدفق الخلوي للخلايا الجرثومية الذكور ملطخة الأصباغ الحمض النووي ملزم الفلورسنت مثل هويشت-33342 (هويشت). هنا هو وصف مفصل للبروتوكول وضعت مؤخرا لعزل الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات. باختصار، يتم إنشاء تعليق خلية واحدة من الأنسجة الخصية عن طريق التفكك الميكانيكية، ملطخة مزدوجة مع هويشت و يوديد بروبيديوم (بي) ومعالجتها عن طريق التدفق الخلوي. استراتيجية التسلسلي التسلسلي، بما في ذلك اختيار الخلايا الحية (بي سلبية) مع محتوى الحمض النووي مختلفة (كثافة هويشت)، طs المستخدمة خلال فرز فاكس لتمييز ما يصل إلى 5 أنواع الخلايا الجرثومية. وتشمل هذه الحالات، مع متوسط ​​النقاء المقابلة (يحددها الفحص المجهري): سبيرماتوغونيا (66٪)، الابتدائي (71٪) والثانوية (85٪) الحيوانات المنوية، والحيوانات المنوية (90٪)، فصل أكثر إلى جولة (93٪) واستطالة (87٪). تنفيذ سير العمل بأكمله هو واضح، ويسمح لعزل 4 أنواع الخلايا في وقت واحد مع الجهاز فاكس المناسبة، ويمكن أن يؤديها في أقل من 2 ساعة. كما خفض وقت المعالجة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على علم وظائف الأعضاء من خلايا الجسم الحي السابقين ، وهذه الطريقة مثالية للدراسات المصب عالية الإنتاجية من الذكور البيولوجيا الخلية الجرثومية. وعلاوة على ذلك، بروتوكول موحد لتنقية متعددة الطبقات من الخلايا الجرثومية الثدييات يلغي المصادر المنهجية للمتغيرات ويسمح لمجموعة واحدة من الكواشف لاستخدامها لنماذج حيوانية مختلفة.

Introduction

ونظرا لعدم وجود نظام في المختبر ممثل تطور الحيوانات المنوية، وجود عدم التجانس الخلوية كبيرة في خصية، دراسات بيولوجيا الخلية الجرثومية الذكور تتطلب تقنيات قوية لعزل السكان المخصب من أنواع الخلايا المحددة. وقد استخدمت على نطاق واسع الفرز خلية مضان (فاكس) لهذا الغرض 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، كما أنه يوفر عالية الغلة والنقاء، ويفوق أساليب العزلة الأخرى في عدد أنواع الخلايا الجرثومية التي يمكن التعرف عليها و حدد 6 ، 7 ، 8 . ويستند مبدأ تحليل التدفق الخلوي على الكشف عن أنماط ضوء التفاضلية التالية شعاع الليزر الإثارة من خلايا واحدة. كما يمر خلية من خلال الليزر فإنه يعكس / ينثر الضوءفي جميع الزوايا، يتناسب مع حجم الخلية (مبعثر إلى الأمام؛ فسك) وإلى تعقيد الخلايا (الجانب مبعثر؛ سك). انظر أورميرود 9 للحصول على معلومات مفصلة عن التدفق الخلوي.

والخلايا الجرثومية الذكور تخضع تعديلات محددة في محتوى الحمض النووي، هيكل الكروماتين، وحجم وشكل في جميع مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية. وهكذا، يمكن تحديد السكان خلية متميزة وفصلها عن طريق الجمع بين تشتت الضوء وتلطيخ الحمض النووي مع الأصباغ الفلورية 10 ، 11 . العديد من الأصباغ يمكن استخدامها لهذا الغرض (استعرض في جيسينجر و رودريجيز كاسورياغا 3 )، مثل هويشست-33342 (هويشست) التي كثيرا ما تستخدم في تحليل التدفق الخلوي للخلايا الخصية للعقد الماضي 1 ، 2 ، 4 ، 10 ، 12 . UPOن الإثارة مع الأشعة فوق البنفسجية ضوء، هويشت تنبعث مضان الأزرق يتناسب مع محتوى الحمض النووي الخلوي في حين يعكس مضان أحمر بعيدة التباين في هيكل الكروماتين والضغط 1 ، 13 ، 14 . ونتيجة لذلك، الخلايا الجرثومية الذكور في مراحل مختلفة من التمايز تظهر أنماط محددة خلال فاكس من هويست الملون تعليق خلية واحدة (هو-فاكس، 1 ، 12 ). ومن المثير للاهتمام، ويرجع ذلك إلى آلية إفلوكس صبغ التي هي نشطة فقط خلال مرحلة سبيرماتوغونيال، شدة هويشت مضان الأزرق لا يتناسب مع محتوى الكروماتين في هذه الخلايا، وأنها تجمع كجانب جانب خلال هو-فاكس 15 . بالإضافة إلى ذلك، الجمع بين تلطيخ هويشست مع يوديد بروبيديوم يبيدي صبغ (بي) يسمح للمستخدمين للتمييز الحية (بي سلبية) من الخلايا الميتة (بي إيجابية) خلال فاكس 1 <سوب>، 2 ، 10 ، 12 . وقد استخدمت هذه الاستراتيجية سابقا في تحليلات سايتوميتريك تدفق الخلايا الجرثومية الخصية والأمثل على نطاق واسع في الماوس لتمييز ما يصل إلى 9 أنواع الخلايا الجرثومية، بما في ذلك الخلايا في 4 مراحل مختلفة من الانقسام الاختزالي I 1 ، 2 ، 4 ، 16 . لغرض هذا العمل، تلطيخ هويشت ثلاث مزايا رئيسية. أولا، تم تطبيق هو-فاكس بنجاح لعزل الخلايا الجرثومية الذكور في نموذج الماوس 1 ، 2 ، 12 ، والقوارض الأخرى مثل الفئران وخنزير غينيا 17 ، 18 ، 19 . ثانيا، هوشست هو صبغ خلية متخلل ولا يتطلب بيرمابيليزاتيون غشاء، لذلك بريزرفيس سلامة الخلية. وأخيرا، لا حاجة إلى العلاج ريبونوكلياز منذ ربط هويشت تفضيلي لتسلسل الحمض النووي بولي (د [أت]) 1 ، 20 ، مما يعني أنه يتم الحفاظ على الحمض النووي الريبي، بالإضافة إلى الحمض النووي والبروتينات، ويمكن استخدامها لمزيد من الدراسات الجزيئية المصب من الجرثومة تمايز الخلايا.

على الرغم من التشابه في الحمض النووي بلوادي و / أو ستينابيليتي لوحظ في تحليلات التدفق الخلوي من أنواع الثدييات (استعرض في جيسينجر و رودريجيز كاسورياغا 3 )، كان هناك قدر كبير من التباين في البروتوكولات الموصوفة لعزل الخلايا الجرثومية الذكور عن طريق التدفق الخلوي. وقد استخدمت دراسات مختلفة بروتوكولات محددة لتفكك الأنسجة، واستخدمت الأصباغ ملزم الحمض النووي متميزة (وحدها أو في تركيبة) واستراتيجيات فاكس التزوير في الكائنات نموذج مختلف، أساسا الماوس والفئران وخنزير غينيا. ومن ثم، فإن المقارنة المباشرة بين البيانات التي تم جمعها لمختلف الأنواع يمكن أن تتأثر بالتبغوذلك بسبب التباين بين المنهجيات. الأهم من ذلك، فإن حفظ مذهل للديناميات لونين في جميع أنحاء الحيوانات المنوية الثدييات (2N-4N-2N-1N) يشير إلى أن بروتوكول موحد يمكن تطبيقها بشكل عرضي على مجموعة متنوعة من أنواع الثدييات.

وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير سير عمل واحد ينطبق على أنواع الثدييات المختلفة، من خلال الجمع بين وتكييف التقنيات المنشورة سابقا 2 ، 20 . تم تحقيق توحيد طريقة لمعالجة الأنسجة من خلال أداء التفكك الميكانيكية للتغلب على الحاجة إلى تعديلات محددة الأنواع المطلوبة للهضم الأنزيمي 5 . ومن الجدير بالذكر أن تفكك الميكانيكية من الأنسجة القوارض الخصية وقد ثبت أن أداء أفضل من الأنزيمية الهضم الأنسجة 20 و هو-فاكس من تعليق خلية واحدة الناتجة عن كل من الطرق المعرضنتائج مماثلة 5 . كدليل على المبدأ، يصف هذا البروتوكول الإعدادات المستخدمة لعزل ما يصل إلى 5 السكان الخلية الجرثومية: سبيرماتوغونيا (سبغ). (سيك I)، والحيوانات المنوية الثانوية (سيك إي)، والحيوانات المنوية (سبد) - جولة (رسبد) واستطالة (إسبد). الأهم من ذلك، فمن السهل أن تنفذ في المختبر، مع المتطلبات الرئيسية يجري نظام تفكك الأنسجة والوصول إلى فارز الخلية مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. هذا سير العمل ( الشكل 1 ) سريع ومباشر ويسمح العزلة في وقت واحد من 4 السكان الخلايا الجرثومية من الأنسجة الخصية الطازجة في أقل من 2 ساعة. ويعد وقت المعالجة المخفض أمرا حاسما للحفاظ على سلامة الخلوية لمزيد من الإجراءات النهائية. وعلاوة على ذلك، فإن أدائها الناجح في 5 أنواع مختلفة تشير إلى أنه يمكن تطبيقها على نطاق واسع داخل كليد الثدييات، مما يجعلها الطريقة المثلى لعزل الخلايا الجرثومية لدراسات مقارنة من الثدييات التناسلية للذكور الثديياتفوتوني؛.

ويتكون هذا البروتوكول من ثلاثة أقسام رئيسية، وبصرف النظر عن الخطوات التحضيرية: (1) التفكك الميكانيكي للأنسجة الخصية و (2) تلطيخ الخلايا الخصية مع هويشت و بي، تليها (3) فاكس فرز الخلايا المنوية ذات الصلة. مرة واحدة التي تم جمعها، وهذه المجموعات المخصبة من مختلف الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات. يصف هذا البروتوكول "واحد الحجم يناسب الجميع" طريقة التفكك لتنقية الخلايا الجرثومية الذكور من العديد من أنواع الثدييات المختلفة. اعتمادا على نوع من مستخدمي الدراسة ترغب في إجراء مع الخلايا الجرثومية المعزولة، وسائل الإعلام الأخرى أو المخازن المؤقتة يمكن استخدامها. الخطوات بروتوكول التالية هي لتوليد تعليق خلية واحدة من الخصية الفئران كله.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات الموضحة أدناه تمتثل للوائح لجنة الدراسات الحيوانية في جامعة واشنطن في سانت لويس.

1. الاستعدادات لبروتوكول التفكك الميكانيكية

  1. قبل الرطب و 50 ميكرون المتاح الأنسجة خرطوشة التفريق للتفكك الخصية الفئران كله.
    ملاحظة: يحتوي هذا الخرطوشة المصنوعة من الأنسجة القابل للتصرف على ميكروبلادس مصممة لقطع الأنسجة وشبكة من الصلب غير متحرك مع ما يقرب من 100 ثقوب سداسية. أحجام مختلفة من شبكة للخرسانة تصنيف الأنسجة المتاحة للتكيف مع هذا البروتوكول على أساس الأنواع وأنواع الخلايا المطلوبة. تم استخدام 50 خرطوشة ميكرون لجميع أنواع الثدييات المذكورة في هذه الورقة.
    1. تحميل 1 مل من الجليد الباردة الفينول الأحمر الحرة 1x دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) على 50 ميكرون المتاح خرطوشة الأنسجة التخلص.
      ملاحظة: الفينول الأحمر قد تتداخل مع الكشف عن فلوريس الحمراءخلال فترة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    2. نضح 1X دمم من خرطوشة تصنيف الأنسجة مع المتاح 3 مل إبرة أقل حقنة من ميناء حقنة.
  2. بدوره على نظام تصنيف الأنسجة عن طريق الضغط على زر "أون". هذا النظام لا يتطلب "الاحماء" الوقت.
  3. قبل الرطب ثلاثة 40 ميكرون مرشحات المتاح مع الجليد الباردة 1X دمم. وضع كل 40 ميكرون مرشح القابل للتصرف على أنبوب مخروطي 50 مل. ماصة 1 مل من 1X دمم والسماح تمر من خلال السائل.
  4. إعداد 100 مم × 15 ملم طبق بتري لجمع الأنسجة الخصية. ماصة 500 ميكرولتر من دمم 1X على طبق بتري.

2. إعداد الأنسجة الخصية لبروتوكول التفكك الميكانيكية

  1. تشريح الماوس الذكور لإزالة بعناية الخصيتين كلها جديدة أو شظايا الخصية (إذا التعامل مع أنواع الثدييات الأخرى) مع مقص جراحي وملقط.
    ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة خالية من الدهون ونخر. الاب إيش الأنسجة الخصية تولد متفوقة واحدة خلية نوعية تعليق من الأنسجة المجمدة.
    1. نقل التي تم جمعها الخصيتين / شظايا إلى 100 مم × 15 مم طبق بتري ملم تحتوي على 500 ميكرولتر من دمم 1X.
    2. شطف بلطف الأنسجة في دمم 1X لإزالة خلايا الدم الحمراء (إذا كان موجودا).
  2. إزالة بعناية الغلالة البيضاء الغلالة. سوف سمك الغلالة البيضاء الغلالة تختلف في أنواع مختلفة.
    1. الاستيلاء على نهاية واحدة من الخصية مع ملقط.
    2. ثقب الطرف الآخر من الخصية مع مشرط في حين لا يزال عقد نهاية واحدة من الخصية مع ملقط من الخطوة السابقة.
    3. كشط الأنابيب الخصية باستخدام مشرط في حين لا يزال عقد نهاية واحدة من الخصية مع ملقط من الخطوة 2.2.1.
  3. قطع الأنابيب الخصية إلى قطع من ~ 2-3 مم 3 باستخدام مشرط.

3. الحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق التفكك الميكانيكية من الأنسجة الخصية

أونتنت "> ملاحظة: خطوات التفكك الموصوفة أدناه هي لخصية الفأر البالغة، وينبغي تعديل أحجام الأنسجة الخصية من الفئران الأحداث أو الأنواع غير الفئران وفقا لذلك، وقد لا تحتوي حيوانات الأحداث على جميع مراحل الخلايا الجرثومية، وبعض أنواع الثدييات لديها يتغير تكوين الأنسجة الخصية خلال مواسم التربية مقارنة بموسم غير التزاوج.

  1. نقل قطع صغيرة أنبوبي الخصية إلى قبل تبلل 50 ميكرون خرطوشة الأنسجة تصنيف باستخدام ملقط وإضافة 1 مل من 1X دمم.
  2. تحميل خرطوشة تصنيف الأنسجة إلى نظام تقسيم الأنسجة وعملية لمدة 5 دقائق عن طريق تحويل مقبض الباب من "الاستعداد" إلى "تشغيل" واسطة.
  3. إزالة خرطوشة تصنيف الأنسجة من نظام تقسيم الأنسجة ونضح تعليق خلية مع المتاح 3 مل إبرة أقل حقنة من ميناء حقنة.
    1. نضح عدة مرات لإزالة جميع السائل من الأنسجة خرطوشة التفريق. ليسكل من 1 مل يمكن استردادها من خرطوشة تقسيم الأنسجة.
  4. تمرير تعليق خلية يستنشق من خلال اثنين من المتاح قبل تبلل مرشحات 40 ميكرون. تصفية مرتين لإزالة أي مجاميع الخلية.
    1. وضع واحد قبل تبلل 40 ميكرون مرشح في أنبوب مخروطي 50 مل. مباشرة إضافة خلايا يستنشق في حقنة على مرشح 40 ميكرون. ماصة تمر من خلال تعليق خلية واحدة مع ماصة المتاح.
    2. إزالة المستخدمة قبل تبلل 40 ميكرون تصفية ووضع آخر قبل تبلل 40 ميكرون تصفية في أنبوب مخروطي 50 مل. ماصة التي تم جمعها تعليق خلية واحدة على نظيفة 40 ميكرون مرشح.
    3. جمع تصفيتها تعليق خلية واحدة مع ماصة المتاح نظيفة.
  5. ماصة تصفية خلية تصفيتها العودة إلى 50 ميكرون الأنسجة خرطوشة تصنيف وعملية لمدة 5 دقائق أخرى في نظام تصنيف الأنسجة.
  6. استعادة كل السائل من الأنسجة ديسغراتيعلى خرطوشة.

4. تلطيخ مع هويشت و بروبيديوم يوديد (بي)

  1. نقل استرداد الخلية المستردة من 50 ميكرون خرطوشة الأنسجة تصنيف إلى أنبوب 1.5 مل نظيفة. سيتم استرداد ما يقرب من 1-1.5 مل من تعليق خلية واحدة.
  2. تقسيم تعليق خلية واحدة المستردة في أربعة 1.5 مل أو 5 مل أنابيب.
    1. للأنابيب الثلاثة الأولى، ماصة 150 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة وماصة بقية تعليق خلية واحدة في الماضي من الأنابيب الأربعة (ما يقرب من 550 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة).
      ملاحظة: كمية تعليق خلية واحدة في أنبوب الماضي قد تختلف على أساس كفاءة الانتعاش تعليق الخلية في الخطوة 3.6.
  3. تعيين أنبوب الأول من الأنابيب الأربعة كسيطرة غير ملوثين لدورة فاكس.
  4. إعداد صبغة واحدة ملطخة (بي أو هويشت) تعليق الخلية كما الضوابط. إضافة 2.5 ميكرولتر من هويشت أو 1 ميكرولتر من بي إلى كل أنبوب (الثاني والثانيالثالثة).
  5. إعداد أنبوب ملون مزدوج. سيتم استخدام هذا لجمع المجموعات السكانية الفرعية الخلية الجرثومية. إضافة 2.5 ميكرولتر من هويشت و 1 ميكرولتر من بي إلى أنبوب الماضي.
    ملاحظة: هوشست لديه الصلاحية من 2-3 أشهر. استخدام مخزونات أقدم من الصبغة سوف يسبب تغييرات كبيرة خلال جلسة فاكس.
  6. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. وضع عينات في مدورة أنبوب أو عكس أنابيب 1.5 مل كل 5-10 دقائق.
  7. تصفية خلية تعليق مع قبل مبلل 40 ميكرون مصفاة والحفاظ على حل تصفيتها على الجليد وفي الظلام حتى جلسة فاكس.
    ملاحظة: خطوة الترشيح ضرورية لمنع كتل الخلايا ل فاكس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العلاج مع الدناز (انظر الشكل 1 ) أو 2-نافثول-6،8 ديسولفونيك حامض ديبوتاسيوم الملح (ندا 20 ) للحد من تراص الخلايا. سوف فترات الانتظار لفترات طويلة تؤثر على إشارة الفلورسنت الكشف خلال فاكس ويمكن أن يؤدي إلى زيادة موت الخلايا.

    5. مضان تنشيط الخلايا فرز (فاكس) إعداد وتنقية الخلايا الخصية

    1. إعداد فاكس جمع الأنابيب.
      1. معطف 5 مل أنابيب البولي بروبلين جولة القاع أو أنابيب 1.5 مل مع 400 ميكرولتر من فبس لجمع الخلايا. صب فبس الزائد بعد طلاء.
      2. إضافة فاكس جمع المتوسطة (1X دمم + 10٪ مصل الأبقار الجنين، فبس) إلى أنابيب: 1 مل ل 5 مل أنابيب أو 100 ميكرولتر ل 1.5 مل أنابيب.
    2. إعداد شروط الفرز المناسبة في فارز الخلية والبرمجيات.
      ملاحظة: آلات فرز الخلايا الأخرى وبرامج التحليل يمكن استخدامها مع استراتيجيات الإعداد والابتسامة مماثلة الموضحة أدناه. تم تكييف الظروف الموصوفة هنا من غايسنسكايا وبورتفين 2 ، جيسينجر ورودريجيز كاسورياغا 3 ، وجيتون، وآخرون. 4
      1. تحميل ليزر الأشعة فوق البنفسجية مع 463/25 نانومتر الفرقة تمرير مرشح للكشف عن هويشت الأزرق و 680 نانومتر لب باند تمرير مرشح للكشف عن هويشت الأحمر وكشف بي.
      2. استخدام مرآة مزدوج اللون 555DLP لتمييز الأزرق من مضان أحمر.
      3. استخدام 70 ميكرون فوهة وفرز الخلايا بمعدل 1000-2000 خلية / ثانية.
        ملاحظة: كفاءة الفرز يتأثر مباشرة من معدل التدفق. ارتفاع معدلات التدفق (> 3500 الأحداث / ق) زيادة سرعة الفرز ولكن يؤدي إلى تلوث السكان. انظر المرجع 12 للحصول على مزيد من المعلومات.
    3. تعيين بوابات باستخدام عينات السيطرة.
      1. تحميل وتشغيل عينة غير ملوثين.
      2. يستبعد حطام الخلية استنادا إلى نمط فسك مقابل مخطط سك. سوف الحطام الخلية يطفو على السطح في الربع السفلي الأيسر من المؤامرة. تعسفا تعيين عتبة الحطام الخلية من قبل المستخدم أو فني فارز الخلية.
      3. بوابة على خلايا واحدة عن طريق ضبط عتبة ل فسك وعرض النبض. فارز الخلايا المختلفة لها طرق مختلفة للتمييزغويش سينغليتس. كما يعكس عرض النبض الوقت الخلايا تأخذ لعبور الليزر، خلايا واحدة لها قيم أقل بالمقارنة مع المجاميع متعددة الخلايا. ويمكن استخدام ضبط العتبة على مؤامرة من أجل عرض فسك مقابل النبضة لتحديد سينغليتس.
      4. تعيين الأمثل أنبوب المضاعفات الضوئية (بمت) الفولتية.
      5. استخدام كل من ملونين وصبغ واحد ملون الخلايا لإنشاء عتبة بي أو هويشت إشارة مضان.
        ملاحظة: من المهم لتحسين الفولتية بتم الأساسية لخلايا الفائدة من أجل إنشاء مجموعة مضان المناسبة لكل صبغ. هذا أمر بالغ الأهمية للكشف عن إشارة الأمثل والحساسية. يتم استخدام خلايا التحكم الملون غير الملوث وحيدة لتأسيس مجموعة من الخلايا الملوثة سلبا وإيجابيا مع بي و / أو أصباغ هويشت وتقليل الضوضاء في الإشارات. لمزيد من التفسيرات حول الأمثل من الجهد بمت باستخدام خلايا التحكم، يرجى الرجوع إلى غايسنسكايا وبورتفين 2
      6. بوابة، عن، الخلية الحيةs استنادا إلى تلطيخ بي (بي سلبية) و فسك مؤامرة. الخلايا الميتة تكون إيجابية ل بي مضان.
      7. تعيين بوابة محتوى الحمض النووي عن طريق التآمر رسم بياني من التهم الخلية استنادا إلى مضان الأزرق هويشت. 3 قمم مع زيادة تركيزات هويشت مضان الأزرق يجب أن تظهر، وتمثل هابلويد (1C)، ديبلويد (2C)، وخلايا رباعي رباعي (4C) الخلايا. تعيين 3 بوابات، واحدة لكل ذروة.
      8. مراقبة ما لا يقل عن 500،000 الأحداث على فسك مقابل مؤامرة سك قبل الشروع في التباعد على السكان الخلية الجرثومية.
    4. بوابة مختلف السكان الخلايا الجرثومية.
      1. تحميل هوشست / بي ملون عينة.
      2. تعيين أول 3 بوابات الأم المشتركة بين جميع السكان.
        1. استبعاد الحطام الخلية على أساس فسك مقابل مؤامرة سك. حدد سينغليتس استنادا إلى فسك مقابل مؤامرة نبض العرض. حدد الخلايا الحية عن طريق النابضة بي الخلايا السلبية.
      3. تحديد بوابة سبيرماتوغونيا.
      4. مؤامرة بي الخلايا السلبية على أساس هويشت الأزرق والأحمر مضانشدة. تظهر سبيرماتوغونيا كما السكان الجانب (انظر الشكل 1 ).
      5. تحديد بوابات للسكان الخلية الجرثومية المتبقية. ملاحظة: راجع الشكل 1 والشكل التكميلي 2 للتفاصيل البصرية.
      6. مؤامرة بي الخلايا السلبية في بوابة محتوى الحمض النووي.
        1. ل سبيرماتيدس بوابة الذروة مع أدنى هويشت مضان (1C).
        2. للحيوانات المنوية إي، بوابة ذروة مع مضان هويشت المتوسطة (2C).
        3. للحيوانات المنوية I، بوابة ذروة مع أعلى مضان هويشت (4C).
      7. مؤامرة هويشت الأزرق والأحمر مضان شدة لصقل الحيوانات المنوية والسكان الحيوانات المنوية السكان من بوابات محتوى الحمض النووي.
    5. جمع بوابات سكانية مختارة في أنابيب جمع أعدت سابقا. وسوف يستغرق كل الخصية في المتوسط ​​45 دقيقة إلى 1.5 ساعة لجمع ما يقرب من 0.5-6.0 × 10 6 خلايا لكل سكان فرعية.
      ملاحظة: التعرض لفترات طويلة خلية ل هويشست ماy تحول قليلا موقع السكان مع مرور الوقت. قم بتحديث الإعدادات بعد 20-30 دقيقة من فاكس. سوف يكون الحد الأقصى للمردود لكل فئة فرعية يتوقف على كفاءة خطوة التفكك.

    6. تقييم المجهري من الخلايا المنقى

    1. تدور الخلايا التي تم جمعها في 500-600 x ج في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. إعادة تعليق بيليه الخلية مع 1 مل من الجليد الباردة حل 1X الفوسفات العازلة (بس) أو دمم 1X.
      ملاحظة: يمكن تعديل حجم إعادة تعليق وفقا لعدد الخلايا فرزها والتركيز النهائي المطلوب.
    3. ماصة 40 ميكرولتر من الخلايا غسلها على شريحة زجاجية نظيفة ووضع ساترة.
    4. إصلاح الخلايا المتبقية مع بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) وتخزين الخلايا الثابتة في 4 درجات مئوية في الظلام للرجوع إليها في المستقبل.
      1. ماصة 100 ميكرولتر 4٪ بفا مباشرة في أنابيب جمع.
      2. دوامة لفترة وجيزة الأنابيب أو ماصة بضع مرات لضمان حسن خلط تعليق الخلية.
    5. تصور الشرائح أعدت في المجهر مجهزة مصباح الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن مضان هويشت تحت الهدف 63X. الرجوع إلى قسم النتائج - تقييم مورفولوجيك لسكان الخلايا الجرثومية فرزها - لمزيد من التفاصيل حول كيفية تحديد أنواع الخلايا الجرثومية محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تعليق خلية واحدة من التفكك الميكانيكي للأنسجة الخصية

الشكل 2 يقارن تعليق خلية واحدة التي حصل عليها التفكك الميكانيكية من الأنسجة الخصية الماوس تحت ظروف مختلفة. العينات التي تم الحصول عليها عن طريق تجهيز الأنسجة الطازجة، غير ملوثين ( الشكل 2A ) أو ملطخة هويشت ( الشكل 2B )، وتظهر وجود خلايا واحدة في مراحل مختلفة من التمايز، والأهم من ذلك، يبدو الهيكل الخلوي للحفاظ عليها، بما في ذلك سوط من الحيوانات المنوية. على الرغم من أن بعض التكتل والحطام لوحظ في العينات الملون، والتي تم تخفيضها بإضافة الدناز بعد التفكك ( الشكل 2D )، تشير هذه النتائج إلى أن تلطيخ هويشت لا يغير كثيرا من نوعية تعليق خلية واحدة. ومن المثير للاهتمام، خلية واحدة تعليقويمكن أيضا الحصول على إنزونس من الأنسجة المجمدة للماوس ( الشكل 2C ) وأنواع الثدييات الأخرى - الفئران، الكلب، خنزير غينيا وخنزير صغير ( التكميلي الشكل 1 ) عن طريق التفكك الميكانيكي. أنواع الخلايا المختلفة مرئية ويمكن التعرف عليها في تلك العينات؛ ومع ذلك، وتجهيز الأنسجة المجمدة يبدو أن يؤدي إلى زيادة موت الخلايا وتكتل، وانخفاض إجمالي العائد الخلوي. على هذا النحو، فمن المستحسن للغاية لإعداد تعليق خلية واحدة من الأنسجة الطازجة لمزيد من التطبيقات المصب.

تم تقييم جودة تعليق خلية واحدة أعدت من الأنسجة الخصية الطازجة من الفأر، الفئران، الكلب، خنزير غينيا وخنزير صغير، خلال هو-فاكس ( الجدول 1 ). بعد استبعاد الحطام الخلوي، 95.7-98.4٪ من الخلايا هي سينغليتس، ومن تلك 86.5-93.8٪ على قيد الحياة، كما هو مبين من خلال القياس الكمي للخلايا السلبية بي (انظر البروتوكول ). هذه ريسولتيسي تشير إلى أن التفكك الميكانيكية هو وسيلة موثوق بها لإعداد تعليق خلية واحدة لتدفق الخلوي من الأنسجة الخصية من أنواع الثدييات المختلفة.

هو-فاكس لعزل الخلايا الجرثومية من الأنسجة الخصية من أنواع الثدييات المختلفة

بعد التفكك الميكانيكي، ملطخة تعليق خلية واحدة مع هويشت و بي ومعالجتها من قبل فاكس. كما ذكر أعلاه، تلطيخ هويشت يسمح التمييز من الخلايا في مراحل مختلفة من التمايز على أساس كمية الكروماتين وهيكل، في حين بي تلطيخ الخلايا غير بيرمابيليزد يفصل الحية من الخلايا الميتة. وبالتالي، بعد تصفية الحطام الخلية والمجاميع متعددة الخلايا، بوابة بي يختار الخلايا مع الأغشية سليمة (بي سلبية؛ الشكل 1 ). ثم يتم تحليل الخلايا الحية على أساس مضان هويشت: الأزرق يتناسب مع محتوى الحمض النووي وزيادة الأحمرمضان يعكس أقل لونين المكثف والتغيرات الهيكلية. على هذا النحو، ومن المتوقع أن الخلايا العنقودية الذكور من مراحل مختلفة لتكتل في مناطق محددة من التخطيطات الخلوية التآمر وظيفة الأزرق / الأحمر مضان هويشت ( الشكل 3A ).

في الواقع، والمؤامرات فاكس فاكس ولدت لأنواع مختلفة تظهر وجود سكان الخلية متميزة على أساس مضان هويشت ( الشكل 3B -3C ). على الرغم من أن هذه المؤامرات كافية لتمييز السكان الخلايا الجرثومية، ويمكن تعريف بوابة الحمض النووي (C) بوابة 2 للحد من التلوث المتبادل. يتم إنشاء هذه البوابة من قبل الرسم البياني من التهم الخلية في وظيفة هويشت شدة مضان الأزرق. لجميع الأنواع، ويمكن الكشف عن ثلاث قمم وتمثل الخلايا مع 1C، 2C و 4 C ( الشكل 1 والأشكال التكميلية 2-5 ). الجدير بالذكر، كما بريفيأوسلي المذكورة، سبيرماتوغونيا هي سكان الجانب ولا يمكن أن تكون بوابات موثوق بها على أساس الرسوم البيانية من محتوى الحمض النووي. وبالتالي، يتم بوابات هذه السكان بعد استبعاد الخلايا الميتة، استنادا إلى هويشت الأزرق / مؤامرات مؤلمة حمراء ( الشكل 1 ). يتم تمثيل هذه الاستراتيجية في الشكل 1 للفئران والأشكال التكميلي 2-5 للأنواع المتبقية. ومن المهم أن نلاحظ أنه منذ مضان هويشت وحدها يمكن أن تميز أنواع الخلايا الجرثومية المختلفة، وكلاهما بي و بوابات محتوى الحمض النووي اختيارية. وقد أدرجت في هذه الاستراتيجية لتحديد الخلايا الحية والحد من التلوث المتبادل، على التوالي. كما يلخص في الجدول 1 ، الكمي للخلايا في بوابة محتوى الحمض النووي يعكس النسبة النسبية للخلايا في مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية. كما هو متوقع، خلايا 1C هي الأكثر وفرة وتمثل الحيوانات المنوية، تليها خلايا 2C (سيك إي) وخلايا 4C (سيك I). Importaنتلي، يتم الحفاظ على هذا النمط عبر الأنواع والاختلافات الصغيرة قد تعكس التباين بين الاختلافات في الخلايا الجرثومية ودورات الظهارة المنوية 21 .

بعد هو-فاكس، ويمكن تقييم سلامة الخلية باستخدام تريبان تلطيخ الأزرق. تراوحت نسبة الخلايا الحية بعد 1 ساعة من نظام مراقبة الأصول الميدانية من 27٪ (سكب I) إلى 67٪ (سبد) للماوس، مما يشير إلى أن مدة الفرز والتعرض لهويشت تزيد من موت الخلايا. بالنسبة للمستخدمين الذين يبحثون عن ثقافة الخلايا فرزها، تركيز هويشت ومدة هو فاكس ينبغي تعديلها لتحسين بقاء الخلية. ومع ذلك، تم إنشاء بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي لخلايا واحدة معزولة باستخدام هذا الأسلوب (جونغ وآخرون ، غير منشورة)، مشيرا إلى أن هذه الخلايا هي مناسبة للدراسات الجزيئية لبيولوجيا الخلية الجرثومية. وقد استخدمت هذه المجموعة للكشف عن التلوث المحتمل للسكان الخلية الجرثومية مع الخلايا الجسدية ( الشكل التكميلي 6

تقييم مورفولوجيك من السكان الخلايا الجرثومية فرزها

كما خضعت الخلايا الجرثومية التغيرات المورفولوجية جذرية خلال الحيوانات المنوية، فمن الممكن لتقدير نقاء السكان معزولة عن طريق الفحص المجهري. كمرجع، يوضح الشكل 4 مورفولوجيا العامة من أنواع مختلفة من الخلايا الجرثومية الذكور من 4 أنواع الثدييات (من ليما، وآخرون 5 ). توزيع الكروماتين والتكثيف، وكذلك حجم الخلية والشكل، وتظهر أنماط فريدة من نوعها ومميزة بشكل جيد في أنواع مختلفة من الخلايا. سبغ لها هيتيروكروماتين بيريسينتريك متميزة، الذي البقع الزاهية ل هويشت، وهي صغيرة ومستديرة في الشكل (سبغ في الشكل 4B ). الخلايا المنوية هي أكبر حبيبات الخلايا. نواة سيك أنا يمكن التعرف عليها بسهولة، مع لونين فارياتيونس سمة من الخلايا الانتصارية (سيك I في الشكل 4B )، في حين أن سيك إي هي بينوكليتد أو في دياكينيسيس (سيك إي في الشكل 4B ). وأخيرا، سبد هي خلايا هابلواد صغيرة مع شكل مستطيل أو ممدود (سبد في الشكل 4B ). والجدير بالذكر أن رسبد مماثلة ل سبغ في الحجم والشكل، ولكن تميزت بوضوح من وجود كروموسنترز المحلية. واستنادا إلى هذه الخصائص، تم تقييم السكان الخلية فرزها لإثراء أنواع محددة من الخلايا ( الجدول 1 ). سبد و سيك إي السكان إثراء للغاية لنوع الخلية من الفائدة، في حين أن سيك الأول و سبغ أظهرت درجة من التلوث مع أنواع الخلايا الأخرى، وخاصة بالنسبة للخنازير غينيا وخنزير صغير عينات. ومن المثير للاهتمام، لعينة الكلب كانت استراتيجية النابضة كافية للتمييز جولة من استطالة النطفة ( الشكل 3C ، التكميلي الشكل 3 ؛ الجدول 1

شكل 1
الشكل 1: سير العمل من هو-فاكس العزلة من الخلايا الجرثومية الذكور الثدييات. توضح هذه الصورة بروتوكول عام لعزل الخلايا الجرثومية من الخلايا الجرثومية الثدييات، مع بيانات تمثيلية من تطبيق هذا البروتوكول لفئران الخصية. هو: هوشست. من ليما، وآخرون. 5 بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تعليق خلية واحدة الناتجة عن التفكك الميكانيكية من الماوس الأنسجة الخصية. العينات التي تم الحصول عليها من الأنسجة الطازجة ( أب ) تظهر مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الجرثومية سليمة والحطام القليل جدا. بالمقارنة مع الخلايا غير ملوثين ( A )، لوحظ بعض تراكب الخلية ل هويشت تعليق الخلايا الملون ( B )، والتي يمكن تخفيضها بإضافة الدناز (تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل) إلى العينة مباشرة بعد التفكك ( D ). يمكن أيضا أن تستخدم الأنسجة الخصية المجمدة للحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق التفكك الميكانيكية ( C ). ومع ذلك، يبدو أن عملية تجميد فلاش والذوبان قبل تفكك الأنسجة النتائج في المزيد من الحطام، موت الخلايا وعموما أقل المحصول الخلوي. بعد التفكك (انظر بروتوكول)، تم نسج العينات لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية وإعادة تعليقها في دمم 1X قبل تركيب الشرائح. أشرطة سوداء = 50 ميكرون. الصور التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر ضوء الضوء تستقيم مجهزة مصباح الأشعة فوق البنفسجية.ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: هو-فاكس من الخلايا الجرثومية الثدييات. مجموعات محددة تقدم أنماط فريدة من مضان هويشت خلال فاكس ( A ). كما هويشت مضان الأزرق يعكس الاختلافات في مجموعات محتوى الكروماتين من هابلويد ( C ). ديبلويد (2C) وخلايا رباعي رباعي (4C) تقع الخلايا في مناطق مؤامرة فاكس مع زيادة مضان الأزرق هويشت. المؤامرات ولدت بوصفها وظيفة من هويشت الأزرق / الأحمر مضان تظهر مجموعات من السكان خلية متميزة للأنواع الثدييات المختلفة اختبار ( بك ). سبغ: سبيرماتوغونيا؛ سيك الأول: الحيوانات المنوية الأولية. قبل ليب: ما قبل ليبتوتين الحيوانات المنوية. ليب: سبيرماتوسيتس ليبتوتين؛ تراجع: الحيوانات المنوية ديبلوتين. SPCالثاني: الحيوانات المنوية الثانوية. سبد: سبيرماتيدس؛ إسبد: استطالة الحيوانات المنوية؛ رسبد: سبيرماتيدس الجولة. مقتبس من ليما، وآخرون. 5 بإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: مورفولوجيا الخلايا الجرثومية في مراحل تنموية مختلفة من أربعة أنواع من الثدييات. ويبين هذا الرقم أقسام الأنسجة الخصية ملطخة هويشست (A) والجانب العام من أنواع مختلفة من الخلايا الجرثومية الذكور مرتبة حسب هو-فاكس (B) من الفئران وخنزير غينيا والكلب وخنزير صغير. كما حجم الخلية والشكل وتشكل لونين يختلف بشكل كبير في جميع أنحاء الحيوانات المنوية، وهذه يمكن استخدامها لتعيين خلايا لمراحل مختلفة من التمايز. سبيرماتوغونيا (سبغ) هي صغيرة ومستديرة جإلس مع هيتيروكروماتين بيريسينتريك متميزة وعرض كثافة عالية من مضان هويشت. الخلايا المنوية هي أكبر الخلايا الجرثومية وتظهر متغيرات الكروماتين متغير. نوى من الخلايا المنوية الأولية (سيك الأول) تظهر الاختلافات لونين مميزة من الخلايا الانتصافية، في حين أن الخلايا المنوية الثانوية (سيك الثاني) هي بينوكليتد أو في دياكينيسيس. سبيرماتيدس (سبد) لها شكل دائري أو ممدود، اعتمادا على مرحلة من الحيوانات المنوية وهي خلايا هابلويد صغيرة. على الرغم من أن الحيوانات المنوية مستديرة و سبيرماتوغونيا متشابهة في الحجم والشكل، يمكن تمييزها من قبل وجود كروموسنترز المترجمة. وأعدت الشرائح لكل نوع خلية فرزها بعد هو-فاكس وتصور في المجهر متحد البؤر: عدسة التكبير 63X، مع (لوحة أقل) أو بدون (لوحة العلوي) انتقال الضوء الأبيض.من ليما، وآخرون. 5 بإذن. رجاءانقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

٪ الخلايا في بوابة محتوى الحمض النووي نقاء فرز السكان الخلايا الجرثومية (٪)
محيط ٪ سينغلتس ٪ الخلايا الحية 1C 2C 4C الإشتراكي سيك I سيك إي الحزب الديمقراطي الاشتراكي rSpd eSpd
الفأر 98.4 92.5 34.7 3.9 3.72 74 82 87.5 95.2 95 * 92 *
فأر 95.7 93.8 37.7 5.3 5.4 83 81 82 87 . .
خنزير غينيا 96.2 92.1 39.3 7.6 5.8 48 68.7 85 87 . .
الكلب 97.9 86.5 16.4 3 0.5 78 . 87 . 91 81
خنزير صغير 95.9 93.2 26.9 6.4 3.5 49 52 82 92 . .
* الحصول عليها التفكك الأنزيمي وبوابةاستنادا إلى المعلمات فسك و سك (من ليما وآخرون 2016، مع إذن)

الجدول 1: إحصاءات هو-فاكس من تعليق الخلايا الجرثومية الذكور التي تم الحصول عليها عن طريق التفكك الميكانيكي.

التكميلي الشكل 1: تعليق خلية واحدة التي حصل عليها التفكك الميكانيكية من الأنسجة الخصية المجمدة. التفكك الميكانيكي يسمح بتوليد تعليق خلية واحدة من الأنسجة الخصية من أنواع الثدييات المختلفة دون الحاجة إلى بروتوكولات محددة الأنواع. لوحات مختلفة تظهر تعليق خلية تم الحصول عليها ل 4 أنواع الثدييات. تم الحصول على العينات عن طريق التفكك الميكانيكي للأنسجة الخصية المجمدة وملطخة هويشت. سبغ: سبيرماتوغونيا؛ سيك الأول: الحيوانات المنوية الأولية. سيك إي: الثانوية الحيوانات المنوية. سبد: سبيرماتيد؛ سبز: الحيوانات المنوية. تم تصور الشرائح في كونفوكا ل المجهر مع (لوحة أقل) أو بدون (لوحة العلوي) انتقال الضوء الأبيض. الحانات مقياس = 20 ميكرون. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلي الشكل 2: استراتيجية النابضة لفصل الخلايا الجرثومية الذكور الحية التي كتبها هو-فاكس من الماوس الخصية تعليق خلية واحدة. يتم فرز الخلايا الحية (بي السلبية) وفقا ل مضان هويشت. يتم تحديد سبيرماتوغونيا (سبغ) عن طريق التآمر مباشرة هويشت الأزرق والأحمر مضان شدة. يتم استخدام بوابة محتوى الحمض النووي لفرز الخلايا على أساس مضان الأزرق هويشت: هابلويد (C). ديبلويد (2C) و رباعي رباعي (4C). ثم يتم فرز الخلايا في كل ذروة من الرسم البياني من خلال التآمر وظيفة هويشت الأزرق والأزرق مضان. سبغ: سبيرماتوغونيا؛ سبد: سبيرماتيدس؛ سيك إي: الثانوية الحيوانات المنوية. سيك الأول: الخلايا المنوية الأولية.d / 55913 / SUP_fig.2.tif "> الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلي الشكل 3: استراتيجية الصابورة لفصل الخلايا الجرثومية الذكور الحية التي كتبها هو-فاكس من الكلب الخصية تعليق خلية واحدة. يتم فرز الخلايا الحية (بي السلبية) وفقا ل مضان هويشت. يتم تحديد سبيرماتوغونيا (سبغ) عن طريق التآمر مباشرة هويشت الأزرق والأحمر مضان شدة. يتم استخدام بوابة محتوى الحمض النووي لفرز الخلايا على أساس مضان الأزرق هويشت: هابلويد (C). ديبلويد (2C) و رباعي رباعي (4C). ثم يتم فرز الخلايا في كل ذروة من الرسم البياني من خلال التآمر وظيفة هويشت الأزرق والأزرق مضان. يمكن تقسيم الذروة التي تحتوي على خلايا هابلويد وفقا لنطاق كثافة الأزرق هويشت وتمثل اثنين من المجموعات الفرعية من الحيوانات المنوية: استطالة الحيوانات المنوية (بوابة C ') والحيوانات المنوية جولة (بوابة C' '). سبغ: سبيرماتوغونيا؛ إسبد: استطالة الحيوانات المنوية؛ رسبد: سبيرماتيدس الجولة؛ سيك إي:الخلايا المنوية الثانوية. سيك الأول: الخلايا المنوية الأولية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلي الشكل 4: استراتيجية الصابورة لفصل الخلايا الجرثومية الذكور الحية من قبل هو-فاكس من خنزير غينيا الخصية تعليق خلية واحدة. يتم فرز الخلايا الحية (بي السلبية) وفقا ل مضان هويشت. يتم تحديد سبيرماتوغونيا (سبغ) عن طريق التآمر مباشرة هويشت الأزرق والأحمر مضان شدة. يتم استخدام بوابة محتوى الحمض النووي لفرز الخلايا على أساس مضان الأزرق هويشت: هابلويد (C). ديبلويد (2C) و رباعي رباعي (4C). ثم يتم فرز الخلايا في كل ذروة من الرسم البياني من خلال التآمر وظيفة هويشت الأزرق والأزرق مضان. سبغ: سبيرماتوغونيا؛ سبد: سبيرماتيدس؛ سيك إي: الثانوية الحيوانات المنوية. سيك الأول: الخلايا المنوية الأولية. الرجاء النقر هنا للقيام بذلكقم بتحميل هذا الملف.

التكميلي الشكل 5: استراتيجية الصابورة لفصل الخلايا الجرثومية الذكور الحية التي هو فاكس من خنزير صغير الخصية تعليق خلية واحدة. يتم فرز الخلايا الحية (بي السلبية) وفقا ل مضان هويشت. يتم تحديد سبيرماتوغونيا (سبغ) عن طريق التآمر مباشرة هويشت الأزرق والأحمر مضان شدة. يتم استخدام بوابة محتوى الحمض النووي لفرز الخلايا على أساس مضان الأزرق هويشت: هابلويد (C). ديبلويد (2C) و رباعي رباعي (4C). ثم يتم فرز الخلايا في كل ذروة من الرسم البياني من خلال التآمر وظيفة هويشت الأزرق والأزرق مضان. سبغ: سبيرماتوغونيا؛ سبد: سبيرماتيدس؛ سيك إي: الثانوية الحيوانات المنوية. سيك الأول: الخلايا المنوية الأولية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الشكل 6: فحص الخلايا الجسدية كونتاميناتأيون في هو-فاكس فرزها السكان. (t-سني) من حوالي 600 خلية واحدة ترانزكريبتوم من ثلاثة البوابات فرعية فاكس فاكس (أب). على t-سني مؤامرة، كل نقطة تمثل موقف فريد من خلية واحدة في الفضاء ترانسكريبتوم ويتم تسمية كل خلية مع فاكس بوابة السكان الفرعية المنشأ (A). الكمي البصري للعلامات المحددة من نوع خلية على فاكس واحد خلية t-سني مؤامرة (B). ويقدر أن التلوث من الخلايا الجسدية أقل من 5٪ وليس محددا لبوابة سكانية واحدة من طراز هو-فاكس. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وبالنظر إلى ديناميات لونين المحفوظة للغاية أثناء الحيوانات المنوية في الثدييات، وكان الهدف من هذا العمل لتطوير بروتوكول لعزل الخلايا الجرثومية الذكور في مراحل متميزة من التمايز من الأنسجة الخصية مختلفة الثدييات ( الشكل 1 ). واحدة من العقبات الرئيسية في تطبيق سير العمل واحد لنماذج حيوانية مختلفة هي الحاجة إلى تعديلات محددة الأنواع، وخاصة فيما يتعلق بروتوكولات الأنسجة التفكك. الطرق الحالية تعتمد في الغالب على الهضم الأنزيمي والبروتوكولات في كثير من الأحيان تختلف حتى داخل الأنواع 12 . للتغلب على هذه المسألة، والبروتوكول الموصوفة هنا يظهر تطبيق التفكك الأنسجة الميكانيكية للحصول على تعليق خلية واحدة من عينات الخصية من أنواع الثدييات المختلفة. تشير النتائج إلى أن التفكك الميكانيكية من الأنسجة الخصية الطازجة مع هذا النظام يؤدي بشكل جيد ( الشكل 2A -2B 20 . الأهم من ذلك، لا يبدو تلطيخ هويشت تؤثر بشكل كبير على نوعية تعليق خلية واحدة. على الرغم من أن المزيد من الخلايا تتراكم مرئية في عينات ملطخة ( الشكل 2B )، والعلاج مع الدناز ( الشكل 2D ) أو ندا 20 يمكن أن تساعد في منع هذه المسألة. تقارير سابقة تشير إلى أن التفكك الميكانيكية من الأنسجة الخصية هو أفضل من أو كفاءة كما الأنزيمية الهضم الأنسجة 5 ، 20 . وفقا، تشير البيانات المقدمة هنا إلى أن التفكك الميكانيكية هو وسيلة موثوق بها للحصول على تعليق خلية واحدة من الأنسجة الخصية لمعالجة هو فاكس.

الحضانة مع هويشت هو خطوة حاسمة لأنها تؤثر على إشارة الكشف خلال التدفق الخلوي. فترات طويلة من تلطيخ توفير تمييز أفضل من أنواع الخلايا الجرثومية ولكنيمكن أن تكون سامة، مما أدى إلى موت الخلايا والتغيرات في البرمجة داخل الخلايا 22 . يجب على المستخدمين الذين يعتزمون إنشاء ثقافات الخلايا الجرثومية مع هذه الطريقة تقييم تأثير السمية الجينية للتعرض لفترة طويلة ل هويشست 3 ، 22 وتحديد تركيز كاف ووقت تلطيخ. هنا، كان 30 دقيقة من تلطيخ كافية لتوفير فصل موثوق بها السكان الخلية الجرثومية ( الشكل 3B -3C ). مدة تلطيخ يمكن أن يتم تخفيضها إلى 10 دقيقة، كما هو مبين من قبل رودريجيز كاسورياغا، وآخرون. 20 ، وينبغي أن يتم تقييمها من قبل المستخدمين للأنواع ذات الاهتمام.

كما افتراض، يمكن الكشف عن أربعة السكان الخلية الجرثومية باستمرار - سبغ، سيك الأول، سيك إي و SPD- على أساس الاختلافات لونين من الخلايا الجرثومية من الأنواع المختلفة اختبار ( الشكل 3B -3C الجدول 1 )، ودعم استراتيجية النابضة المعتمدة في هذا العمل ( الشكل 1 ) لأنواع الثدييات المختلفة ( أرقام التكميلية 2- 5 ). ومع ذلك فمن المستحسن أن المستخدمين الأمثل التباعد وفقا للأنواع والسكان من الفائدة من أجل الحد من التلوث عبر الكشف عن بعض السكان (الجدول 1). ويمكن تحقيق ذلك من خلال فترات حضانة أطول خلال تلطيخ18 ، وانخفاض معدل التدفق 2 وانخفاض أحجام البوابة. سبغ هي أكثر تحديا لعزل لأنها هي أندر نوع الخلية في الخصية وأيضا بسبب هروب صبغ مع مرور الوقت 1 ، 15 . على الرغم من أنه من الممكن للكشف عن السكان سبغ متميزة من قبل هو-فاكس، كما هو موضح هنا، والدراسات التي تركز فقط على علم الخلايا الجذعية تستفيد من تقنية أكثر صرامة مثل المغناطيسي فرز الخلايا المنشط (ماكس؛ 23 ). ومن الجدير بالذكر، يمكن تمييزها من السكان الأصليين من سبد (إسبد و رسبد) بوضوح للكلب ولكن ليس للأنواع الأخرى ( الشكل 3C والشكل التكميلي 3). من الممكن، هذه المجموعات السكانية الفرعية يمكن حلها عن طريق ضبط إعدادات النابضة، كما هو موضح من قبل المؤلفين للماوس 5 . الصور الخلوية ولدت لحجم الخلية و تحبب (فسك فس سك)، قبل التآمر وظيفة هويشت الأزرق / أحمر فلوريسنس، ويميز استطالة (منخفضة فسك + سك)، من جولة (عالية فسك + سك) الحيوانات المنوية الفرعية. وفصل مستديرة ومطولة المجموعات الفرعية الحيوانات المنوية تسمح بإجراء مزيد من التحقيق في العمق من الحيوانات المنوية، وبذلك رؤى جديدة في الأحداث الجزيئية المحددة التي تحدث أثناء التمايز الحيوانات المنوية. أيضا، كما هو موضح للماوس 1 ، 2 ، 12 ، فمن الممكن الحصول على مزيد من القرار من المراحل الانتصارية، عن طريق ضبط البوابات فاكس. ومن شأن هذا النهج أن يستفيد إلى حد كبير من الدراسات المقارنة للأحداث الانتصافية. على الرغم من انزعاج سلامة الخلية خلال هو-فاكس، وحيد تسلسل الحمض النووي الريبي تسلسل البيانات التي تم الحصول عليها للخلايا فرزها مع هذا الأسلوب (جونغ وآخرون ، غير منشورة ، الشكل التكميلي 6 ) يشير إلى أن هذا هو نهج موثوق بها للحصول على خلايا للدراسات الجزيئية من الخلايا الجرثومية مادة الاحياء. ومع ذلك، المستخدمين الذين ينوون إجراء فحوصات الإنجابية، مثل ص(روزي)، باستخدام الخلايا المعزولة من قبل هو-فاكس تقييم بقاء الخلايا فرزها وقد ترغب في استكشاف طرق بديلة 24 ، 25 .

وباختصار، يصف هذا العمل طريقة موحدة لعزل الخلايا الجرثومية الخصية من الثدييات المختلفة، وبناء وإضافة التحسينات على التقنيات التي أنشئت سابقا 2 ، 12 ، 20 . ويسمح هذا التوحيد باستخدام مجموعة واحدة من الكواشف وسير عمل واحد على أنواع الثدييات المختلفة، مما يسهل توليد البيانات للدراسات المقارنة لبيولوجيا الخلية الجرثومية. كما أن تفكك الأنسجة الميكانيكية يتغلب على عقبة التعديلات الخاصة بالأنواع التي قد تؤدي إلى تغير منهجي يكاد يكون من المستحيل حسابه. بالإضافة إلى ذلك، تقليل وقت التنفيذ والتلاعب يقيد اضطرابات في الجسم الحي سيلعلم وظائف الأعضاء العلوية إلى الحد الأدنى. في هذا الصدد، هو فاكس أسرع بكثير بالمقارنة مع طرق أخرى من عزل الخلايا الجرثومية، مثل ستا-بوت و إلوترياتيون 6 ، 7 . وعلاوة على ذلك، الفصل في وقت واحد من 4 السكان الجرثومية في نفس التجربة هو ممكن فقط من قبل فاكس. وبالنظر إلى خصائص صبغ هويشت، يتم الحفاظ على بنية الخلية والأنواع رنا، وبالتالي الخلايا يمكن استخدامها لمزيد من الدراسات الجزيئية المصب. الأهم من ذلك، منذ هو-فاكس تعتمد على الصفات الكروماتين لتمييز أنواع الخلايا الجرثومية، والأداء الناجح لهذا العمل في 5 أنواع مختلفة تدعم بقوة تطبيقها على الثدييات الأخرى. النتائج المعروضة هنا تشير إلى أن الحيوانات المنوية قد تكون عملية فريدة من التمايز الخلايا التي يمكن معالجتها في العديد من أنواع الثدييات باستخدام بروتوكول واحد. على هذا النحو، في "أوميكس" وعلم الأحياء عصر النظم، وهذه التكنولوجيا توفر وسيلة لتطبيق تطوريالصراصير على أسئلة من البيولوجيا الخلية الجرثومية الذكور، بما في ذلك دراسات علم الوراثة، والتنظيم، وتنوع البروتين في جميع أنحاء الحيوانات المنوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين تعلن أي مصالح المتنافسة.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر مستشفى هيلسايد الحيوان (سانت لويس، مو) لكلب الخصيتين. جيسون أراند ومختبر الدكتور تيد سيسرو في جامعة واشنطن في سانت لويس (واشو) لتوفير الخصيتين الفئران و بريان تابيرس للمساعدة في جمع؛ جاريد هارتسوك ومختبر الدكتور سالت في واشو للخصيتين خنزير غينيا. والدكتور مايكل تالكوت في قسم الطب المقارن في واشو لخياطة الخصية المصغرة. كما يعترف المؤلفون بمركز ألفين جيه سيتمان للسرطان في كلية الطب بجامعة واشنطن ومستشفى بارنز اليهودي في سانت لويس، مو، لاستخدام جهاز سيتمان فلو سايتوميتري كور الذي يوفر خدمة فرز الخلايا التي يديرها الموظفون. يتم دعم مركز السرطان سيتمان في جزء من نسي دعم مركز السرطان منحة # P30 CA91842.

وقد تم تمويل هذا البحث من قبل زمالة دكتوراه فكت [سفر / بد / 51695/2011 إلى أكل]، ومنح من الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة [R01HD078641 و R01MH101810 إلى Dفك] وعقد بحثي [فك / 01262/2014 إلى مكافحة غسل الأموال].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde VWR #15710 4% PFA, For fixing sorted cells
Medimachine BD Biosciences #340588; System for testis dissociation
1X Dulbecco modified Eagle medium Life Technologies #31053 DMEM, for testis dissociation
Medicon BD Biosciences #340591 Disaggregation cartridge for testis dissociation
Fetal bovine serum Thermo Scientific #10082139 FBS, for FACS collection
Hoechst 33342 Invitrogen #H3570 Hoecsht, For FACS staining
40 µm cell strainer GREINER BIO-ONE #89508-342 For testis dissociation
100x 15 mm petri dish Falcon #351029 For testis dissection
5 mL polypropylene round-bottom tubes Falcon #352063 For FACS collection
1.5 mL Eppendorf tubes VWR #20170-650 For FACS collection
3 mL needless syringe BD Biosciences #309657 For testis dissociation
50 mL conical tube MIDSCI #C50R For testis dissociation 
Propidium Iodide Invitrogen #L7011 PI, For FACS staining
MoFlo Legacy cell sorter Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Summit Cell Sorting software Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Phosphate buffered saline Thermo Scientific #AM9625 PBS, For microscopy
Microscopic glass slide Fisher Scientific #12-544-4 For microscopy
Glass coverslip Fisher Scientific #12-548-87 For microscopy
Disposable transfer pipette (3 mL) Samco Scientific #225 For testis dissociation
DNase I Roche #10104159001 For testis dissociation
Carbon steel surgical blade Miltex #4-111 For testis dissection
Countess automated cell counter Invitrogen #C10227 For automatic cell counting
Trypan blue solution (0.4%) Sigma #T8154 For viability staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

Tags

البيولوجيا التنموية، العدد 125، الاستنساخ المقارن، الفلورسنس المنشط خلية الفرز (فاكس)، هوشست-33342، الخلايا الجرثومية الذكور، التفكك الميكانيكي، الحيوانات المنوية، الخصية،
نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J.,… More

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J., Usmani, A., Lopes, A. M., Conrad, D. F. A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55913, doi:10.3791/55913 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter