Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55913
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

В этой работе описывается стандартизация метода получения очищенных популяций зародышевых клеток из ткани яичка различных видов млекопитающих. Это простой протокол, который объединяет механическую диссоциацию яичка, окрашивание Hoechst-33342 и пропидиум иодидом и сортировку FACS с широким применением в сравнительных исследованиях мужской репродуктивной биологии.

Abstract

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) была одним из методов выбора для выделения обогащенных популяций клеток яичек млекопитающих. В настоящее время он позволяет различать до 9 популяций половых клеток мыши с высоким выходом и чистотой. Это высокое разрешение в отношении дискриминации и очистки возможно благодаря уникальным изменениям структуры и количества хроматина во всем сперматогенезе. Эти образцы могут быть захвачены проточной цитометрией мужских половых клеток, окрашенных флуоресцентными ДНК-связывающими красителями, такими как Hoechst-33342 (Hoechst). Здесь представлено подробное описание недавно разработанного протокола для выделения клеток яичек млекопитающих. Вкратце, одноцепочечные суспензии образуются из ткани тестикулята механической диссоциацией, дважды окрашиваются Hoechst и пропидиум иодидом (PI) и обрабатываются проточной цитометрией. Последовательная стратегия стробирования, включая выбор живых клеток (отрицательный PI) с различным содержанием ДНК (интенсивность Хоэста), iS, используемые во время сортировки FACS, чтобы различать до 5 типов зародышевых клеток. К ним относятся, с соответствующей средней чистотой (определяемой с помощью оценки микроскопии): сперматогония (66%), первичные (71%) и вторичные (85%) сперматоциты и сперматиды (90%), далее разделенные на круглые (93%) и удлиненные (87%) субпопуляций. Выполнение всего рабочего процесса является простым, позволяет одновременно изолировать 4 типа ячеек с соответствующей машиной FACS и может выполняться менее чем за 2 часа. Поскольку сокращение времени обработки имеет решающее значение для сохранения физиологии клеток ex vivo , этот метод идеально подходит для исследований с высокой пропускной способностью по сравнению с биохимией мужских половых клеток. Более того, стандартизованный протокол для многовидовой очистки зародышевых клеток млекопитающих исключает методологические источники переменных и позволяет использовать один набор реагентов для разных моделей животных.

Introduction

Учитывая отсутствие системы in vitro , представляющей прогрессию сперматогенеза, а также наличие большой клеточной гетерогенности в яичках, исследования биологии клеток мужских половых клеток требуют надежных методов выделения обогащенных популяций конкретных типов клеток. Для этой цели широко используется флуоресцентная сортировка клеток (FACS) 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , так как она обеспечивает высокий выход и чистоту и превосходит другие методы изоляции в количестве типов зародышевых клеток, которые она может идентифицировать и Выберите 6 , 7 , 8 . Принцип анализа проточной цитометрии основан на обнаружении дифференциальных световых образцов после лазерного возбуждения одиночных клеток. Когда камера проходит через лазер, она отражает / рассеивает светПри всех углах, пропорциональных размеру ячейки (прямое рассеяние, FSC) и внутриклеточной сложности (боковой разброс, SSC). См. Ormerod 9 для получения подробной информации о проточной цитометрии.

Мужские зародышевые клетки подвергаются специфическим модификациям в отношении содержания ДНК, структуры хроматина, размера и формы на разных стадиях сперматогенеза. Таким образом, отдельные клеточные популяции могут быть идентифицированы и разделены путем объединения рассеяния света и окрашивания ДНК флуоресцентными красителями 10 , 11 . Для этой цели можно использовать несколько красителей (обзор в Geisinger и Rodriguez-Casuriaga 3 ), такой как Hoechst-33342 (Hoechst), который часто использовался в проточном цитометрическом анализе клеток тестикула в течение последнего десятилетия 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN возбуждение ультрафиолетовым излучением, Hoechst излучает синюю флуоресценцию, пропорциональную содержанию клеточной ДНК, тогда как красная флуоресценция отражает изменчивость структуры хроматина и уплотнения 1 , 13 , 14 . В результате мужские зародышевые клетки на разных стадиях дифференцировки проявляют специфические закономерности во время FACS окрашенных Hoechst одноклеточных суспензий (Ho-FACS, 1 , 12 ). Интересно, что из-за механизма оттока красителя, который активен только на стадии сперматогона, интенсивность синей флуоресценции Хехста не пропорциональна содержанию хроматина в этих клетках, и они группируются как побочная популяция во время Ho-FACS 15 . Кроме того, объединение Hoechst-окрашивания с иодидом пропидиума без проницаемости (PI) позволяет пользователям различать живые (отрицательные значения PI) из мертвых (PI-положительных) клеток во время FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Эта стратегия ранее использовалась в проточных цитометрических анализах яичек зародышевых клеток и интенсивно оптимизировалась у мышей, чтобы различать до 9 типов зародышевых клеток, включая клетки на 4 разных стадиях мейоза I 1 , 2 , 4 , 16 . Для целей этой работы окрашивание Hoechst имеет три основных преимущества. Во-первых, Ho-FACS успешно применяется для выделения мужских зародышевых клеток в мышиной модели 1 , 2 , 12 и других грызунов, таких как крыса и морская свинка 17 , 18 , 19 . Во-вторых, Hoechst является клеточно-проникающим красителем и не требует мембранной проницаемости, поэтому онVes. Наконец, никакой обработки РНКазой не требуется, так как Hoechst связывается преимущественно с поли (d [AT]) последовательностями ДНК 1 , 20 , что означает, что РНК сохраняется и, помимо ДНК и белков, может быть использована для последующих молекулярных исследований зародышей Клеточной дифференцировки.

Несмотря на сходство в плоидности и / или бледности ДНК, наблюдаемую при анализе проточной цитометрии видов млекопитающих (рассмотренная в Geisinger и Rodriguez-Casuriaga 3 ), в протоколах, описанных для выделения мужских зародышевых клеток методом проточной цитометрии, была значительная изменчивость. В различных исследованиях использовались конкретные протоколы для диссоциации тканей и использовались различные ДНК-связывающие красители (отдельно или в комбинации) и стратегии стробирования FACS у разных модельных организмов, главным образом мыши, крысы и морской свинки. Следовательно, прямое сравнение данных, собираемых для разных видов, может быть затронутоНеиспользованные технические артефакты, возникающие в результате изменчивости между методологиями. Важно отметить, что поразительное сохранение динамики хроматина во всем сперматогенезе млекопитающих (2N-4N-2N-1N) предполагает, что стандартизованный протокол может быть поперечно применен к различным видам млекопитающих.

Целью этого исследования было разработать единый рабочий процесс, применимый к различным видам млекопитающих, путем комбинирования и адаптации ранее опубликованных методов 2 , 20 . Стандартизация метода для обработки тканей была достигнута путем проведения механической диссоциации для преодоления потребности в видоспецифических корректировках, необходимых для ферментативного расщепления 5 . Следует отметить, что механическая диссоциация ткани тестикулярного грызуна показала, что она лучше, чем ферментативное переваривание ткани 20, и Ho-FACS одноцепочечных суспензий, генерируемых обоими методами, проявляютЭто сопоставимые результаты 5 . В качестве доказательства принципа этот протокол описывает параметры, используемые для выделения до 5 популяций зародышевых клеток: сперматогония (SPG); Первичный (SPC I) и вторичные сперматоциты (SPC II) и сперматиды (SPD) - круглые (rSPD) и удлиненные (eSPD). Важно отметить, что это легко осуществить в лаборатории, причем основными требованиями являются система диссоциации тканей и доступ к сортировщику клеток, оснащенному УФ-лазером. Этот рабочий процесс ( рис. 1 ) является быстрым и прямым и позволяет одновременное выделение 4 популяций зародышевых клеток из свежей ткани тестикула менее чем за 2 часа. Сокращение времени обработки имеет решающее значение для поддержания целостности сотовой связи для последующих последующих процедур. Более того, его успешная работа у 5 разных видов предполагает, что он может широко применяться в клане млекопитающих, что делает его идеальным методом для выделения зародышевых клеток для сравнительных исследований репродуктивного биола млекопитающихгия.

Этот протокол состоит из трех основных разделов, за исключением подготовительных этапов: (1) механическая диссоциация ткани яичка и (2) окрашивание тестикулярных клеток с помощью Hoechst и PI, а затем (3) сортировка FACS соответствующих сперматогенных клеток. После сбора этих обогащенных популяций различных клеток яичек млекопитающих можно использовать для широкого спектра применений. В этом протоколе описывается метод «единственного размера для всех» диссоциации для очистки мужских половых клеток от многих видов млекопитающих. В зависимости от типа исследования, которое пользователи хотят проводить с изолированными зародышевыми клетками, могут использоваться другие носители или буферы. Следующие этапы протокола предназначены для получения одноцепочечных суспензий из одного целого мышиного яичка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные ниже процедуры соответствовали положениям Комитета по изучению животных в Вашингтонском университете в Сент-Луисе.

1. Подготовка к протоколу механической диссоциации

  1. Предварительно намочите картридж для дезагрегации одноразовой ткани размером 50 мкм для диссоциации всего мышиного яичка.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Этот картридж для дезагрегации одноразовых тканей содержит микроблаты, предназначенные для резки тканей и неподвижной стальной сетки с примерно 100 гексагональными отверстиями. Доступны различные размеры сетки для картриджа дезагрегации ткани для адаптации этого протокола на основе видов и желаемых типов клеток. Патроны размером 50 мкм использовались для всех видов млекопитающих, упомянутых в этой статье.
    1. Загрузите 1 мл ледяного фенолового красного, освобожденного 1 раза Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), на картридж для дезагрегации одноразовых тканей размером 50 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Красный красный может помешать обнаружению красных флуоресценцийВо время FACS.
    2. Аспират 1x DMEM из картриджа для дезагрегации ткани с одноразовым шприцем без иглы 3 мл из шприца.
  2. Включите систему дезагрегации тканей, нажав кнопку «ON». Эта система не требует «разогрева».
  3. Предварительно намочите три 40 мкм одноразовых фильтра с ледяной 1х DMEM. Поместите каждый 40 мкм одноразовый фильтр на коническую трубку объемом 50 мл. Пипетируйте 1 мл 1x DMEM и пропускайте жидкость.
  4. Подготовьте чашку Петри 100 мм х 15 мм для сбора тканей тестикулярных тканей. Внесите 500 мкл 1x DMEM на чашку Петри.

2. Подготовка ткани яичек для протокола механической диссоциации

  1. Препарируйте мышь мужского пола, чтобы тщательно удалить свежие целые семенники или яичные фрагменты (если они имеют дело с другими видами млекопитающих) с помощью хирургических ножниц и щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что в тканях нет жира и некроза. Fr Esh тестикулярные ткани производят превосходное одноклеточное качество суспензии, чем замороженные ткани.
    1. Перенесите собранные семенники / фрагменты в подготовленную чашку Петри размером 100 мм х 15 мм, содержащую 500 мкл 1x DMEM.
    2. Осторожно промойте ткань в 1x DMEM, чтобы удалить эритроциты (если они есть).
  2. Осторожно удалите тунику albuginea. Толщина оболочки albuginea будет варьироваться у разных видов.
    1. Возьмите один конец яичка с помощью щипцов.
    2. Проколоть другой конец яичка скальпелем, все еще удерживая один конец яичка с помощью щипцов с предыдущего шага.
    3. Скребьте тестикулярные канальцы с помощью скальпеля, все еще удерживая один конец семенника с помощью щипцов с шага 2.2.1.
  3. Отрежьте тестикулярные канальцы на кусочки 2-3 мм 3, используя скальпель.

3. Получение одноклеточных суспензий путем механической диссоциации ткани яичек

Ontent "> ПРИМЕЧАНИЕ. Шаги диссоциации, описанные ниже, предназначены для одного взрослого мышиного яичка. Соответственно должны быть скорректированы объемы тканей тестикулярных клеток от несовершеннолетних мышей или немышечных видов. Несовершеннолетние животные могут не содержать всех стадий зародышевых клеток. Некоторые виды млекопитающих имеют Изменение состава ткани тестикулярной ткани в течение сезонов размножения по сравнению с нерегулярным сезоном.

  1. Перенесите мелкие кусочки тестикулярной трубочки в предварительно смоченный 50-миллиметровый картридж для дезагрегации ткани с помощью щипцов и добавьте 1 мл 1x DMEM.
  2. Загрузите картридж для дезагрегирования ткани в систему дезагрегации ткани и обработайте в течение 5 минут, повернув ручку из режима ожидания в режим «запуска».
  3. Удалите картридж для дезагрегации ткани из системы дезагрегации ткани и суспензию суспензии аспирата с помощью одноразового шприца без иглы объемом 3 мл из шприца.
    1. Аспирируйте несколько раз, чтобы удалить всю жидкость из картриджа для дезагрегации ткани. НеВсе 1 мл могут быть извлечены из картриджа дезагрегации ткани.
  4. Пропустите аспирационную суспензию клеток через два одноразовых предварительно смоченных фильтра 40 мкм. Отфильтруйте дважды, чтобы удалить любые ячейки.
    1. Поместите один предварительно смачиваемый фильтр 40 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Непосредственно добавьте аспирационные клетки в шприц на фильтр 40 мкм. Пипетируйте сквозную одноклеточную суспензию с помощью одноразовой пипетки.
    2. Удалите использованный предварительно смачиваемый фильтр 40 мкм и поместите еще один предварительно смоченный 40 мкм фильтр в 50-миллилитровую коническую трубку. Пипетируйте собранную суспензию с одной ячейкой на чистый фильтр 40 мкм.
    3. Соберите фильтрованную одноклеточную суспензию с помощью чистой одноразовой пипетки.
  5. Пипеткой отфильтровать клеточную суспензию обратно в картридж для дезагрегации ткани размером 50 мкм и обработать еще 5 минут в системе дезагрегации ткани.
  6. Восстановите всю жидкость из дезагрегата тканиНа картридже.

4. Окрашивание с помощью Hoechst и Propidium Iodide (PI)

  1. Перенесите восстановленную клеточную суспензию из картриджа для дезагрегации ткани размером 50 мкм в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Приблизительно 1-1,5 мл одноцепочечной суспензии будут выделены.
  2. Разделите восстановленную одноклеточную суспензию на четыре пробирки объемом 1,5 мл или 5 мл.
    1. Для первых трех пробирок пипеткой 150 мкл одноклеточной суспензии и пипеткой остатков одноклеточной суспензии в последнюю из четырех трубок (приблизительно 550 мкл одноцепочечной суспензии).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Количество одноцепочечной суспензии в последней трубке может изменяться в зависимости от эффективности восстановления суспензии клеток на этапе 3.6.
  3. Установите первую трубку из четырех трубок как неокрашенный контроль для сеанса FACS.
  4. Подготовьте суспензии клеток с окрашенными красителями (PI или Hoechst) в качестве контролей. Добавьте 2,5 мкл Hoechst или 1 мкл PI в каждую пробирку (вторая и thiе).
  5. Подготовьте двойную окрашенную трубку. Это будет использоваться для сбора субпопуляций зародышевых клеток. Добавьте 2,5 мкл Hoechst и 1 мкл PI к последней пробирке.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Срок хранения Hoechst составляет 2-3 месяца. Использование старых запасов красителя приведет к значительным изменениям во время сеанса FACS.
  6. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Поместите образцы в ротатор трубки или инвертируйте 1,5 мл пробирки каждые 5-10 минут.
  7. Суспензию фильтрующего элемента с предварительно смоченным фильтром на 40 мкм и оставляют отфильтрованный раствор на льду и в темноте до сеанса FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Шаг фильтрации необходим для предотвращения клеточных глыб для FACS. Кроме того, для ограничения клеточного клеща можно использовать обработку ДНКазой (см. Рис. 1 ) или дикалиевую соль 2-Нафтол-6,8-дисульфоновой кислоты (NDA 20 ). Длительные периоды ожидания влияют на флуоресцентный сигнал, обнаруженный во время FACS, и могут приводить к увеличению гибели клеток.

    5. Флуоресценция активированной сортировки клеток (FACS) Установка и очистка клеток яичек

    1. Подготовьте трубы для сбора FACS.
      1. Пальто 5 мл полипропиленовые круглодонные трубки или 1,5 мл пробирки с 400 мкл FBS для сбора клеток. Декантируйте избыток FBS после покрытия.
      2. Добавьте в пробирки среду для сбора FACS (1x DMEM + 10% Fetal Bovine Serum, FBS): 1 мл для 5 мл пробирки или 100 мкл для 1,5 мл пробирки.
    2. Настройте соответствующие условия сортировки в сортировщике и программном обеспечении.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Другие сотовые сортировочные машины и программное обеспечение для анализа могут использоваться с аналогичными стратегиями установки и стробирования, описанными ниже. Условия, описанные здесь, были адаптированы из Гайсинской и Бортвин- 2 , Гейсингера и Родригеса-Казуриага- 3 , а Гетун и др. 4
      1. Загрузите ультрафиолетовый лазер с 463/25 нм полосовой фильтр для обнаружения фильтра Hoechst blue и 680 нм LP-диапазона для обнаружения Hoechst red и обнаружения PI.
      2. Используйте дихроичное зеркало 555DLP, чтобы отличить синий от красной флуоресценции.
      3. Используйте сопло и сортировочные ячейки размером 70 мкм со скоростью 1000-2000 ячеек в секунду.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Эффективность сортировки напрямую зависит от скорости потока. Высокие скорости потока (> 3500 событий / с) увеличивают скорость сортировки, но приводят к загрязнению популяций. См. Ссылку 12 для получения дополнительной информации.
    3. Установите ворота, используя контрольные образцы.
      1. Загрузите и запустите неокрашенный образец.
      2. Исключить клеточный мусор на основе графика FSC и SSC. В нижнем левом квадранте участка появится всплеск клеток. Произвольно устанавливают пороговое значение для клеточного мусора пользователем или специалистом по сортировке клеток.
      3. Ворота на отдельных ячейках путем регулировки порога для FSC и ширины импульса. У разных сортировщиков ячеек разные способы различенияGuish синглеты. Поскольку ширина импульса отражает временные ячейки для пересечения лазера, одиночные клетки имеют более низкие значения по сравнению с многоклеточными агрегатами. Регулирующий порог на графике для FSC по сравнению с шириной импульса может использоваться для выбора синтаксиса.
      4. Установите оптимальные напряжения фотоумножителя (PMT).
      5. Используйте как неокрашенные, так и окрашенные одним красителем клетки, чтобы установить порог сигнала флуоресценции PI или Hoechst.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Важно оптимизировать базовые напряжения ПТМ для интересующих клеток, чтобы установить правильный диапазон флуоресценции для каждого красителя. Это важно для оптимального обнаружения сигнала и чувствительности. Неокрашенные и одиночные окрашенные контрольные клетки используются для создания диапазона отрицательно и положительно окрашенных клеток с красителями PI и / или Hoechst и минимизации шума в сигналах. Для дальнейших объяснений по оптимизации напряжения PMT с помощью контрольных ячеек, пожалуйста, обратитесь к Gaysinskaya and Bortvin 2
      6. Ворота на живой клеткеS на основе окрашивания PI (отрицательный PI) и участка FSC. Мертвые клетки будут положительными для флуоресценции ПИ.
      7. Установите ДНК-содержимое, построив гистограмму подсчета клеток на основе синей флуоресценции Hoechst. Должны появиться 3 пика с возрастающими концентрациями синей флуоресценции Hoechst, представляющие гаплоидные (1C), диплоидные (2C) и тетраплоидные (4C) клетки. Установите 3 затвора, по одному для каждого пика.
      8. Наблюдайте не менее 500 000 событий на участке FSC и SSC, прежде чем приступать к стробированию популяций зародышевых клеток.
    4. Ворота различных популяций зародышевых клеток.
      1. Загрузите образец Hoechst / PI.
      2. Установите первые 3 родительских ворот, которые являются общими для всех групп населения.
        1. Исключить клеточный мусор, основанный на графике FSC и SSC. Выбирайте синглеты на основе графика FSC по длине импульса. Выберите живые клетки, закрыв отрицательные ячейки PI.
      3. Определите ворота сперматогонии.
      4. Плоские отрицательные клетки PI на основе синей и красной флуоресценции Hoechstинтенсивности. Сперматогония проявляется как побочная популяция (см. Рис. 1 ).
      5. Определите ворота для остальных популяций зародышевых клеток. ПРИМЕЧАНИЕ. Для получения дополнительной информации см. Рисунок 1 и дополнительную цифру 2.
      6. Участок отрицательных клеток PI в воротах содержимого ДНК.
        1. Для ворот сперматид пик с наименьшей флуоресценцией Хёхста (1С).
        2. Для сперматоцитов II задерживают пик с промежуточной флуоресценцией Хёхста (2С).
        3. Для сперматоцитов I, задерживают пик с наивысшей флуоресценцией Хёхста (4C).
      7. График интенсивности синей и красной флуоресценции Hoechst для уточнения популяций сперматоцитов и сперматид из ворот ДНК-содержимого.
    5. Соберите выбранные субпопуляционные ворота в предварительно собранные трубки для сбора. Каждый семенник будет принимать в среднем от 45 мин до 1,5 ч для сбора приблизительно 0,5-6,0 × 10 6 клеток для каждой субпопуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Длительное воздействие клеток на Hoechst maY слегка сдвигают местоположение популяций со временем. Обновите настройки после 20-30 минут FACS. Максимальный выход для каждой субпопуляции будет зависеть от эффективности этапа диссоциации.

    6. Микроскопическая оценка очищенных клеток

    1. Спин собирал клетки при 500-600 мкг при 4 ° С в течение 10 мин.
    2. Повторно суспендируют клеточный осадок с 1 мл ледяного 1х раствора фосфатного буфера (PBS) или 1x DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Объем повторной суспензии можно отрегулировать в соответствии с количеством отсортированных ячеек и желаемой конечной концентрацией.
    3. Нанесите 40 мкл промытых клеток на чистый стеклянный предмет и поместите покровное стекло.
    4. Закрепите оставшиеся клетки 4% параформальдегидом (PFA) и храните фиксированные клетки при температуре 4 ° C в темноте для дальнейшего использования.
      1. Внесите 100 мкл 4% PFA непосредственно в сборные трубки.
      2. Кратко встряхните трубки или пипетки несколько раз, чтобы обеспечить хорошее перемешивание клеточной суспензии.
    5. Визуализируйте подготовленные слайды в микроскопе, оснащенном УФ-лампой для обнаружения флуоресценции Хёхста под объективом 63X. Обратитесь к разделу «Результаты» - «Морфологическая оценка популяций отсортированных зародышевых клеток» - для получения дополнительной информации о том, как идентифицировать конкретные типы зародышевых клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Одноцепочечные суспензии от механической диссоциации ткани яичка

На рисунке 2 сравниваются одноцепочечные суспензии, полученные механической диссоциацией ткани яичек мыши в разных условиях. Образцы, полученные путем обработки свежей ткани, неокрашенные ( рис. 2А ) или окрашенные Hoechst ( рис. 2B ), показывают наличие отдельных клеток на разных стадиях дифференциации, и, что важно, клеточная структура, по-видимому, сохраняется, включая жгутики сперматозоидов. Хотя в окрашенных образцах наблюдалось некоторое скопление и обломки, которые были уменьшены добавлением ДНКазы после диссоциации ( рис. 2D ), эти результаты показывают, что окрашивание Hoechst существенно не изменяет качество суспензий одиночных клеток. Интересно, что одиночная клеточная суспензия( Фиг. 2C ) и других видов млекопитающих - крыса, собака, морская свинка и мини-свиньи ( дополнительная фигура 1 ) механической диссоциацией. Различные типы клеток видны и идентифицируются в этих образцах; Однако обработка замороженной ткани, по-видимому, приводит к увеличению гибели клеток и сгущению, а также к снижению клеточного выхода. Таким образом, настоятельно рекомендуется готовить одноцепочечные суспензии из свежей ткани для дальнейшего последующего применения.

Качество одноцепочечных суспензий, полученных из свежих яичек ткани мыши, крысы, собаки, морской свинки и мини-свиньи, оценивали во время Ho-FACS ( таблица 1 ). После исключения клеточного мусора 95,7-98,4% клеток являются синглетами, а из них 86,5-93,8% живы, что показано путем количественной оценки отрицательных клеток PI (см. Протокол ). Эти результатыTs указывают, что механическая диссоциация является надежным способом получения одноцепочечных суспензий для проточной цитометрии из ткани тестикулярных тканей различных видов млекопитающих.

Ho-FACS для выделения зародышевых клеток из ткани яичка различных видов млекопитающих

После механической диссоциации суспензии одиночных клеток окрашивают Hoechst и PI и обрабатывают FACS. Как упоминалось выше, окрашивание Hoechst позволяет различать клетки на разных стадиях дифференцировки на основе количества и структуры хроматина, тогда как окрашивание PI неперспекбилизированных клеток отделяется от мертвых клеток. Следовательно, после фильтрации клеточного дебриса и многоклеточных агрегатов, ПИ-затвор выбирает клетки с неповрежденными мембранами (отрицательный PI, рис. 1 ). Живые клетки затем анализируют на основе флуоресценции Хехста: синий пропорционален содержанию ДНК и увеличивает красный цветФлуоресценция отражает менее конденсированный хроматин и структурные изменения. Как таковые, предполагается, что мужские зародышевые клетки разных стадий будут группироваться в определенных участках цитограмм, отображающих функцию сине-красной флуоресценции Хёхста ( рис. 3А ).

Действительно, графики Ho-FACS, генерируемые для разных видов, показывают наличие различных популяций клеток на основе флуоресценции Хёхста ( рис. 3B- 3C ). Хотя эти графики достаточны для того, чтобы различать популяции зародышевых клеток, можно ограничить наличие гена содержимого ДНК (С) 2 для ограничения перекрестного загрязнения. Эти ворота генерируются гистограммой подсчета клеток в зависимости от интенсивности синей флуоресценции Hoechst. Для всех видов могут быть обнаружены три пика и представлены клетки с 1C, 2C и 4C ( рис. 1 и дополнительные рисунки 2-5 ). Примечательно, чтоКроме того, сперматогония является побочной популяцией и не может быть надежно решена на основе гистограмм содержания ДНК. Следовательно, эта популяция задерживается после исключения мертвых клеток на основе графиков Hoechst blue / red fluorescence ( рисунок 1 ). Эта стратегия представлена ​​на рисунке 1 для крыс и дополнительных рисунков 2-5 для остальных видов. Важно отметить, что поскольку только флуоресценция Hoechst может различать различные типы зародышевых клеток, как ворота PI, так и ДНК-материалы являются необязательными. Они были включены в эту стратегию для выбора живых клеток и снижения перекрестного загрязнения соответственно. Как суммировано в таблице 1 , количественная оценка клеток в вороте ДНК-содержимого отражает относительную долю клеток на разных стадиях сперматогенеза. Как и ожидалось, 1C-клетки являются наиболее распространенными и представляют собой популяции сперматидов, за которыми следуют клетки 2C (SPC II) и 4C клетки (SPC I). ImportaТаким образом, эта картина сохраняется у разных видов, и небольшие различия могут отражать межвидовую изменчивость в зародышевых клетках и циклы семенного эпителия 21 .

После Ho-FACS целостность клеток можно оценить, используя окрашивание трипановым синим. Доля живых клеток через 1 час FACS варьировалась от 27% (SCP I) до 67% (SPD) для мыши, что указывает на то, что продолжительность сортировки и воздействия Hoechst увеличивает гибель клеток. Для пользователей, желающих культивировать сортированные клетки, концентрация Hoechst и продолжительность Ho-FACS должны быть скорректированы для улучшения выживаемости клеток. Тем не менее, данные секвенирования РНК были созданы для изолированных клеток, изолированных с использованием этого метода (Jung et al ., Неопубликованные), что указывает на то, что эти клетки подходят для молекулярных исследований биологии зародышевых клеток. Этот набор данных использовался для обнаружения потенциального заражения популяций зародышевых клеток соматическими клетками ( дополнительный рисунок 6

Морфологическая оценка популяций отсортированных зародышевых клеток

Поскольку зародышевые клетки подвергаются резким морфологическим изменениям во всех случаях сперматогенеза, можно оценить чистоту выделенных популяций путем микроскопии. В качестве ссылки на рисунке 4 показана общая морфология различных типов мужских половых клеток из 4 видов млекопитающих (из Lima и др. 5 ). Распределение и конденсация хроматина, а также размер и форма клеток показывают уникальные и хорошо охарактеризованные узоры в разных типах клеток. SPG имеют отчетливый перицентрический гетерохроматин, который ярко окрашивается для Hoechst и имеет небольшую и округлую форму (Spg на рисунке 4B ). Сперматоциты представляют собой более крупные гранулированные клетки. Ядра SPC I легко идентифицируются, с вариацией хроматинаNs, характерных для мейотических клеток (Spc I на фиг. 4B ), тогда как SPC II являются двуядерными или в диакинезе (Spc II на фиг. 4B ). Наконец, SPD представляют собой небольшие гаплоидные клетки с круглой или вытянутой формой (Spd на рисунке 4B ). Примечательно, что rSPD подобны SPG по размеру и форме, но явно отличаются наличием локализованных хромоцентров. Исходя из этих характеристик, отсортированные популяции клеток оценивались для обогащения конкретных типов клеток ( таблица 1 ). Популяции SPD и SPC II были высокообогащены для интересующего типа клеток, тогда как SPC I и SPG показали некоторую степень загрязнения другими типами клеток, особенно для образцов Guinea Pig и Mini Pig. Интересно, что для образца собаки стратегия стробирования была достаточной для того, чтобы отличать круглые от удлиненных сперматид ( рис. 3C , дополнительный рисунок 3 ; таблица 1

Рисунок 1
Рисунок 1: Рабочий процесс изоляции Ho-FACS мужских половых клеток млекопитающих. Это изображение иллюстрирует общий протокол выделения зародышевых клеток зародышевых клеток млекопитающих с репрезентативными данными из приложения этого протокола к тесту крысы. Ho: Hoechst. Из Лимы и др. 5 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Одноклеточные суспензии, полученные механической диссоциацией Мышечная ткань яичка. Образцы, полученные из свежей ткани ( AB ), демонстрируют различные типы интактных зародышевых клеток и очень маленькие обломки. По сравнению с неокрашенными клетками ( А ) некоторое клеточное сгущение наблюдалось для суспензий окрашенных клеток Hoechst ( B ), которые можно было бы уменьшить добавлением ДНКазы (конечная концентрация 10 мкг / мл) к образцу сразу же после диссоциации ( D ). Замороженные ткани тестикула также могут быть использованы для получения одноцепочечных суспензий путем механической диссоциации ( C ). Однако, похоже, что процесс замораживания и оттаивания вспышки до диссоциации ткани приводит к большему количеству мусора, гибели клеток и общему снижению клеточного выхода. После диссоциации (см. Протокол) образцы центрифугировали в течение 10 мин при 4 ° С и повторно суспендировали в 1х DMEM перед установкой слайдов. Черные полосы = 50 мкм. Изображения, полученные с помощью вертикального белого светового микроскопа, оснащенного УФ-лампой.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Ho-FACS зародышевых клеток млекопитающих. У конкретных популяций есть уникальные образцы флуоресценции Хехста во время FACS ( A ). Поскольку голубая флуоресценция Hoechst отражает изменения в кластерах содержания хроматина гаплоидов ( C ); Диплоидные (2C) и тетраплоидные (4C) клетки расположены в участках участка FACS с увеличением синей флуоресценции Hoechst. Графики, генерируемые в зависимости от синих / красных флуоресценции Hoechst, показывают кластеры различных популяций клеток для различных видов млекопитающих, испытанных ( BC ). SPG: Сперматогония; SPC I: первичные сперматоциты; Pre-Lep: сперматоциты перед лептотеном; Леп: сперматоциты Leptotene; Dip: сперматоциты Diplotene; SPCII: вторичные сперматоциты; СПД: сперматиды; ESPD: удлиненные сперматиды; RSPD: круглые сперматиды. Адаптировано из Lima и др. 5 с разрешения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Морфология зародышевых клеток на разных стадиях развития из четырех видов млекопитающих. На этом рисунке показаны участки тестикулярной ткани, окрашенные Hoechst (A), и общий аспект различных типов мужских зародышевых клеток, отсортированных Ho-FACS (B) у крыс, морских свинок, собак и мини-свиней. Поскольку размер ячейки, форма и конформация хроматина сильно варьируются во всей сперматогенезе, их можно использовать для назначения клеток различным стадиям дифференцировки. Сперматогония (Spg) мала и круглая cEll с отличным перицентрическим гетерохроматином и проявляют высокую интенсивность флуоресценции Hoechst. Сперматоциты являются самыми крупными зародышевыми клетками и демонстрируют вариационные конформации хроматина. Ядра первичных сперматоцитов (Spc I) проявляют вариации хроматина, характерные для мейотических клеток, тогда как вторичные сперматоциты (Spc II) являются двуядерными или в диакинезе. Сперматиды (Spd) имеют округлую или вытянутую форму, в зависимости от стадии спермиогенеза и представляют собой небольшие гаплоидные клетки. Хотя круглые сперматиды и сперматогонии сходны по размеру и форме, первые можно отличить наличием локализованных хромоцентров. Слайды были подготовлены для каждого сортированного типа клеток после Ho-FACS и были визуализированы в конфокальном микроскопе: линза с увеличением 63X, с белой светопропусканием (нижняя панель) или без (верхней панели). Из Lima и др. 5 с разрешения. пожалуйстаНажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

% Клеток в ДНК-контенте Чистота популяций отсортированных зародышевых клеток (%)
вид % Синглов % Живых клеток 1С 2С 4C губка Spc I Spc II Spd rSpd eSpd
мышь 98,4 92,5 34,7 3,9 3,72 74 82 87,5 95,2 95 * 92 *
крысиный 95,7 93,8 37,7 5,3 5,4 83 81 82 87 , ,
Морская свинка 96,2 92,1 39,3 7,6 5,8 48 68,7 85 87 , ,
Собака 97,9 86,5 16,4 3 0,5 78 , 87 , 91 81
Мини-свинья 95,9 93,2 26,9 6,4 3,5 49 52 82 92 , ,
* Получены ферментативной диссоциацией и стробированнымиОснованный на параметрах FSC и SSC (от Lima и др., 2016, с разрешения)

Таблица 1: Статистика Ho-FACS мужских зародышевых суспензий, полученных механической диссоциацией.

Дополнительный рисунок 1: Одноклеточные суспензии, полученные механической диссоциацией замороженной ткани яичка. Механическая диссоциация позволяет генерировать одноклеточные суспензии из яичной ткани разных видов млекопитающих без необходимости в видоспецифичных протоколах. Различные панели показывают клеточные суспензии, полученные для 4 видов млекопитающих. Образцы получали путем механической диссоциации замороженной ткани тестикула и окрашивали Hoechst. SPG: Сперматогония; SPC I: первичный сперматоцит; SPC II: вторичный сперматоцит; СПД: сперматид; СЗЗ: сперматозоиды. Слайды были визуализированы в конфок Л (с нижней панелью) или без (верхняя панель) передача белого света. Шкала шкалы = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Стратегия Gating для разделения живых мужских половых клеток с помощью Ho-FACS мышей яичных одноклеточных суспензий. Живые клетки (PI negative) сортируются в соответствии с флуоресценцией Hoechst. Сперматогония (SPG) идентифицируется путем прямой печати интенсивностей Hoechst-синего и красного флуоресценции. Ворота ДНК-содержимого используются для сортировки ячеек на основе синей флуоресценции Hoechst: гаплоид (C); Диплоидной (2С) и тетраплоидной (4С). Клетки в каждом пике гистограммы затем сортируются путем построения функции синей и красной флуоресценции Hoechst. SPG: Сперматогония; СПД: сперматиды; SPC II: вторичные сперматоциты; SPC I: первичные сперматоциты.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Стратегия Gating для разделения живых мужских половых клеток с помощью Ho-FACS суспензий для яичных яичек собак. Живые клетки (PI negative) сортируются в соответствии с флуоресценцией Hoechst. Сперматогония (SPG) идентифицируется путем прямой печати интенсивностей Hoechst-синего и красного флуоресценции. Ворота ДНК-содержимого используются для сортировки ячеек на основе синей флуоресценции Hoechst: гаплоид (C); Диплоидной (2С) и тетраплоидной (4С). Клетки в каждом пике гистограммы затем сортируются путем построения функции синей и красной флуоресценции Hoechst. Пик, содержащий гаплоидные клетки, можно подразделить в соответствии с диапазоном интенсивности Hoechst blue и представлять две субпопуляции сперматид: удлиненные сперматиды (затвор C ') и круглые сперматиды (ворота C' '). SPG: Сперматогония; ESPD: удлиненные сперматиды; RSPD: круглые сперматиды; SPC II:Вторичные сперматоциты; SPC I: первичные сперматоциты. Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Стратегия Gating для разделения живых мужских зародышевых клеток с помощью Ho-FACS суспензий одножильных сухожилий морских свинок. Живые клетки (PI negative) сортируются в соответствии с флуоресценцией Hoechst. Сперматогония (SPG) идентифицируется путем прямой печати интенсивностей Hoechst-синего и красного флуоресценции. Ворота ДНК-содержимого используются для сортировки ячеек на основе синей флуоресценции Hoechst: гаплоид (C); Диплоидной (2С) и тетраплоидной (4С). Клетки в каждом пике гистограммы затем сортируются путем построения функции синей и красной флуоресценции Hoechst. SPG: Сперматогония; СПД: сперматиды; SPC II: вторичные сперматоциты; SPC I: первичные сперматоциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы сделатьWnload этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Стратегия Gating для разделения живых мужских половых клеток с помощью Ho-FACS одножильных суспензий мини-свиньи. Живые клетки (PI negative) сортируются в соответствии с флуоресценцией Hoechst. Сперматогония (SPG) идентифицируется путем прямой печати интенсивностей Hoechst-синего и красного флуоресценции. Ворота ДНК-содержимого используются для сортировки ячеек на основе синей флуоресценции Hoechst: гаплоид (C); Диплоидной (2С) и тетраплоидной (4С). Клетки в каждом пике гистограммы затем сортируются путем построения функции синей и красной флуоресценции Hoechst. SPG: Сперматогония; СПД: сперматиды; SPC II: вторичные сперматоциты; SPC I: первичные сперматоциты. Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Исследование контамината соматических клетокИон в сортированных популяциях Ho-FACS. (T-SNE), состоящий из приблизительно 600 одноячеистых транскриптомов из трех подпопуляционных ворот FACS (AB). На графике t-SNE каждая точка представляет собой уникальное положение отдельной ячейки в пространстве транскриптомы, и каждая ячейка помечена своим источником FACS subpopulation gate origin (A). Визуальная количественная оценка специфичных для клеточного типа маркеров на одном ячеек t-SNE FACS (B). Загрязнение из соматических клеток оценивается менее чем на 5% и не является специфическим для одного из заселенных ворот Ho-FACS. Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Учитывая высокую консервативную динамику хроматина во время сперматогенеза у млекопитающих, целью этой работы было разработать протокол для выделения мужских половых клеток на разных стадиях дифференциации от различных тканей яичек млекопитающих ( рис. 1 ). Одним из основных препятствий при применении одного рабочего процесса к различным моделям животных является потребность в видоспецифических корректировках, особенно в отношении протоколов диссоциации тканей. Существующие методы в основном полагаются на ферментативное расщепление тканей и протоколы, которые часто различаются даже у видов 12 . Чтобы преодолеть эту проблему, описанный здесь протокол показывает применение механической диссоциации тканей для получения одноцепочечных суспензий из образцов яичек различных видов млекопитающих. Результаты показывают, что механическая диссоциация свежей ткани тестикула с этой системой хорошо работает ( рис. 2А- 2В 20 . Важно отметить, что окрашивание Hoechst, по-видимому, не оказывает существенного влияния на качество одноклеточных суспензий. Хотя в окрашенных образцах наблюдается большее количество клещей ( рисунок 2B ), лечение DNase ( рисунок 2D ) или NDA 20 может помочь предотвратить эту проблему. Предыдущие сообщения свидетельствуют о том, что механическая диссоциация ткани тестикула лучше или эффективнее, чем ферментативное переваривание тканей 5 , 20 . В соответствии с представленными здесь данными показано, что механическая диссоциация является надежным методом получения одноцепочечных суспензий из ткани тестикулярных тканей для обработки Ho-FACS.

Инкубация с Hoechst является решающим этапом, так как она влияет на сигнал, обнаруженный во время проточной цитометрии. Длительные периоды окрашивания обеспечивают лучшую селекцию типов зародышевых клеток, ноМожет быть токсичным, что приводит к гибели клеток и изменениям внутриклеточного программирования 22 . Пользователи, намеревающиеся установить культуры зародышевых клеток с помощью этого метода, должны оценить генотоксический эффект длительного воздействия Hoechst 3 , 22 и определить адекватную концентрацию и время окрашивания. Здесь 30 минут окрашивания было достаточным для обеспечения надежного разделения популяций зародышевых клеток ( рисунок 3B- 3C ). Продолжительность окрашивания потенциально может быть уменьшена до 10 минут, как показано Rodriguez-Casuriaga и др. 20 , и их следует дополнительно оценивать пользователями для представляющих интерес видов.

Согласно гипотезе, можно последовательно идентифицировать четыре популяции зародышевых клеток - SPG, SPC I, SPC II и SPD - на основе изменений хроматина зародышевых клеток у разных видов ( Рисунок 3B- 3C таблица 1 ), и поддерживают стратегию стробирования, принятую в этом рабочем процессе ( рисунок 1 ) для разных видов млекопитающих ( дополнительные рисунки 2- 5 ). Тем не менее желательно, чтобы пользователи оптимизировали стробирование в соответствии с видами и популяциями, представляющими интерес, чтобы уменьшить перекрестное загрязнение, обнаруженное для некоторых популяций (таблица 1). Это может быть достигнуто более длительными периодами инкубации во время окрашивания18 , уменьшенный расход 2 и уменьшенные размеры затвора. SPG сложнее изолировать, поскольку они являются самым редким типом клеток в яичках, а также из-за оттока красителя со временем 1 , 15 . Хотя, как показано здесь, можно обнаружить отдельные популяции SPG с помощью Ho-FACS, исследования, посвященные исключительно биологии стволовых клеток, выиграют от более строгой методики, такой как сортировка клеток с магнитной активацией (MACS; 23 ). Примечательно, что субпопуляции SPD (eSPD и rSPD) могут быть четко различимы для собаки, но не для других видов ( рис. 3C и дополнительный рисунок 3). Потенциально эти субпопуляции могут быть решены путем корректировки настроек стробирования, как описано авторами для мыши 5 . Цитограммы, сгенерированные для размера и зернистости клеток (FSC VS SSC), до нанесения функции функции Hoechst blue / red fluoresceNce, различает удлинение (низкий FSC + SSC), от округлых (высокий FSC + SSC) субпопуляций сперматидов. Разделение круглых и удлиненных субпопуляций сперматидов позволило бы провести более глубокое исследование спермиогенеза, в результате чего новое понимание конкретных молекулярных событий происходит во время дифференцировки сперматозоидов. Кроме того, как описано для мыши 1 , 2 , 12 , можно получить дальнейшее разрешение мейотических стадий, регулируя ворота FACS. Такой подход во многом принесет пользу сравнительным исследованиям мейотических событий. Хотя целостность клеток нарушается во время Ho-FACS, данные секвенирования одноядерных РНК, полученные для клеток, отсортированных с помощью этого метода (Jung et al. , Неопубликованный , дополнительный рисунок 6 ), указывает, что это надежный подход к получению клеток для молекулярных исследований зародышевой клетки биология. Тем не менее, пользователи, намеревающиеся выполнять репродуктивные анализы, такие как rOund spermatid injection (ROSI), используя клетки, выделенные Ho-FACS, должна оценивать жизнеспособность сортированных клеток и, возможно, захотите изучить альтернативные методы 24 , 25 .

Таким образом, в этой работе описывается стандартизованный метод выделения семенных клеток яичек у разных млекопитающих, создания и добавления уточнений по ранее установленным методам 2 , 12 , 20 . Такая стандартизация позволяет использовать один набор реагентов и один рабочий процесс для разных видов млекопитающих, способствуя генерации данных для сравнительных исследований биологии зародышевых клеток. Кроме того, диссоциация механической ткани преодолевает препятствия видоспецифических корректировок, которые могут приводить к методологической изменчивости, что почти невозможно объяснить. Кроме того, сокращенное время выполнения и манипуляции ограничивают возмущения ex vivo celДо минимума. В этом отношении Ho-FACS значительно быстрее по сравнению с другими методами изоляции зародышевых клеток, такими как STA-PUT и elutriation 6 , 7 . Более того, одновременное разделение 4 зародышевых популяций в том же эксперименте возможно только с помощью FACS. Учитывая свойства красителя Hoechst, структура клеток и виды РНК сохраняются, и поэтому клетки могут быть использованы для дальнейших молекулярных исследований ниже по течению. Важно отметить, что, поскольку Ho-FACS использует атрибуты хроматина для распознавания типов зародышевых клеток, успешное выполнение этого рабочего процесса у 5 разных видов сильно поддерживает его применение для других млекопитающих. Представленные здесь результаты показывают, что сперматогенез может быть уникальным процессом дифференциации клеток, который можно было бы решать во многих видах млекопитающих с использованием одного протокола. Таким образом, в эпоху «omics» и системной биологии эта технология обеспечивает средства для эволюционного приложенияПлотва по вопросам биологии мужских зародышевых клеток, включая исследования эпигенетики, регуляции и разнообразия белков во всем сперматогенезе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы не заявляют никаких конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят больницу Hillside Animal Hospital (Сент-Луис, Миссури) для собак; Джейсон Аранд и лаборатория доктора Теда Цицерона в Вашингтонском университете в Сент-Луисе (WashU) за предоставление крысиных яичек и Брайан Таберс для оказания помощи в сборе; Джаред Харток и лаборатория доктора Солт в WashU для яиц морских свинок; И д-р Майкл Тэлкотт в Отделе сравнительной медицины в WashU для миниатюрного свиного яичка. Авторы также признают Раковый центр Элвина Дж. Ситмана в Школе медицины Вашингтонского университета и Барнс-еврейскую больницу в Сент-Луисе, штат Миссури, за использование ячеистого цитометрического ядра Siteman, который предоставил персональную службу сортировки клеток. Рак-центр Siteman частично поддерживается грантом поддержки NCK Cancer Center № P30 CA91842.

Это исследование было профинансировано докторантурой FCT [SFRH / BD / 51695/2011 до ACL], грантами от Национального института здоровья США [R01HD078641 и R01MH101810 до DFC] и исследовательский контракт FCT [IF / 01262/2014 на AML].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde VWR #15710 4% PFA, For fixing sorted cells
Medimachine BD Biosciences #340588; System for testis dissociation
1X Dulbecco modified Eagle medium Life Technologies #31053 DMEM, for testis dissociation
Medicon BD Biosciences #340591 Disaggregation cartridge for testis dissociation
Fetal bovine serum Thermo Scientific #10082139 FBS, for FACS collection
Hoechst 33342 Invitrogen #H3570 Hoecsht, For FACS staining
40 µm cell strainer GREINER BIO-ONE #89508-342 For testis dissociation
100x 15 mm petri dish Falcon #351029 For testis dissection
5 mL polypropylene round-bottom tubes Falcon #352063 For FACS collection
1.5 mL Eppendorf tubes VWR #20170-650 For FACS collection
3 mL needless syringe BD Biosciences #309657 For testis dissociation
50 mL conical tube MIDSCI #C50R For testis dissociation 
Propidium Iodide Invitrogen #L7011 PI, For FACS staining
MoFlo Legacy cell sorter Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Summit Cell Sorting software Beckman Coulter #ML99030 For FACS
Phosphate buffered saline Thermo Scientific #AM9625 PBS, For microscopy
Microscopic glass slide Fisher Scientific #12-544-4 For microscopy
Glass coverslip Fisher Scientific #12-548-87 For microscopy
Disposable transfer pipette (3 mL) Samco Scientific #225 For testis dissociation
DNase I Roche #10104159001 For testis dissociation
Carbon steel surgical blade Miltex #4-111 For testis dissection
Countess automated cell counter Invitrogen #C10227 For automatic cell counting
Trypan blue solution (0.4%) Sigma #T8154 For viability staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

Tags

Биология развития выпуск 125 сравнительное воспроизведение сортировка клеток с флуоресцентной активацией (FACS) Hoechst-33342 мужские зародышевые клетки механическая диссоциация сперматогенез яички,
Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J.,… More

Lima, A. C., Jung, M., Rusch, J., Usmani, A., Lopes, A. M., Conrad, D. F. A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55913, doi:10.3791/55913 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter