Summary
Dette værk beskriver standardiseringen af en metode til opnåelse af rensede kimcellepopulationer fra testikelvæv af forskellige pattedyrsarter. Det er en simpel protokol, der kombinerer mekanisk testis dissociation, farvning med Hoechst-33342 og propidiumiodid og FACS sortering, med brede anvendelser i sammenlignende undersøgelser af reproduktionstoksikologisk biologi.
Abstract
Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) har været en af de metoder, der er valgfri til at isolere berigede populationer af pattedyrs testikulære kimceller. I øjeblikket tillader det diskriminering af op til 9 murine kimcellepopulationer med højt udbytte og renhed. Denne højopløsning i diskriminering og rensning er mulig på grund af unikke ændringer i kromatinstruktur og mængde i hele spermatogenese. Disse mønstre kan fanges ved hjælp af flowcytometri hos hankimceller farvet med fluorescerende DNA-bindende farvestoffer, såsom Hoechst-33342 (Hoechst). Heri er en detaljeret beskrivelse af en nyudviklet protokol til isolering af pattedyrs testikelkimceller. Kortfattet frembringes enkeltcellesuspensioner fra testikelvæv ved mekanisk dissociation, dobbeltfarvet med Hoechst og propidiumiodid (PI) og behandlet ved flowcytometri. En seriel gating-strategi, herunder udvælgelsen af levende celler (PI-negative) med forskellige DNA-indhold (Hoechst-intensitet), jegS anvendt under FACS sortering for at diskriminere op til 5 bakterie celletyper. Disse indgår med tilsvarende gennemsnitlige renheder (bestemt ved mikroskopi evaluering): spermatogoni (66%), primære (71%) og sekundære (85%) spermatocytter og spermatider (90%), yderligere adskilt i runde (93%) og forlængende (87%) subpopulationer. Udførelse af hele arbejdsgangen er ligetil, giver mulighed for isolering af 4 celletyper samtidigt med den relevante FACS-maskine og kan udføres på mindre end 2 timer. Da reduceret behandlingstid er afgørende for at bevare fysiologien af ex vivo celler, er denne metode ideel til nedstrøms høj-gennemstrømningsundersøgelser af mandlig kimcellebiologi. Desuden eliminerer en standardiseret protokol til multispecies oprensning af mammakimceller metodologiske kilder til variabler og tillader et enkelt sæt reagenser at blive anvendt til forskellige dyremodeller.
Introduction
På grund af manglen på et in vitro- system, der er repræsentativt for spermatogenese-progression, og tilstedeværelsen af stor cellulær heterogenitet i testis kræver undersøgelser af mandlig kimcellebiologi robuste teknikker til at isolere berigede populationer af specifikke celletyper. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) er blevet anvendt i vid udstrækning til dette formål 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , da det giver høj udbytte og renhed og overgår andre isoleringsmetoder i antallet af kimcelletyper, som den kan identificere og Vælg 6 , 7 , 8 . Princippet om flowcytometrianalyse er baseret på påvisning af differentielle lysmønstre efter laserstråle-excitation af enkeltceller. Når en celle passerer gennem laseren, afspejler den / spredter lysetI alle vinkler, proportional med cellestørrelse (forward scatter; FSC) og til intracellulær kompleksitet (side scatter; SSC). Se Ormerod 9 for detaljerede oplysninger om flowcytometri.
Mandlige kønsceller undergår specifikke modifikationer i DNA-indhold, kromatinstruktur, størrelse og form gennem forskellige stadier af spermatogenese. Således kan forskellige cellepopulationer identificeres og adskilles ved at kombinere lysfordeling og DNA-farvning med fluorescerende farvestoffer 10 , 11 . Adskillige farvestoffer kan anvendes til dette formål (gennemgået i Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 ), såsom Hoechst-33342 (Hoechst), som ofte har været anvendt i flowcytometrianalyse af testikelceller i det sidste årti 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN excitation med UV-lys udsender Hoechst blå fluorescens proportionalt med det cellulære DNA-indhold, mens langt rødt fluorescens afspejler variabilitet i kromatinstruktur og komprimering 1 , 13 , 14 . Som et resultat udviser male kimceller i forskellige trin af differentiering specifikke mønstre under FACS af Hoechst-farvede enkeltcellesuspensioner (Ho-FACS; 1 , 12 ). Interessant nok er intensiteten af Hoechst-blå fluorescens på grund af en mekanisme for farveudstrømning, der kun er aktiv under spermatogoniumfasen, ikke proportional med chromatinindholdet i disse celler, og de klynker som en sidepopulation under Ho-FACS 15 . Desuden giver kombination af Hoechst-farvning med det ikke-permeante farvestofpropidiumiodid (PI) brugere mulighed for at diskriminere levende (PI-negative) fra døde (PI-positive) celler under FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Denne strategi er tidligere blevet anvendt i flowcytometriske analyser af testikelkimceller og optimeret meget i musen for at diskriminere op til 9 kimcelletyper, herunder celler i 4 forskellige stadier af meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Med henblik på dette arbejde har Hoechst-farvning tre hovedfordele. For det første er Ho-FACS blevet anvendt succesfuldt på isoleringen af hankimceller i musemodellen 1 , 2 , 12 og andre gnavere såsom rotte og marsvin 17 , 18 , 19 . For det andet er Hoechst et cellepermeant farvestof og kræver ikke membranpermeabilisering, så det preserVes celle integritet. Endelig kræves ingen RNase-behandling, da Hoechst binder fortrinsvis til poly (d [AT]) DNA-sekvenser 1 , 20 , hvilket betyder, at RNA bevares og ud over DNA og proteiner kan anvendes til yderligere nedstrøms molekylære undersøgelser af kim Celle differentiering.
På trods af ligheden i DNA-ploidi og / eller farvningsevne observeret i flowcytometrianalyser af pattedyrsarter (gennemgået i Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 ) har der været en stor variabilitet i protokollerne beskrevet for mannlig bakteriecelleisolering ved flowcytometri. Forskellige undersøgelser har anvendt specifikke protokoller til vævsdissociation og anvendte forskellige DNA-bindende farvestoffer (alene eller i kombination) og FACS-gatingstrategier i forskellige modelorganismer, hovedsagelig musen, rotte og marsvin. Derfor kan direkte sammenligning af data indsamlet for forskellige arter påvirkes af unaccoUnted tekniske artefakter som følge af variabilitet mellem metoder. Det er vigtigt, at den slående bevarelse af chromatin-dynamik gennem pattedyrspermatogenese (2N-4N-2N-1N) antyder, at en standardiseret protokol kan anvendes tværgående på en række pattedyrsarter.
Målet med denne undersøgelse var at udvikle en enkelt arbejdsgang, der kan anvendes på forskellige pattedyrarter ved at kombinere og tilpasse tidligere offentliggjorte teknikker 2 , 20 . Standardisering af en fremgangsmåde til vævsbehandling blev opnået ved at udføre mekanisk dissociation for at overvinde behovet for arterespecifikke tilpasninger, der kræves til enzymatisk fordøjelse 5 . Det er bemærkelsesværdigt, at mekanisk dissociation af gnavere testikelvæv har vist sig at udføre bedre end enzymatisk vævsfordøjelse 20 og Ho-FACS af enkeltcellesuspensioner frembragt ved begge metoder udviserDet sammenlignelige resultater 5 . Som principprincip beskriver denne protokol de indstillinger, der anvendes til at isolere op til 5 kimcellepopulationer: spermatogonia (SPG); Primære (SPC I) og sekundære spermatocytter (SPC II) og spermatider (SPD) - runde (rSPD) og forlængelse (eSPD). Det er vigtigt, at det er let at gennemføre i laboratoriet, hvor hovedkravene er systemet til vævsdissociation og adgang til en celle sorterer udstyret med en UV laser. Denne arbejdsgang ( Figur 1 ) er hurtig og ligetil og tillader samtidig isolering af 4 bakteriepopulationer fra frisk testikelvæv på mindre end 2 timer. Den reducerede behandlingstid er afgørende for at opretholde cellulær integritet til yderligere nedstrøms procedurer. Desuden tyder den succesfulde præstation i 5 forskellige arter, at den kan anvendes bredt i pattedyrskladet, hvilket gør den til den ideelle metode til at isolere kønsceller til sammenlignende studier af pattedyrs reproduktiv biollogi.
Denne protokol består af tre hovedafsnit, bortset fra forberedende trin: (1) den mekaniske dissociation af testikelvæv og (2) farvning af testikelceller med Hoechst og PI efterfulgt af (3) FACS sortering af relevante spermatogene celler. Når de er opsamlet, kan disse berigede populationer af forskellige mammale testikulære kimceller anvendes til en lang række anvendelser. Denne protokol beskriver en dissociationmetode "one-size fits all" for at rense manlige kønsceller fra mange forskellige pattedyrsarter. Afhængigt af typen af undersøgelse, som brugerne ønsker at udføre med de isolerede kimceller, kan andre medier eller buffere anvendes. De følgende protokolstrin er til generering af encellesuspensioner fra en hel murint testis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer beskrevet nedenfor overholdt forskrifterne fra Animal Studies Committee ved Washington University i St. Louis.
1. Forberedelser til mekanisk dissociation protokol
- For-våd en 50 μm disponibel vævs-disaggregeringspatron til dissociation af en hel murint testis.
BEMÆRK: Denne disponible vævsopdelingspatron indeholder mikroblader, der er designet til opskæring af væv og et immobilt stålnet med ca. 100 sekskantede huller. Forskellige størrelser af mesh til vævsdisaggregeringspatroner er tilgængelige for at tilpasse denne protokol baseret på arter og ønskede celletyper. 50 μm patroner blev anvendt til alle pattedyrarter, der er nævnt i dette papir.- Indsæt 1 ml iskold fenol rød 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) på 50 μm disponibel vævs-disaggregeringspatron.
BEMÆRK: Fenolrød kan interferere med påvisning af røde fluorerCence under FACS. - Aspirer 1x DMEM fra vævsdispergeringspatronen med en 3 ml nålefri sprøjte fra sprøjteporten.
- Indsæt 1 ml iskold fenol rød 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) på 50 μm disponibel vævs-disaggregeringspatron.
- Tænd vævsopdelingssystem ved at trykke på "ON" -knappen. Dette system kræver ikke "opvarmning" tid.
- For-våde tre 40 μm engangs filtre med iskold 1x DMEM. Anbring hvert 40 μm engangsfilter på et 50 ml konisk rør. Pipetter 1 ml 1 x DMEM og lad det passere gennem væsken.
- Forbered en 100 mm x 15 mm petriskål til opsamling af testikelvæv. Pipetter 500 μl 1x DMEM på petriskålen.
2. Fremstilling af testikelvæv til mekanisk dissociationprotokol
- Dissect en mandlig mus for omhyggeligt at fjerne friske hele testikler eller testikelfragmenter (hvis de beskæftiger sig med andre pattedyrarter) med kirurgiske saks og pincet.
BEMÆRK: Sørg for, at væv er fri for fedt og nekrose. fr Esh testikulære væv genererer overlegen enkeltcelle suspensionskvalitet end frosne væv.- Overfør indsamlede testikler / fragmenter til den fremstillede 100 mm x 15 mm petriskål indeholdende 500 μl 1 x DMEM.
- Skyl vævet forsigtigt i 1x DMEM for at fjerne røde blodlegemer (hvis til stede).
- Fjern forsigtigt tunica albuginea. Tykkelsen af tunica albuginea vil variere i forskellige arter.
- Grib den ene ende af testis med pincet.
- Punkter den anden ende af testiklerne med en skalpell, mens du stadig holder den ene ende af testiklerne med tang fra foregående trin.
- Skraber testikelrør med en skalpel, mens du stadig holder den ene ende af testis med tang i trin 2.2.1.
- Skær testikelrør i stykker på 2-3 mm 3 ved hjælp af en skalpel.
3. Opnåelse af enkeltcellesuspensioner ved mekanisk dissociation af testikelvæv
Ontent "> BEMÆRK: De dissociationstrin, der beskrives nedenfor, er beregnet til en voksen musestest. Mængder af testikelvæv fra unge mus eller ikke-murine arter bør tilpasses i overensstemmelse hermed. Ungdyr må ikke indeholde alle stadier af kimceller. Testikelvævssammensætning ændres i yngleperioder i sammenligning med ikke-parringssæson.- Overfør de små testikelrørstykker til den forvævede 50 μm vævsopdelingspatron ved brug af tang og tilsæt 1 ml 1x DMEM.
- Indsæt vævsdisaggregeringspatronen i vævsdisaggregationssystemet og behandl i 5 minutter ved at dreje knappen fra "standby" til "run" -tilstanden.
- Fjern vævsdispergeringspatronen fra vævsdisaggregeringssystemet og aspirationscelle suspension med en 3 ml sprøjte, der ikke kan fjernes, fra sprøjteporten.
- Aspirer et par gange for at fjerne al væske fra vævsdispergeringspatronen. IkkeAlle 1 ml kan udvindes fra vævsdispergeringspatronen.
- Pass den aspirerede celle suspension gennem to engangs for-fugtede 40 μm filtre. Filtrer to gange for at fjerne eventuelle celleaggregater.
- Anbring et forvædet 40 μm filter i et 50 ml konisk rør. Tilsæt direkte aspirerede celler i sprøjten på 40 μm filteret. Pipette pass-through enkeltcelle suspension med en engangspipette.
- Fjern det brugte forvædet 40 μm filter og anbring et andet forvædet 40 μm filter i det 50 ml koniske rør. Pipetter den opsamlede enkeltcellesuspension på det rene 40 μm filter.
- Saml filtreret encellesuspension med en ren engangspipette.
- Pipettefiltreret cellesuspension tilbage til 50 μm vævsdispergeringspatronen og behandle i yderligere 5 minutter i et vævsdisaggregationssystem.
- Genvinde al væske fra vævsdisaggregatetPå patronen.
4. Farvning med Hoechst og Propidium Iodid (PI)
- Overførsel genvundet celle suspension fra 50 μm væv disaggregation patron til et rent 1,5 ml rør. Ca. 1-1,5 ml enkeltcellesuspension udvindes.
- Opdele den genvundne enkeltcellesuspension i fire 1,5 ml eller 5 ml rør.
- For de første tre rør, pipette 150 μL enkeltcelle suspension og pipette resten af encellesuspension i det sidste af de fire rør (ca. 550 μl enkeltcellesuspension).
BEMÆRK: Mængden af encellesuspension i det sidste rør kan variere baseret på effektiviteten af cellesuspensiongenvinding ved trin 3.6.
- For de første tre rør, pipette 150 μL enkeltcelle suspension og pipette resten af encellesuspension i det sidste af de fire rør (ca. 550 μl enkeltcellesuspension).
- Sæt første rør af de fire rør som en ubestemt kontrol for FACS-session.
- Forbered enkeltfarvestoffarvede (PI eller Hoechst) cellesuspensioner som kontroller. Tilsæt 2,5 μL Hoechst eller 1 μl PI til hvert rør (andet og third).
- Forbered et dobbeltfarvet rør. Dette vil blive brugt til at indsamle kimcelle subpopulationer. Tilsæt 2,5 μL Hoechst og 1 μl PI til det sidste rør.
BEMÆRK: Hoechst har en holdbarhed på 2-3 måneder. Brug af ældre lagre af farvestoffer vil medføre væsentlige ændringer under FACS-sessionen. - Inkubér ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. Placer prøver i en rørrotator eller vend 1,5 ml rør hver 5-10 minutter.
- Filtercellesuspension med en forvædet 40 μm filter og hold den filtrerede opløsning på is og i mørket indtil FACS sessionen.
BEMÆRK: Filtreringstrinnet er nødvendigt for at forhindre celleklumper for FACS. Derudover kan behandling med DNase (se figur 1 ) eller 2-Naphthol-6,8-disulfonsyre-dikaliumsalt (NDA 20 ) anvendes til at begrænse celleklumpning. Forlængede venteperioder påvirker det fluorescerende signal, der detekteres under FACS, og kan resultere i øget celledød.5. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) Opsætning og oprensning af testikelceller
- Forbered FACS opsamlingsrør.
- Belæg 5 ml polypropylen rundbundet rør eller 1,5 ml rør med 400 μL FBS til celleindsamling. Dekanter overskydende FBS efter belægning.
- Tilsæt FACS-samlingsmedium (1x DMEM + 10% føtalt bovint serum, FBS) til rørene: 1 ml for 5 ml rør eller 100 μl for 1,5 ml rør.
- Opsæt passende sorteringsbetingelser i celle sorter og software.
BEMÆRK: Andre celle sorteringsmaskiner og analysesoftware kan bruges med de tilsvarende opsætnings- og gatingstrategier, der beskrives nedenfor. De her beskrevne betingelser blev tilpasset fra Gaysinskaya og Bortvin 2 , Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 og Getun et al. 4- Indlæs en ultraviolet laser med 463/25 nm båndpasfilter for at detektere Hoechst Blue og 680 nm LP båndpasfilter for at detektere Hoechst rød og detektere PI.
- Brug et 555DLP dichroisk spejl for at skelne mellem blå fra rød fluorescens.
- Brug en 70 μm dyse og sorter celler med en hastighed på 1000-2000 celler / sekund.
BEMÆRK: Sorteringseffektivitet påvirkes direkte af strømningshastigheden. Højt flow (> 3500 begivenheder / s) øger sorteringshastigheden, men resulterer i forurening af befolkninger. Se reference 12 for yderligere information.
- Sæt porte ved hjælp af kontrolprøver.
- Læg og kør ufarvet prøve.
- Ekskluder celleaffald baseret på FSC vs SSC plot mønster. Celleaffald vil dukke op i nedre venstre kvadrant af plottet. Vildt sæt tærsklen for celleaffald af brugeren eller celle sorterings tekniker.
- Gate på enkeltceller ved at justere tærsklen for FSC og pulsbredde. Forskellige cellesortere har forskellige måder at skelne påGuish singlets. Som pulsbredde afspejler tidcellerne, der tager sig for at krydse laseren, har enkeltceller lavere værdier sammenlignet med multicellulære aggregater. Justering af tærskel på et plot for FSC vs pulsbredde kan bruges til at vælge for singlets.
- Indstil optimale fotomultiplikatorrør (PMT) spændinger.
- Brug både ufarvede og enkeltfarvede farvede celler til at fastlægge tærsklen for PI eller Hoechst fluorescenssignalet.
BEMÆRK: Det er vigtigt at optimere baseline PTM spændinger for de celler af interesse for at etablere det korrekte fluorescensområde for hvert farvestof. Dette er afgørende for optimal signaldetektering og følsomhed. De ufarvede og enkeltfarvede kontrolceller anvendes til at etablere en række negativt og positivt farvede celler med PI og / eller Hoechst farvestoffer og minimere støj i signaler. For yderligere forklaringer om optimering af PMT-spænding ved hjælp af kontrolceller henvises til Gaysinskaya og Bortvin 2 - Gate på levende celleS baseret på PI farvning (PI negative) og FSC plot. Døde celler vil være positive for PI-fluorescens.
- Indstil DNA-indholdsporten ved at udarbejde et histogram af celleantal baseret på Hoechst-blå fluorescens. 3 toppe med stigende koncentrationer af Hoechst blå fluorescens skal forekomme, der repræsenterer haploid (1C), diploid (2C) og tetraploid (4C) celler. Indstil 3 porte, en for hver top.
- Overhold mindst 500.000 hændelser på FSC vs SSC-plot, før du fortsætter med at gating på bakteriepopulationer.
- Gate forskellige kimcellepopulationer.
- Læg Hoechst / PI-farvet prøve.
- Indstil de første 3 forældreporte, der er fælles for alle populationer.
- Ekskluder celleaffald baseret på FSC vs SSC-plottet. Vælg singlets baseret på FSC vs pulse-bredde plot. Vælg levende celler ved at give PI negative celler.
- Definer spermatogonia gate.
- Plot PI negative celler baseret på Hoechst blå og rød fluorescensintensiteter. Spermatogonia forekommer som en sidepopulation (se figur 1 ).
- Definer porte for de resterende bakteriepopulationer. BEMÆRK: Se figur 1 og supplerende figur 2 for visuelle detaljer.
- Plot PI-negative celler i DNA-indholdsporten.
- For spermatider dør toppen med laveste Hoechst fluorescens (1C).
- For spermatocytter II, dækker toppen med mellemliggende Hoechst fluorescens (2C).
- For spermatocytter jeg, dækker toppen med højeste Hoechst fluorescens (4C).
- Plot Hoechst blå og rød fluorescensintensitet for at forbedre spermatocytter og spermatidspopulationer fra DNA-indholdsporte.
- Saml de udvalgte subpopulationsporte ind i de oprindeligt fremstillede rør. Hver testis vil tage et gennemsnit på 45 min til 1,5 h for at indsamle ca. 0,5-6,0 x 10 6 celler for hver subpopulation.
BEMÆRK: Forlænget celleeksponering til Hoechst maDu ændrer placeringen af befolkningen med tiden lidt. Opdater indstillingerne efter 20-30 min FACS. Maksimal udbytte for hver subpopulation vil være betinget af effektiviteten af dissociationstrinnet.
6. Mikroskopisk evaluering af rensede celler
- Spin opsamlede celler ved 500-600 xg ved 4 ° C i 10 minutter.
- Re-suspender cellepellet med 1 ml iskold 1x phosphatpufferopløsning (PBS) eller 1x DMEM.
BEMÆRK: Resuspensionsvolumenet kan justeres i henhold til antallet af celler sorteret og den ønskede endelige koncentration. - Pipetter 40 μl vaskede celler på en ren glasskinne og læg et dækslip.
- Fiks de resterende celler med 4% paraformaldehyd (PFA) og opbevar faste celler ved 4 ° C i mørke til fremtidig reference.
- Pipetter 100 μL 4% PFA direkte i opsamlingsrørene.
- Vortex rørene eller pipetten kort få gange for at sikre en god blanding af cellesuspensionen.
- Visualiser de forberedte lysbilleder i et mikroskop udstyret med en UV-lampe til at detektere Hoechst fluorescens under et 63X objektiv. Se afsnittet Resultater - Morfologisk vurdering af sorterede kimcellepopulationer - for yderligere detaljer om, hvordan man identificerer specifikke kimcelletyper.
- Forbered FACS opsamlingsrør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkeltcellesuspensioner fra mekanisk dissociation af testikelvæv
Figur 2 sammenligner enkeltcellesuspensioner opnået ved mekanisk dissociation af mus-testikelvæv under forskellige betingelser. Prøver opnået ved behandling af frisk væv, ufarvet ( Figur 2A ) eller farvet med Hoechst ( Figur 2B ), viser tilstedeværelsen af enkeltceller i forskellige trin af differentiering, og vigtigere synes den cellulære struktur at blive bevaret, herunder flagella af spermatozoer. Selvom der blev observeret nogle klumpning og affald i de farvede prøver, som blev reduceret ved tilsætning af DNase efter dissociation ( figur 2D ), viser disse resultater, at Hoechst-farvning ikke signifikant ændrer kvaliteten af enkeltcellesuspensionerne. Interessant nok er enkeltcellesuspensionEnsioner kan også opnås fra frosset væv til musen ( figur 2C ) og andre pattedyrsarter - rotte, hund, marsvin og minikvin ( supplerende figur 1 ) ved mekanisk dissociation. Forskellige celletyper er synlige og identificerbare i disse prøver; Forarbejdning af frosset væv synes imidlertid at føre til forøget celledød og sammenklumpning og et generelt lavere cellulært udbytte. Som sådan anbefales det stærkt at fremstille enkeltcellesuspensioner fra frisk væv til yderligere nedstrøms applikationer.
Kvaliteten af enkeltcellesuspensioner fremstillet ud fra frisk testikelvæv af mus, rotte, hund, marsvin og mini-gris blev vurderet under Ho-FACS ( tabel 1 ). Efter udelukkelse af cellulære affald er 95,7-98,4% af celler singler, og fra disse 86,5-93,8% er i live, som vist ved kvantificering af PI-negative celler (se protokol ). Disse resultaterTs viser, at mekanisk dissociation er en pålidelig metode til at fremstille enkeltcellesuspensioner for flowcytometri fra testikelvæv af forskellige pattedyrsarter.
Ho-FACS at isolere kimceller fra testikelvæv af forskellige pattedyrsarter
Efter mekanisk dissociation farves enkeltcellesuspensioner med Hoechst og PI og behandles af FACS. Som nævnt ovenfor tillader Hoechst-farvning forskelsbehandling af celler i forskellige trin af differentiering baseret på chromatinmængde og -struktur, hvorimod PI-farvning af ikke-permeabiliserede celler adskiller levende fra døde celler. Efter filtrering af celleaffald og multicellulære aggregater udvælger PI-porten celler med intakte membraner (PI-negativ; Figur 1 ). Levende celler analyseres derefter baseret på Hoechst fluorescens: blå er proportional med DNA-indhold og øger rødtFluorescens afspejler mindre kondenseret chromatin og strukturelle variationer. Som sådan forventes mandlige kimceller fra forskellige stadier at klynge i specifikke regioner af cytogrammer, der udformer funktionen blå / rød Hoechst fluorescens ( Figur 3A ).
Faktisk viser Ho-FACS-plotterne for de forskellige arter tilstedeværelsen af forskellige cellepopulationer baseret på Hoechst-fluorescens ( Figur 3B -3C ). Selv om disse plot er tilstrækkelige til at diskriminere kønscellepopulationer, kan en DNA-indholds (C) port defineres 2 for at begrænse krydskontaminering. Denne gate genereres af et histogram af celletællinger i funktion af Hoechst blå fluorescensintensitet. For alle arter kan tre toppe detekteres og repræsentere celler med 1C, 2C og 4C ( figur 1 og supplerende figurer 2-5 ). Især som previOven nævnt, spermatogonia er en side befolkning og kan ikke pålideligt gated baseret på histogrammer af DNA indhold. Derfor er denne population gated efter udelukkelse af døde celler, baseret på Hoechst blå / rød fluorescens plots ( Figur 1 ). Denne strategi er repræsenteret i figur 1 for rotten og supplerende figur 2-5 for de resterende arter. Det er vigtigt at bemærke, at da Hoechst fluorescens alene kan diskriminere de forskellige kimcelletyper, er både PI- og DNA-indholdsportene valgfrie. De blev medtaget i denne strategi for at vælge levende celler og reducere krydsforurening, henholdsvis. Som opsummeret i tabel 1 afspejler kvantificering af celler i DNA-indholdsporten den relative andel af celler i forskellige trin af spermatogenese. Som forventet er 1C-celler de mest almindelige og repræsenterer spermatidpopulationer efterfulgt af 2C-celler (SPC II) og 4C-celler (SPC I). iMPORTANtly er dette mønster bevaret på tværs af arter, og små forskelle kan afspejle interspecifik variabilitet i kimceller og cyklusserne af det semifinale epithelium 21 .
Efter Ho-FACS kan celleintegritet vurderes ved hjælp af trypanblåt farvning. Andelen af levende celler efter 1 time FACS varierede fra 27% (SCP I) til 67% (SPD) for musen, hvilket indikerer, at varigheden af sortering og eksponering for Hoechst øger celledød. For brugere, der ønsker at dyrke de sorterede celler, bør Hoechst-koncentrationen og varigheden af Ho-FACS justeres for at forbedre celleoverlevelse. Ikke desto mindre er RNA-sekventeringsdata blevet genereret for enkeltceller isoleret ved anvendelse af denne metode (Jung et al ., Ikke-offentliggjort), hvilket indikerer, at disse celler er egnede til molekylære undersøgelser af kimcellebiologi. Dette datasæt blev brugt til at detektere potentiel forurening af bakteriepopulationer med somatiske celler ( Supplerende Figur 6
Morfologisk vurdering af sorterede kimcellepopulationer
Da kimceller undergår drastiske morfologiske ændringer gennem spermatogenese, er det muligt at estimere renheden af isolerede populationer ved mikroskopi. Som en henvisning illustrerer figur 4 den generelle morfologi af forskellige mandlige kimceller typer fra 4 pattedyrsarter (fra Lima et al. 5 ). Kromatinfordeling og kondensering samt cellestørrelse og form viser unikke og velkarakteriserede mønstre i forskellige celletyper. SPG har tydelig pericentrisk heterochromatin, som pletter stærkt til Hoechst, og er små og runde i form (Spg i figur 4B ). Spermatocytter er større granulerede celler. Kerner af SPC I er let identificerbare med chromatin variatioNs karakteristisk for meiotiske celler (Spc I i Figur 4B ), medens SPC II er bukuleret eller i diakinesis (Spc II i Figur 4B ). Endelig er SPD små haploide celler med rund eller langstrakt form (Spd i figur 4B ). Navnlig svarer rSPD til SPG i størrelse og form, men tydeligt skelnes af tilstedeværelsen af lokaliserede chromocentre. Baseret på disse karakteristika blev sorterede cellepopulationer evalueret for berigelse af specifikke celletyper ( tabel 1 ). SPD- og SPC II-populationer var stærkt beriget for celletypen af interesse, hvorimod SPC I og SPG viste en vis grad af forurening med andre celletyper, især for guinea pig og mini pig prøver. Interessant nok var gatingstrategien tilstrækkelig til hundprøven til at diskriminere runde fra langstrakte spermatider ( figur 3C ; supplerende figur 3 ; tabel 1
Figur 1: Arbejdsstrøm af Ho-FACS-isolering af pattedyrsmandkimceller. Dette billede illustrerer den generelle protokol for kimcelleisolation af pattedyrkimceller med repræsentative data fra anvendelsen af denne protokol til rotte testis. Ho: Hoechst. Fra Lima et al. 5 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Enkeltcellesuspensioner genereret ved mekanisk dissociation af Mus testikelvæv. Prøver opnået fra friskt væv ( AB ) viser en række intakte bakterietyper og meget lidt snavs. I sammenligning med ufarvede celler ( A ) blev der observeret en vis celleklumpning for Hoechst-farvede cellesuspensioner ( B ), som kan reduceres ved at tilføje DNase (slutkoncentration på 10 μg / ml) til prøven umiddelbart efter dissociation ( D ). Frosset testikelvæv kan også anvendes til opnåelse af enkeltcellesuspensioner ved mekanisk dissociation ( C ). Det ser imidlertid ud til, at processen med flashfrysning og optøning forud for vævsdissociation resulterer i mere snavs, celledød og generelt mindre cellulært udbytte. Efter dissociation (se protokol) blev prøverne spundet i 10 minutter ved 4 ° C og genopslæmmet i 1x DMEM inden montering af diaserne. Sorte stænger = 50 μm. Billeder opnået ved hjælp af et opretstående hvidt lysmikroskop udstyret med UV-lampe.Ove.com/files/ftp_upload/55913/55913fig2large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ho-FACS af pattedyrkimceller. Specifikke populationer præsenterer unikke mønstre af Hoechst fluorescens under FACS ( A ). Som Hoechst blå fluorescens afspejler variationer i kromatinindholdsklynger af haploid ( C ); Diploid (2C) og tetraploid (4C) celler er placeret i områder af FACS-plottet med stigende Hoechst-blå fluorescens. Plotter dannet som en funktion af Hoechst blå / rød fluorescens viser klynger af forskellige cellepopulationer for de forskellige pattedyrarter, der testes ( BC ). SPG: Spermatogonia; SPC I: Primære spermatocytter; Pre-Lep: Pre-Leptotene Spermatocytter; Lep: Leptotenspermatocytter; Dip: Diplotene spermatocytter; SPCII: Sekundære spermatocytter; SPD: Spermatider; ESPD: forlængende spermatider RSPD: runde spermatider. Tilpasset fra Lima et al. 5 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kimcellers morfologi i forskellige udviklingsstadier fra fire pattedyrsarter. Denne figur viser sektioner af testikelvæv farvet med Hoechst (A) og det generelle aspekt af forskellige manlige kimcelle typer sorteret efter Ho-FACS (B) fra rotte, marsvin, hund og mini grise. Som cellestørrelse varierer form og chromatin konformation dramatisk gennem spermatogenese, disse kan bruges til at tildele celler til forskellige stadier af differentiering. Spermatogonia (Spg) er små og runde cElls med særskilt pericentrisk heterochromatin og udviser en høj intensitet af Hoechst fluorescens. Spermatocytter er de største bakterieceller og viser variable kromatinkonfigurationer. Kerner af primære spermatocytter (Spc I) udviser chromatinvariationer, der er karakteristiske for meotiske celler, mens sekundære spermatocytter (Spc II) er binukleinerede eller i diakinesis. Spermatider (Spd) har runde eller langstrakte figurer afhængigt af spermiogenese-scenen og er små haploide celler. Selvom runde spermatider og spermatogonia er ens i størrelse og form, kan de førstnævnte skelnes af tilstedeværelsen af lokaliserede chromocentre. Lysbilleder blev forberedt for hver sorteret celletype efter Ho-FACS og blev visualiseret i et konfokalt mikroskop: 63X forstørrelsesobjektiv med (nederste panel) eller uden (øverste panel) hvidt lys transmission. Fra Lima et al. 5 med tilladelse. Vær venligKlik her for at se en større version af denne figur.
| % Celler i DNA-indholdsporten | Renhed af sorterede kimcellepopulationer (%) | |||||||||||
| Arter | % Singlets | % Levende celler | 1C | 2C | 4C | Spg | Spc I | Spc II | Spd | rSpd | ESFP | |
| Mus | 98,4 | 92,5 | 34,7 | 3.9 | 3,72 | 74 | 82 | 87,5 | 95,2 | 95 * | 92 * | |
| Rotte | 95,7 | 93,8 | 37,7 | 5.3 | 5.4 | 83 | 81 | 82 | 87 | . | . | |
| Marsvin | 96,2 | 92,1 | 39.3 | 7.6 | 5.8 | 48 | 68,7 | 85 | 87 | . | . | |
| Hund | 97,9 | 86.5 | 16,4 | 3 | 0,5 | 78 | . | 87 | . | 91 | 81 | |
| Mini Pig | 95,9 | 93,2 | 26,9 | 6.4 | 3.5 | 49 | 52 | 82 | 92 | . | . | |
| * Opnået ved enzymatisk dissociation og gatedBaseret på FSC & SSC parametre (fra Lima et al. 2016 med tilladelse) | ||||||||||||
Tabel 1: Statistik for Ho-FACS af mandlige kimcellesuspensioner opnået ved mekanisk dissociation.
Supplerende Figur 1: Encellesuspensioner opnået ved mekanisk dissociation af frosset testikelvæv. Mekanisk dissociation muliggør dannelsen af enkeltcellesuspensioner fra testikelvæv af forskellige pattedyrsarter uden behov for artsspecifikke protokoller. Forskellige paneler viser cellesuspensionerne opnået for 4 pattedyrsarter. Prøver blev opnået ved mekanisk dissociation af frosset testikelvæv og farvet med Hoechst. SPG: Spermatogonia; SPC I: Primær spermatocyt; SPC II: Sekundær spermatocyt; SPD: Spermatid; SPZ: Spermatozoa. Slides blev visualiseret i en confoca L mikroskop med (nederste panel) eller uden (øverste panel) hvid lystransmission. Skalestænger = 20 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Figur 2: Gatingstrategi for adskillelse af levende hanlige kønsceller ved Ho-FACS af muse-testikulære enkeltcellesuspensioner. Levende celler (PI negative) er sorteret efter Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) er identificeret ved at tegne direkte Hoechst-blå og rød fluorescensintensiteter. En DNA-indholdsport bruges til at sortere celler baseret på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) og tetraploid (4C). Celler i hver top af histogrammet sorteres derefter ved at udforme funktionen af Hoechst blå og rød fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundære spermatocytter; SPC I: Primære spermatocytter.D / 55913 / Supp_fig.2.tif "> Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Figur 3: Gatingstrategi for adskillelse af levende hanlige kønsceller af Ho-FACS af hundtestikulære enkeltcellesuspensioner. Levende celler (PI negative) er sorteret efter Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) er identificeret ved at tegne direkte Hoechst-blå og rød fluorescensintensiteter. En DNA-indholdsport bruges til at sortere celler baseret på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) og tetraploid (4C). Celler i hver top af histogrammet sorteres derefter ved at udforme funktionen af Hoechst blå og rød fluorescens. Spidsen indeholdende haploide celler kan opdeles i overensstemmelse med omfanget af Hoechst blå intensitet og repræsenterer to subpopulationer af spermatider: forlængende spermatider (gate C ') og runde spermatider (gate C' '). SPG: Spermatogonia; ESPD: forlængende spermatider RSPD: runde spermatider; SPC II:Sekundære spermatocytter; SPC I: Primære spermatocytter. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Figur 4: Gatingstrategi for adskillelse af levende hanlige kønsceller af Ho-FACS af suspensioner fra marsvin-testikel-enkeltceller. Levende celler (PI negative) er sorteret efter Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) er identificeret ved at tegne direkte Hoechst-blå og rød fluorescensintensiteter. En DNA-indholdsport bruges til at sortere celler baseret på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) og tetraploid (4C). Celler i hver top af histogrammet sorteres derefter ved at udforme funktionen af Hoechst blå og rød fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundære spermatocytter; SPC I: Primære spermatocytter. Venligst klik her for at gøre detWnload denne fil.
Supplerende Figur 5: Gatingstrategi for adskillelse af levende hanlige kønsceller ved Ho-FACS af smågrise testikulære enkeltcelle suspensioner. Levende celler (PI negative) er sorteret efter Hoechst fluorescens. Spermatogonia (SPG) er identificeret ved at tegne direkte Hoechst-blå og rød fluorescensintensiteter. En DNA-indholdsport bruges til at sortere celler baseret på Hoechst blå fluorescens: haploid (C); Diploid (2C) og tetraploid (4C). Celler i hver top af histogrammet sorteres derefter ved at udforme funktionen af Hoechst blå og rød fluorescens. SPG: Spermatogonia; SPD: Spermatider; SPC II: Sekundære spermatocytter; SPC I: Primære spermatocytter. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Figur 6: Undersøgelse af somatisk celleforureningIon i Ho-FACS-sorterede populationer. T-distribueret stokastisk naboindlejring (t-SNE) -plot på ca. 600 enkeltcelle-transkriptom fra tre FACS-subpopulation-porte (AB). På t-SNE-plottet repræsenterer hvert punkt den unikke position af en enkelt celle i et transkriptomrum, og hver celle er mærket med sin FACS-subpopulation-gate oprindelse (A). Visuel kvantificering af celletypespecifikke markører på FACS single-cell t-SNE-plot (B). Forurening fra somatiske celler anslås at være mindre end 5% og er ikke specifik for en Ho-FACS population gate. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I betragtning af den stærkt konserverede chromatindynamik under spermatogenese hos pattedyr var målet med dette arbejde at udvikle en protokol til isolering af mandlige kønsceller i forskellige stadier af differentiering fra forskellige pattedyrs testikelvæv ( figur 1 ). En af de største hindringer i anvendelsen af en enkelt arbejdsgang til forskellige dyremodeller er behovet for arterespecifikke tilpasninger, især med hensyn til vævsdissociationprotokoller. Nuværende metoder er mest afhængige af enzymatisk vævsfordøjelse og protokoller varierer ofte også inden for art 12 . For at overvinde dette problem viser protokollen beskrevet her anvendelsen af mekanisk vævsdissociation for at opnå enkeltcellesuspensioner fra testikelprøver af forskellige pattedyrsarter. Resultaterne viser, at mekanisk dissociation af frisk testikelvæv med dette system virker godt ( figur 2A -2B 20 . Det er vigtigt, at Hoechst-farvning ikke synes at påvirke kvaliteten af enkeltcellesuspensioner væsentligt. Selvom mere celleklump er synlig i farvede prøver ( Figur 2B ), kan behandling med DNase ( Figur 2D ) eller NDA 20 hjælpe med at forhindre dette problem. Tidligere rapporter tyder på, at mekanisk dissociation af testikelvæv er bedre end eller lige så effektivt som enzymatisk vævsfordøjelse 5 , 20 . I overensstemmelse hermed indikerer de foreliggende data, at mekanisk dissociation er en pålidelig metode til opnåelse af enkeltcellesuspensioner fra testikelvæv til Ho-FACS-behandling.
Inkubation med Hoechst er et afgørende skridt, da det påvirker det signal, der er detekteret under flowcytometri. Lange perioder med farvning giver bedre forskelsbehandling af kimcelle typer, menKan være toksisk, hvilket resulterer i celledød og ændringer i intracellulær programmering 22 . Brugere, der har til hensigt at oprette kimcellekulturer med denne metode, bør evaluere den genotoksiske virkning af langtidseksponering for Hoechst 3 , 22 og bestemme tilstrækkelig koncentration og tid for farvning. Her var 30 min farvning tilstrækkelig til at tilvejebringe pålidelig adskillelse af kimcellepopulationer ( Figur 3B -3C ). Varigheden af farvning kan potentielt reduceres til 10 minutter, som vist af Rodriguez-Casuriaga, et al. 20 , og bør evalueres yderligere af brugerne for de pågældende arter.
Som hypoteser kan fire bakteriepopulationer konstant påvises - SPG, SPC I, SPC II og SPD - baseret på chromatinvariationer af kimceller fra de forskellige arter testet ( Figur 3B -3C tabel 1 ) og understøtter gatingstrategien vedtaget i denne arbejdsproces ( figur 1 ) for forskellige pattedyrsarter ( supplerende figurer 2- 5 ). Det er dog tilrådeligt, at brugerne optimerer gaten i henhold til de arter og populationer af interesse for at reducere den krydskontaminering, der opdages for nogle af befolkningerne (tabel 1). Dette kan opnås ved længere inkubationsperioder under farvning18 , reduceret strømningshastighed 2 og reducerede portstørrelser. SPG er mere udfordrende at isolere, da de er den sjældneste celletype i testiklerne og også på grund af farvestof udstrømning over tid 1 , 15 . Selvom det er muligt at detektere forskellige SPG-populationer af Ho-FACS, som vist her, ville undersøgelser, der udelukkende fokuserer på stamcellebiologi, drage fordel af en strengere teknik, såsom magnetisk aktiveret cellesortering (MACS; 23 ). Navnlig kan subpopulationer af SPD (eSPD og rSPD) klart skelnes mellem hunden og ikke for andre arter ( figur 3C og supplerende figur 3). Potentielt kan disse underpopulationer løses ved at justere gatingindstillingerne, som beskrevet af forfatterne til musen 5 . Cytogrammer, der genereres for cellestørrelse og granularitet (FSC VS SSC), forud for udformning af funktionen af Hoechst blå / rød fluorescerendeNce, diskriminerer forlængelse (lav FSC + SSC), fra runde (høj FSC + SSC) spermatid subpopulationer. Separation af runde og langstrakte spermatide subpopulationer vil muliggøre en mere dybtgående undersøgelse af spermiogenese, hvilket giver ny indsigt i specifikke molekylære begivenheder, der forekommer under sæddifferentiering. Som beskrevet for musen 1 , 2 , 12 er det også muligt at opnå yderligere opløsning af meiotiske trin ved at justere FACS-porte. En sådan tilgang ville i høj grad være til gavn for komparative undersøgelser af meiotiske begivenheder. Selvom celleintegriteten forstyrres under Ho-FACS, opnås enkeltcelle-RNA-sekventeringsdata opnået for celler sorteret med denne metode (Jung et al. , Ikke- offentliggjort , Supplerende Figur 6 ), at dette er en pålidelig tilgang til opnåelse af celler til molekylære studier af kimcelle biologi. Ikke desto mindre vil brugerne udføre reproduktive analyser, såsom rOsmespermatid injektion (ROSI), ved anvendelse af celler isoleret af Ho-FACS skal vurderes levedygtigheden af sorterede celler og vil måske udforske alternative metoder 24 , 25 .
Sammenfattende beskriver dette værk en standardiseret metode til at isolere testikelkimceller fra forskellige pattedyr, bygge og tilføje forbedringer på tidligere etablerede teknikker 2 , 12 , 20 . En sådan standardisering tillader anvendelse af et sæt reagenser og en enkelt arbejdsgang på forskellige pattedyrarter, hvilket letter datagenerering til sammenlignende undersøgelser af kimcellebiologi. Også mekanisk vævsdissociation overvinder forhindringen af artsspecifikke tilpasninger, som kan indføre metodisk variabilitet, hvilket næsten ikke er muligt at redegøre for. Desuden begrænser den reducerede eksekveringstid og manipulation forstyrrelser af ex vivo- celleLular fysiologi til et minimum. I denne henseende er Ho-FACS signifikant hurtigere sammenlignet med andre metoder til kimcelleisolation, såsom STA-PUT og elutriation 6 , 7 . Desuden er samtidig adskillelse af 4 kimpopulationer i det samme eksperiment kun mulig af FACS. I betragtning af egenskaberne af Hoechst-farvestoffet bevares cellestruktur og RNA-arter, og derfor kan celler anvendes til yderligere nedstrøms molekylære undersøgelser. Eftersom Ho-FACS er afhængig af kromatinattributter for at diskriminere kimcelletyper, er det vigtigt, at den succesfulde udførelse af denne arbejdsgang i 5 forskellige arter støtter stærkt dets anvendelse til andre pattedyr. De her præsenterede resultater tyder på, at spermatogenese kan være en unik proces med celledifferentiering, der kunne tackles i mange pattedyrarter ved anvendelse af en enkelt protokol. Som sådan, i teknologien "omics" og systembiologi, giver denne teknologi midler til en evolutionær appRoach på spørgsmål om mannlig kimcellebiologi, herunder undersøgelser af epigenetik, regulering og proteindiversitet gennem spermatogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) til hunde testikler; Jason Arand og Dr. Ted Cicero's lab ved Washington University i St. Louis (WashU) for at give rotte testikler og Brianne Tabers for at hjælpe med samlingen; Jared Hartsock og Dr. Salt's Lab at WashU til marsvin testes; Og Dr. Michael Talcott ved Division of Comparative Medicine på WashU til miniature gris testis. Forfatterne anerkender også Alvin J. Siteman Cancer Center ved Washington University School of Medicine og Barnes-Jewish Hospital i St. Louis, MO, til brug for Siteman Flow Cytometry Core, som leverede personaleopereret cellesorteringstjeneste. Siteman Cancer Center støttes delvist af NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Denne forskning blev finansieret af et FCT-stipendium [SFRH / BD / 51695/2011 til ACL], tilskud fra De Forenede Nationers National Institutes of Health [R01HD078641 og R01MH101810 til DFC] og en FCT-forskningskontrakt [IF / 01262/2014 til AML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS collection |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40 µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15 mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3 mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50 mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
